calf20合成温度

calf20合成温度

合成温度是指化学合成过程中所需的温度条件。在合成化学中，

温度是一个极为重要的参数，它可以影响反应速度、产物选择性和产

品质量等多个方面。不同的合成反应需要不同的合成温度，因此合成

温度的选择是非常关键的。

在化学合成中，合成温度通常是根据反应的热力学和动力学要求

来确定的。热力学是指反应是否可逆，而动力学则关注反应速率。在

合成反应中，反应热力学和动力学的平衡是非常重要的，只有达到适

当的温度条件，反应才能进行并且获得理想的产物。

合成温度可以分为低温合成、室温合成和高温合成三个范围。

低温合成一般指在零下50℃到室温以下进行的反应。低温合成可

以用于控制反应速度，提高产物选择性，减少副反应和副产物的生成。低温条件还可以防止某些反应中产物的不稳定性或易降解性。此外，

低温还可以防止反应温度过高引起的剧烈反应，提高反应的安全性。

室温合成是指在室温下进行的反应，常见的室温合成条件一般在20℃到30℃之间。室温合成一般用于合成一些较为稳定的化合物，以

减少能源消耗和反应中的副产物生成。室温合成也常用于规模较大的

工业合成中，因为室温条件下的反应设备和控制相对简单，操作也相

对安全。

高温合成一般是指在室温以上进行的反应，温度范围为100℃到1000℃以上。高温合成常用于一些需要高能量激发或较高反应速率的

反应。高温条件下活化能较低，反应速率较快，有助于提高产物收率。高温合成也常用于合成一些高熔点物质或热稳定性较差的产物。

除了这三个基本范围之外，还有一些特殊的合成温度条件。例如

还原反应往往在较高的温度下进行，因为高温有利于还原剂提供电子

和反应物之间的碰撞。还有一些合成反应需要在特定温度下进行，以

控制反应物的活性和产物的稳定性。

综上所述，合成温度是化学合成中至关重要的一个因素。不同反

应需要合适的合成温度条件，以实现理想的产物选择性、反应速率和

产物质量。合成温度通常根据反应的热力学和动力学要求来确定，并

可分为低温合成、室温合成和高温合成三个范围。除此之外，还有一

些特殊的反应需要在特定温度下进行。合理选择合成温度有助于提高

合成效率和产品质量，同时保证反应的安全性。

动物细胞工程

细胞工程第一讲 一、概述 1、细胞工程（cell engineering ）定义 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、细胞工程的研究内容 （1）动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。 （2）细胞融合 改良性状，培育新品种 （3）染色体工程 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 （快速繁育和产物大量制备） （改良性状，培育新品种） （培育新品种，单倍体和多倍体） （获得人们需要的成体） （无性繁殖，改变性状） 克隆 转基因技术

主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦 （4）胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 （5）细胞遗传工程 克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 （1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 （2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 （1）萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试（20世纪初-30年代中期）德国植物生理学家Haberlandt在1902年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，

克隆载体

分子克隆质粒载体去磷酸化实验方法步骤 对单酶切后的产物去磷酸化是指5‘端的磷酸基团，（3’端是-OH）。 用CIAP去磷酸化，它能将5‘端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不 能形成闭合的环状结构。 单酶切的末端能够发生载体自连。 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，简称CIAP，中文名称为小牛肠碱性磷酸酶，是一种可以催化DNA、RNA、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸水解释放5′末端或3′末端磷酸基团的酶。Calf Intestinal Alkaline Phosphatase也可以脱去蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的磷酸基团。 经限制性内切酶酶切的质粒5'端带有磷酸基团，在进行基因克隆时为避免质粒发生自连，可以使用Calf Intestinal Alkaline Phosphatase去除5'末端磷酸基团。脱去5′末端磷酸基团的质粒不能发生自连。 用途：去除DNA、RNA 5′或3′末端的磷酸基团；通过去除载体或DNA片断5′末端的磷酸基团，防止载体或DNA片断自连；通过5′末端脱磷，为5′末端磷酸化放射性标记准备模板；用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。 载体单酶切过夜，然后65度失活，直接加CIAP去磷酸化后，建议用酚、氯仿抽提或者用胶回收后做连接，因为CIAP去磷酸化酶在螯合剂存在下，经65度30分钟加热处理，99%的活性不可逆失活（根据反应条件不同有时也有外），用胶回收可以除去酶蛋白。最好做个对照，检验你的去磷酸化是否成功。 -------------------------------------------------------------------------------- 前些天才做完载体单酶切连接，现将自己的经验介绍如下： 1. 载体单酶切三个小时足以，时间长并不一定好。 2. 如果不需要连接效率的话，可以不用去磷酸化，但载体单酶切纯化后最好马上与你新制备的具相同粘末端的目的片段进行连接反应，也就是说一定要保 持单酶切后的载体与目的片段的“新鲜”。 3. 载体和目的片段单酶切后建议直接用柱纯化，我用的promega的柱，回 收率很高。我的目的片段2KB，载体13KB。 4. 连接反应目的片段与载体的摩尔比要高，最好10-20:1，因为单酶切后的载体与目的片段具有相同的粘末端容易出现自连，过量的目的段可以促进两者的 反应，有利于出现重组子。 5. 我的单酶切的载体没有去磷酸化，单酶切目的片段也没有磷酸化，4度 24小时连接，挑24个单菌落有3个重组子。 分子克隆载 通常在基因工程中选作载体的有： ①质粒——环状双链小型DNA 分子，种类甚多，有的可在细菌细胞内独立复制，有的亦可用于动、植物细胞。例如：根瘤土壤杆菌所携带的Ti 质粒常用作植物细胞基因工程的载体。人工改造的质粒常用的有pBR322天然质粒，派生

大工生化实验报告

小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量 摘要本实验从新鲜且冷冻保存的小牛肠出发,通过刮取、离心分离、析出、提纯等方式提取 小牛肠中碱性磷酸酶，利用紫外分光光度法测定该酶的活性，并利用考马斯亮蓝法测定所提 取的蛋白质含量，最后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对比marker谱带近似得出蛋白样品中 蛋白质的相对分子量。 关键词碱性磷酸酶；分离纯化；酶活；紫外分光光度法；考马斯亮蓝；蛋白质；聚丙烯 酰胺凝胶；蛋白质分子量。 前言 碱性磷酸酶能催化核酸分子脱掉5’-磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转 换成5’-OH末端。主要应用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等 的检查。 本实验以小牛肠为原料，分离纯化小牛肠碱性磷酸酶并研究酶活。小牛肠碱性磷酸酶的 分子量为145000，等电点为5.7.碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠，使之水解 释放出对硝基苯酚，后者在405nm光波长下有最大吸收。通过测定吸光值的变化率，可测 定酚的生成量，从而计算出酶的活性单位。 应用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，是一 种常用的蛋白质快速微量测定法。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色， 当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为465nm，后者为595nm。在一定蛋白 浓度范围内（0.01～1.0mg/ml）,蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量 成正比，故可用于蛋白质的定量分析。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白酶分子质量，根据标准样品在电泳中所做出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。1 实验部分 1.1 试剂与仪器 1.1.1试剂 （1）正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存）； （2）1 mol/L 醋酸（HAc），1 mol/L NaOH，硫酸铵； （3）平衡缓冲液：0.01 mol/L Tris-HCl，pH=8.0； （4）底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液,pH=9.8； （5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液（已 加入到底物缓冲液中）； （6）30% 丙烯酰胺（acrylamide，Acr）置棕色瓶； （7）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH=8.8，已加入10% SDS； （8）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH=6.8，已加入10% SDS；

TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶 科技名词定义 中文名称：TaqDNA聚合酶 英文名称：Taq DNA polymerase 定义：编号：EC 2.7.7.7。存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可 在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延 伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶 活性，缺少3′→5′的外切酶活性。 目录 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真细菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时 每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影 响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min 和5～6min后，仍可保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性，其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高. 催化活性

calf20合成温度

calf20合成温度 合成温度是指化学合成过程中所需的温度条件。在合成化学中， 温度是一个极为重要的参数，它可以影响反应速度、产物选择性和产 品质量等多个方面。不同的合成反应需要不同的合成温度，因此合成 温度的选择是非常关键的。 在化学合成中，合成温度通常是根据反应的热力学和动力学要求 来确定的。热力学是指反应是否可逆，而动力学则关注反应速率。在 合成反应中，反应热力学和动力学的平衡是非常重要的，只有达到适 当的温度条件，反应才能进行并且获得理想的产物。 合成温度可以分为低温合成、室温合成和高温合成三个范围。 低温合成一般指在零下50℃到室温以下进行的反应。低温合成可 以用于控制反应速度，提高产物选择性，减少副反应和副产物的生成。低温条件还可以防止某些反应中产物的不稳定性或易降解性。此外， 低温还可以防止反应温度过高引起的剧烈反应，提高反应的安全性。 室温合成是指在室温下进行的反应，常见的室温合成条件一般在20℃到30℃之间。室温合成一般用于合成一些较为稳定的化合物，以

减少能源消耗和反应中的副产物生成。室温合成也常用于规模较大的 工业合成中，因为室温条件下的反应设备和控制相对简单，操作也相 对安全。 高温合成一般是指在室温以上进行的反应，温度范围为100℃到1000℃以上。高温合成常用于一些需要高能量激发或较高反应速率的 反应。高温条件下活化能较低，反应速率较快，有助于提高产物收率。高温合成也常用于合成一些高熔点物质或热稳定性较差的产物。 除了这三个基本范围之外，还有一些特殊的合成温度条件。例如 还原反应往往在较高的温度下进行，因为高温有利于还原剂提供电子 和反应物之间的碰撞。还有一些合成反应需要在特定温度下进行，以 控制反应物的活性和产物的稳定性。 综上所述，合成温度是化学合成中至关重要的一个因素。不同反 应需要合适的合成温度条件，以实现理想的产物选择性、反应速率和 产物质量。合成温度通常根据反应的热力学和动力学要求来确定，并 可分为低温合成、室温合成和高温合成三个范围。除此之外，还有一 些特殊的反应需要在特定温度下进行。合理选择合成温度有助于提高 合成效率和产品质量，同时保证反应的安全性。

天门冬氨酸氨基转移酶

天门冬氨酸氨基转移酶 该酶在心肌细胞中含量较高，所以当心肌细胞受到损伤时，大量的酶释放人血，使血清含量增加，因此血清天门冬氨酸氨基转移酶一般用于心脏疾病的诊断。 [别名]谷草转氨酶、心肌酶 [英文缩写]GOT AST SGOT [参考值]<40U／L [临床意义]病理性升高： (1)心肌梗塞发病6～12小时显著升高，增高的程度可反映损害的程度，并在发作后48小时达到最高值，约3～5天恢复正常； (2)各种肝病AST可增高，肝病早期和慢性肝炎增高不明显，AST／ALT比值小于1。严重肝病和肝病后期增高，AST／ALT比值大于1； (3)其他疾病如心肌炎、肾炎及肺炎等AST也轻度升高。

名称：血清丙氨酸氨基转移酶（转氨酶） 英文名称：Alanine aminotransferase(ALT) 一种参与人体蛋白质新陈代谢的酶（相当于工业生产中的催化剂），起加快体内蛋白质氨基酸在体内转化的作用，它广泛存在于人体各种组织.器官.肌肉.骨骼中，以肝脏细胞的线粒体中最多，血清中ALT的正常含量参考值是：男9---51U/L，女8---41U/L（各医院的测试方法不同，参考值不完全相同）。当人体内各组织器官活动或病变时，就会把其中的ALT释放到血液中，使血清ALT含量增加。例如，肝脏发炎时，转氨酶就会从肝细胞释放到血液中，肝脏有病，血清转氨酶一定增高，当肝细胞千分之一有炎症时，血清转氨酶含量就会增高一倍以上，因此，血清转氨酶数量是肝脏病变程度的重要指标。 增高的原因 1．肝胆疾病，急性传染性肝炎，中毒性肝炎，肝癌，脂肪肝，胆管炎、胆囊炎等均可增高。肝硬变同时有活动性肝损害时，ALT有不同程度的升高。 2．重症肝炎，急性肝坏死，先是ALT升高，可达2000～5000U／L。症状恶化时，黄疸不断加重而ALT急剧下降，称为胆-酶分离现象，说明有大片肝细胞坏死，提示预后凶险。 3，心血管疾病，心肌梗死，心肌炎，充血性心力衰竭伴肝肿大患者可见增高。 4．骨骼疾病，多发性肌炎，肌营养不良等也可有ALT增高。 5．药物如氯丙嗪，异烟肼，奎宁，水杨酸制剂，酒精，铅，汞，四氯化碳，有机磷和抗癌药物等可引起肝细胞损伤，ALT增高。AST／ALT：AST与ALT的比值对肝病诊断有一定意义。 与AST共同判断病情 同时测定AST、ALT可帮助鉴别诊断和了解病情变化。 1．急性病毒性肝炎AST／ALT＜1。 2．肝硬化、肝癌、重症肝炎、肝坏死时AST／ALT＞1。 3．原发性肝癌时AST／ALT＞3。 治疗ALT增高的药物 五味子 垂盆草 降酶灵 甘利欣 联苯双脂

细胞常见问题

细胞常见问题 1.血清中可能出现的沉淀物是什么？ 基于多年的实验研究，用于细胞培养的胎牛血清以及其它血清中可能会存在以下种类的沉淀物：：（1）纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到1-2mm，可以用肉眼观察到。因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（可溶性的形成絮状纤维蛋白的前体）在处理过程中仍然处于溶解状态，当经过最后的过滤分装后，就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。（2）磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。（3）胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。他们也是血清中出现沉淀物的常见原因。 2.血清中的沉淀物对细胞培养有什么影响？ （1）细胞生长，我们的试验以及经验表明沉淀物不会影响细胞培养，我们的客户以及其它血清生产商也证明了这一点。（2）过滤，如果血清中出现大量的沉淀物，血清将很难过滤。一般说来，因为在血清生产时最后已经经过100nm或者40nm的过滤处理，并且经过了严格的无菌检测，因此不推荐再过滤用于细胞培养的血清。在实验室中没有必要再过滤处理血清，在大规模的细胞培养中往往将血清直接加到培养基中一起过滤。（3）污染，磷酸钙往往被误认为微生物污染而引起争端。研究者可能会在血清中观察到一些絮状的沉淀，因此就会比较警觉的去做无菌试验，将血清放在培养箱中培养几天，结果可能会观察到更多的絮状沉淀，因此就断定血清被污染了。并且当研究者将血清样品放在倒置显微镜下观察时往往可以看到一些可以运动的小黑点，因此就更加确认是血清被污染了。于是，研究者就会花费更多的时间和精力来和生产商确认，但最终确定血清没有被污染而只是沉淀。为了避免这些问题的发生，我们建议不要直接将血清放在培养箱中培养观察是否有菌，而是将血清加到琼脂板上进行培养以观察是否

TC20钛合金生物摩擦学性能研究

TC20钛合金生物摩擦学性能研究 宋敏;王树军;张晓佳 【摘要】Reciprocating friction test and electrochemical corrosion test of TC20(Ti6Al7Nb) titanium alloy were carried out to evaluate the applicability and reliability of TC20 titanium alloy as a new type artificial joint replacement material in this paper. The results show that the friction coefficient of TC20 titanium alloy in the dry friction condition takes the longest time to reach stability, and the influence of applied load on the stable friction coefficient in this condition is the highest. The friction coefficient in calf serum solution under different normal loads is the smallest, which fluctuates around 0. 33 when it reaches stability. The wear under dry friction is the most dramatic, and the wear scar is mainly the furrow morphology, the main mechanism of wear is adhesive wear and abrasive wear. The mechanism of wear in solutions is mainly adhesive wear, and the wear in saline solution under the same loading condition is more intense. In addition, the initial corrosion resistance of TC20 titanium alloy in the two solutions are similar, and there is an oxide film formed on the surface of TC20 titanium alloy in normal saline, which can effectively protect the matrix.%通过往复摩擦试验与电化学腐蚀试验，对新型人工关节替代材料TC20钛合金的相关性能展开研究，合理评价其作为关节替代材料的适用性及可靠性。研究结果表明， TC20钛合金在干摩擦条件下摩擦系数达到稳定的时间最长，且稳定后摩擦系数受外加载荷的影响最大；在小牛血清溶液中的摩擦系数最小，稳定后保持在0．33左右波动；干摩擦条件下的磨损最为剧烈，磨痕主要以犁沟

细胞培养常见问题的原因及对策

细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。 9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

乳腺癌细胞培养

MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，参加％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除剩余的培养基。再参加2ml胰酶〔25ml 培养瓶〕静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出参加培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中别离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞根底培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37℃ 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min 传代的比例：1：2~1：4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度：1-2 ×10 6/管，液氮保存 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37℃水浴中，震荡解冻2min，酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，参加5ml37℃预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心〔1000rpm，5min〕，弃去上清液，再参加2ml培养基，转入培养瓶中培养。 产品名称：人正常乳腺细胞 Hs 578Bst 规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点：细胞代数为4-5代左右 包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书 细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC

酵母双杂交操作手册 by shenao

酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料: PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187 pGBKT7 DNA-BD Vector (bait) pGADT7 AD Vector (prey) pGBKT7-53 Control Vector pGBKT7-Lam Control Vector pGADT7-T Control Vector pCL1 Control Vector 3' DNA-BD & AD Sequencing Primers Herring testes carrier DNA Yeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a- gal( Yeast Phenotypes –––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the –or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow. +His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.

乳脂球膜蛋白的研究进展

乳脂球膜蛋白的研究进展 高三思;沈泰钰;于洪江;朱奎玲;张子扬;黄宝银;徐闯;夏成 【摘要】乳脂球膜蛋白是乳腺在泌乳时包被在脂肪滴外的膜蛋白。乳脂肪球膜(milk fat globule membrane,MF-GM)是磷脂、鞘脂和多种蛋白质组成的3层膜结构。乳脂球膜蛋白包含100余种蛋白质,含量最丰富的8种蛋白质为黏液素1、黄嘌呤氧化还原酶、黏液素15、CD36、嗜乳脂蛋白、乳凝集素、脂肪分化相关蛋白和脂肪酸结合蛋白。乳脂球膜蛋白已被证明具有丰富的开发利用价值,包括：反映奶牛母体的生理状态；作为幼体的营养和免疫来源,会影响犊牛的发育和母源抗体；会影响人和动物的免疫调节和体质,未来可能应用于疾病的治疗。作者介绍了乳脂球膜蛋白的来源、组成及一种新建立的乳脂球膜蛋白结构,阐述了几个主要蛋白的生理特性及乳脂球膜蛋白的研究进展,并对未来的研究方向提出建 议。%Milk fat globule membrane protein is packaged outside the fat granule during mammary gland https://www.wendangku.net/doc/b619113692.html,k fat globule membrane has three-layered structure composed of phospholip-ids,sphingolipids and https://www.wendangku.net/doc/b619113692.html,k fat globule membrane protein contains more than one hun-dred kinds of proteins,of which there are the most abundant of eight kinds of proteins including mucin 1,xanthine oxidoreductase,mucin 15,CD36,butyrophilin,lactadherin,adipophilin,fatty acid binding protein .Milk fat globule membrane protein has been shown to have special value which reflects the physiological state of cow,affects the growth of calf and maternal immune as a source of nutrition and immunity for calves,and affects the human and animal’s immunity reg ulation and physical fitness,it may be applied to treat diseases in the future.This article

液氮保存对人主动脉瓣组织细胞活力的影响

液氮保存对人主动脉瓣组织细胞活力的影响【关键词】氮 关键词 :氮;低温保藏;主动脉瓣;细胞存活;细胞增殖能力;组织培养 摘要:目的主要观察液氮（-196℃）保存1～24mo不同时间段的瓣膜组织细胞活力及组织培养细胞生长情况的变化，为临床适用的人同种主动脉瓣的适宜保存期限提供实验依据. 方法选取（18～35）岁健康成年男性脑死亡30min内取材的主动脉瓣膜20个.依据保存时间分为10组，Ⅰ组为新鲜对照组，取材后直接供实验用，Ⅱ～Ⅹ组为冷冻保存组，分别为冷冻保存1，3，6，9，12，15，18，21，24mo 的瓣膜，每组2个瓣膜共6个瓣叶.冷冻保存组各组瓣膜缓慢降温（1℃・min-1 ），液氮中保存，实验时进行快速复温.瓣叶剪为细小组织块，一半置入培养瓶中做组织培养，相差显微镜下观察其组织细胞生长情况;另一半组织块用胰酶消化，光镜下做细胞计数并计算其细胞活力. 结果Ⅰ组的组织细胞活力最高（93.8%），Ⅱ～Ⅹ组细胞活力均较Ⅰ组明显减低（67.3%vs93.8%P<0.05）;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ组细胞活力较Ⅱ～Ⅶ组瓣膜各组明显减低（52.4%vs76.5%P<0.05）.Ⅰ组组织细胞1wk镜下可见，生长较快，4wk时镜下细胞数较多;Ⅱ～Ⅶ组组织细胞2wk镜下可见，生长较Ⅰ组稍缓慢，4wk时镜下细胞数减少;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ组细胞3wk镜下可见，生长较慢，4wk时镜下细胞数较Ⅰ组明显减少. 结论液氮保存对人同种瓣膜组织细胞活力有显著影响，其程

度随保存时间增长而加重;液氮保存1～15mo瓣膜组织细胞生长较新鲜瓣膜组稍晚，但组织细胞活力仍较高;液氮保存18～24mo瓣膜组织细胞活力明显减低，组织细胞生长缓慢，因此瓣膜组织活性及瓣膜耐久性可能减低.据此可认为，人同种主动脉瓣的适宜保存期限为15mo 以内. Keywords:nitrogen;cryopreservation;aortic valve;cell sur-vival;cell proliferative capacity;tissue culture Abstract:AIM To observe the cellular viability and cell proliferative capacity of human aortic valves cryopreserved in liquid nitrogen at-196℃.METHODS Twenty valves，procured from18to35years old healthy adult hearts within30min after the determination of brain death，were divided into10groups.Group Ⅰ，the control group，is of fresh valves.Valves from Group Ⅱto GroupⅩwere those pre-served in liquid nitrogen for1，3，6，9，12，15，18，21，24mo respectively.The fresh valves were examined immediately after procurement.All the cryopreserved valves were thawed in37℃saline pool.Each specimen was cut into pieces of1mm×1mm×1mm.Half of the tissues were reduced with2.5g・L-1 trypsin and dyed with trypan blue，then the num-ber of viable and nonviable cells were counted.The remaining

尼龙材质证明书

尼龙材质证明书 尼龙材质证明书 篇一：尼龙1010塑料盖工艺设计及注塑模具设计说明书 目录 目录 1 1.2 注射机型号的选定及校核 2 1.2.1 注射量的计算 . 2 1.2.3 选择注射机 .. 4 2.1 主流道的设计 4 2.1.3 分流道的设计 . 5 2.1.5 排溢系统的设计 . 7 3.1.1 凹模直径 11 4.1 浇注系统凝料的脱出 . 12 5 模架的设计 13 5.1 模架的设计和对其的校核 .. 14 5.1.6 垫块的设计和校核 .. 14 5.1.7 动模座板的设计 . 15 6.1 推出机构和复位机构的设计 18 7.1.6 冷却管道的总传热面积 (20) 1 工艺性能分析和结构方案的确定和所需设备的校核 1.1 工艺性能分析和模具方案的确定 1.1.1 工艺性能分析 图1.1 零件图 形状：如图所示，该制件为塑料盖，外形尺寸直径为Φ59mm，壁厚

为3mm，高为12mm，形状为圆形壳体。 性能：所设计塑件材料为尼龙1010，聚酰胺类塑料在分子结构中含有亲水的聚酰基，是一种吸湿性材料，，化学稳定性较好，机械强度较好。吸水性较小，平均吸水率为0.8%—1.0%。为了顺利的成型，事先必须进行干燥，促使水分降至0.3%以下，干燥是最好用真空干燥。 表1.1 干燥参数 真空度 1333Pa 烘箱温度 90—110℃ 料层厚度 25mm以下干燥时间 8—12h 水分含量 0.1%—0.3% 1.1.2 确定模具结构方案 成型方式的确定 由于聚酰胺为结晶性塑料，流动性好，成型收缩率较大，所以采用注射成型。 确定分型面 考虑到塑件的形状、大小和PA的流动性，采用矩形侧浇口，其优点是截面形状简单、易于加工、便于试模后修正，并采用单分型面，瓣合内抽结构。 图1.2 分型面示意图 确定型腔数目 估算塑件的质量： 取ρ=1.045g/cm3，那么mn=ρ??1.045?1.1272?11.78g v：由三维造型软件确定塑件体积为11272mm3 考虑到塑件的尺寸较小，在此采用一模两腔。 1.2 注射机型号的选定及校核 1.2.1 注射量的计算 通过计算可知，塑件质量mn=11.78g，流道凝料的质量m2=0.5mn，上述确定为一模两腔，所以注射量m=2×mn=3×11.78=35.34g。

细胞培养技术常见问题解答

细胞培养技术常见问题解答 细胞培养基础问答 1. BHK细胞就是指BHK21吗？ 答：BHK细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞（Baby Hamster Syrian Kidney），1961年建株。原始的细 胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性。1963年获得单细胞克隆细胞。后经无数次传代后细胞可悬浮生长，它广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。 最常用的是BHK21的一个亚克隆细胞，即克隆13或C13 。 2. 二倍体细胞有什么特点？ 答：二倍体细胞的染色体组型是2n核型；贴壁依赖接触抑制；一般可传代培养50代；无致瘤性。 如W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。3. 什么是动物细胞大规模培养？ 答：所谓动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology）是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、CHO（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，细胞培养技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器（Bioreactor）进行大规模细胞培养。 4. 细胞体内外培养的差别是什么？ 答：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或

细胞生物学实验操作指南

细胞生物学实验操作指南 目录 1．洗涤与灭菌 1.1细胞培养瓶 1.2小烧杯、吹管 1.3盐水瓶 1.4瓶盖、胶塞 1.5塑料器皿 1.6附注：洗液配方（次强酸液） 2．配置常用溶液 2.1 平衡盐溶液 2.2 pH调整液 2.3 抗生素液 2.3.1 青霉素+链霉素 2.3.2 两性霉素 2.3.3 G418 2.3.4 潮霉素 2.4 消化液 2.5 培养基 2.5.1 配置 2.5.2 使用 3．培养操作基本要求 无菌操作

一．洗涤与灭菌 在组织培养中，离体细胞对任何有害物质都十分敏感。有害物质包括微生物、细胞残余物以及非营养成分的化学物质。因此对新采用和重新使用的培养器皿，都要严格清洗。 1．细胞培养瓶： (1)浸泡： 初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉。新的玻璃器皿，玻面常带有许多干涸的灰尘，同时在生产过程中，玻璃表面常呈碱性并带有一些对细胞有毒的物质，如铅和砷等。新瓶使用前应先用自来水简单冲洗，然后用稀盐酸(5%)浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。培养后的玻璃器皿往往附有大量蛋白质，干涸后不易刷洗掉，故用后要立即浸入清水中；注意让水能完全进入瓶皿中，不应留有气泡。 (2)刷洗： 浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以除去器皿表面的附着较牢的杂质。刷洗次数太多，能损害器皿表面光泽度，所以应选用软毛刷和优质的洗涤剂（如高级洗衣粉或洗洁精），绝对不能使用含沙粒的去污粉！洗刷时特别注意洗刷瓶角部位。可以将洗涤剂倒入浸泡培养瓶的清水中，直接在水中进行刷洗，然后再以清水冲洗干净。 (3)泡酸： 刷洗不掉的极微量杂质经过硫酸和重铬酸钾洗液的强氧化作用后，可被除掉。洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污能力很强，是清洗过程中关键的一环。浸泡时，器皿要充满洗液，勿留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。注意，泡酸时要戴防酸手套，否则将损伤皮肤。 (4)冲洗： 泡酸后必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹。冲洗时每瓶都要用水灌满，倒掉。冲洗程序是先用自来水冲洗20遍，再用蒸馏水冲洗10遍，最后用双蒸水冲洗两遍。 (5)干烤： 以铝铂封好瓶口，放入烘烤罐中，160℃干烤2小时，完成干热灭菌方能使用。 返回目录 2．小烧杯、吹管： (1)浸泡： 初次使用和培养用后的小烧杯、吹管一样需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉。新的玻璃器皿，同培养瓶一样用盐酸浸泡。 (2)泡酸： 如果烧杯、吹管上附着有一些不易除去的杂质，可以在洗液中浸泡去处。（根据情况可省略这一步） (3)刷洗： 用毛刷沾洗涤剂刷洗烧杯壁，吹管内壁也可用极细的软毛刷刷洗。 (4)冲洗：

基因工程笔记总结

第二章 Enzymes 第四节 DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP（NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种 DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端； 2. 平末端； 3. 平末端加尾； 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法 （1）末端脱氧核苷酸转移酶功能：5’至 3’单链聚合 作用特点：单链；无模版作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。 缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA 连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 第五节 DNA聚合酶DNA Polymerase 常用的DNA聚合酶： 1、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ