流式细胞方法测定

流式细胞仪实验方法

一、实验准备

1．标本制备：

2．最小化非特异性结合：

二、凋亡

1．凋亡的检测方法：网站和其它

2．PI染色法

3．Annexin V 法

4．TUNNEL法

三、细胞因子

1．激活的细胞因子

2．CBA

四、血小板

1．活化

2．活化检测

3．网织血小板

五、红细胞

1．网织红细胞

2．PNH

3．胎儿红细胞

六、肿瘤学

1．DNA 细胞周期

2．蛋白

3．多药耐药

4．微小残留白血病

第一部分标本处理

一、流式细胞术常规检测时的样品制备

(一)直接免疫荧光标记法

取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法

取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法

1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。

3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。

通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。

4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。

5．其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。

第二部分细胞因子

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

一、简介

随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。

早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。

近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：

快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；

简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；

灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；

高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；

安全：减少样本处理与生物源性污染

接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。

二、所需仪器

1. 流式上样管及细胞培养皿或板

2. 25%CO2，37℃孵箱

3. 混匀振荡器

4. 离心机

5. 加样器、Tips

6. 流式细胞仪

三、常用的标本类型和处理方法

全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。

组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。

细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。

冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。

四、所需试剂

1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂

依据实验需要选择特殊表面标志

CD45圈定所有淋巴细胞

CD3 圈定T淋巴细胞

CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群

CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群

CD19/或CD20圈定B淋巴细胞

CD56圈定NK淋巴细胞

CD14圈定单核细胞

2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体

3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞

4、激活剂

①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）

A. D MSO中调节浓度0.1mg/mL

B. 分装(20 L)，－20℃储存。勿反复冻融

C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液

D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液

②Ionomycin （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）

A. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL

B. －20℃储存

C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液

D. Ionomycin终浓度1 g/mL细胞悬液

③Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)

A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL

B. 4℃储存

C. SEB终浓度10 g/mL细胞悬液

④CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞

⑤CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml

5、阻断剂

阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内

①Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506）

A. 于DMSO中调节浓度5mg/mL

B. 分装(20 L)，-20℃储存。勿反复冻融。

C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液

D. 激活最后4－5小时BFA终浓度10 g/mL细胞悬液。

注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降

②Monensin （eBioscience，目录号00-4505）

6、不含谷氨酰胺的RPMI-1640

7、固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）

8、破膜剂：含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合

9、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。

五、细胞培养和刺激的基本方法

细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。

表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法

为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂(如3uM monensin，10mg/ml的BFA)

方法1: 只使用转染细胞检测

方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.

方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.

方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时

方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days

方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1β (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)

方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激

方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.

方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时

方法10: CD4＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。

方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时

方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时

六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）

1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说

明书），混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时

2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色

①在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中

4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。

②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断

3、细胞表面染色

①加适当的细胞表面染色试剂20 L于Falcon管中，加入100 L激活后的全血(细胞浓度维持在2×

106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；

②加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）

③离心500g 5分钟，弃上清

4、固定和破膜

①加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；

②加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）

③加2 3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。

5、细胞内染色

①加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。

②加2 3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500 LPBS上机或加入500 L 1% PFA固定后

再上机

七、注意事项

1. 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐

用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2. 刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。

比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病

人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析

3. 选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：

①未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原

与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。

②激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，

则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。

③同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消

除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。

4. Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的

CD16/32（eBioscience, 目录号14-0161-81），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。

5. 荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子

时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ

八、问题与解答

Th1/Th2细胞研究方法

尽管目前提出了较多的Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发现，在外周血白细胞中，除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化，甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。

根据T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),介导细胞免疫应答；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促进抗体的产生，介导体液免疫反应。在多数免疫反应中，T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和相应的细胞因子，而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应，在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应。近几年来研究发现，Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程，如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等，而用流式细胞仪进行Th1/Th2的检测克服了传统方法所得结果为整个群体分泌数值不能区分单个细胞或亚群的反应的不足，通过表面染色多参数分析可以区分表达特定细胞因子的细胞亚群。一般用CD3+/CD4+ 或CD3+/CD8-作表面标记，选择相应的荧光标的抗体，Th1和Th2细胞分泌细胞因子的情况如下：

全血标本经过刺激培养、表面标记、固定、破膜、胞内

染色（IQ ，Cytodetect?kit(basic)，CAT 方法，IQP-367）后结果如下：

正常全血标本用流式细胞仪检测细胞因子的参考值

一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小时后，按照操作程序测得参考值如下：

第四部分流式细胞术分析血小板

流式细胞术分析血小板

血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。

一、流式细胞仪血小板分析应用范围

1.通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性。

2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的

获得性和遗传性缺陷。

3. 结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板。

4. 发现血小板抗体，做定性和定量分析。

二、血小板分析的临床意义

1. 血栓性疾病：活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性，非风湿

性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。

2. 血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺

陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍

3. 贮存池疾病：原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。

检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，而且一次检测的血小板数目有限。

全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法，一次能定量检测5 000个以上阿的

平染色的血小板。与正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。

4. 血小板减少性疾病：破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体（PAIg）是反

映血小板的破坏的指标，虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg，只要测定104甚至103个血小板，在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有关，全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样，检测分泌到循环中的“网织”血小板，来判断血小板的生成。“

5. 血小板储存与输注：用P-选择素(CD62)、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子标志物，发现血库中储存

血小板有时间依赖性的活化现象。储存5天以上，40%～60%血小板表达活化标志CD62。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及β-TG的释放也能反映其活化，但用CD62作为储存血小板的质量控制指标最理想。活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。

6. 抗血栓药物的监测：活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗，也可以监测这

些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生。

7. 此外，全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，测定严重血小

板减少患者的血小板数目。

三、流式细胞仪分析全血中血小板的优点

1.全血中血小板更接近生理状态。

2. 操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变(如血小板活化试验)。

3. 同时检测血小板的多个标志物，结合FSC和SSC，评估多个参数，进行定量分析。

4. 多采用血小板特异抗体CD41或CD61画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰。

5. 检测血小板亚群灵敏度高。

6. 用血量少。

7. 无放射性污染。

四、全血样本的制备

1．抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。

2．Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。

3．1%多聚甲醛固定样本。

4．上机检测

五、质控标本

1.阴性对照(Isotype Control)：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，

应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。

2. 血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质

控。

3. 血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。使用不

含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。

4. 血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板无力症血小板表

面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照。

六、数据分析－设门：

1.FSC-SSC点图中找出血小板，缺点是血小板较小，不易通过大小将碎片或杂质完全分开

2. 从CD41或CD61-SSC点图中画出血小板门，由于特异性高，可以有效地去除碎片和杂质的干扰。

流式细胞仪分析血小板的活化

血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。

一、使用流式分析方法检测血小板活化的优点是：

1.检测血小板的反应性。

2.了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗释放到血小板外。

3. 同时检测多种血小板表面标志。

4. 高度灵敏。

5. 直接检测血小板的多种标志。

6. 使用全血，标本量少。

7. 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。

二、全血中活化血小板的检测

1. 血小板特异性膜糖蛋白：血小板膜糖蛋白已被深入研究，下表显示了血小板膜上主要的糖蛋白

及其功能。在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限

的几种，根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板。

表1

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纤维蛋白原；Fn纤维粘连蛋白；

Vn体外粘连蛋；LRG富含亮氨酸家族

2. 活化血小板的标志物：活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些

变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物,这些标志物可分为三类：第一类是血小板颗粒膜

上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在

质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GP

Ⅱb/Ⅲa(CD41/61)的PAC1表位，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此，使用

这个表位的荧光单抗，我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。另外，GPIV (CD36)

虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高；GPIb-IX-V复合物(CD42)则相反，

与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。第三类是出现在活化血小板上能与血小板

表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血

小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。

3. 除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。

如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流，用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平

来检测活化血小板的释放功能等。

4. 单抗的选择：与血小板有关的CD单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61

（特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。CD61与CD41联

合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物），CD62，CD63 ，CD107a-b等，。活化血小板的检测

需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。

表2活化血小板CD单抗简介

三、操作步骤

1. 标本采集：

(1) 枸橼酸钠抗凝的真空采血管顺序编号。

(2) 抽取静脉血，采血管中注入2ml。

(3) 于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。

2. 血小板激活：

(1) 试管内加入50mlADP（也可选用其他激活剂，如PMA、纤维蛋白、TRAP），450μl全血，轻轻

摇匀。

(2) 室温孵育5分钟。

(3) 立即染色。

3. 荧光抗体染色：

(1) Falcon管编号。

(2) 在对照管中加入同型对照、CD61、PAC－1和RGDS（PAC－1的阻断剂）。

(3) 在试验管中加入CD62P、CD61和PAC－1。

(4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5μl。

(5) 轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟。

(6) 各管中加入1ml冷的固定液(2-8?C)，充分混匀，2-8?C阴暗处放置30分钟。

(7) 24小时内上机分析。

4. 结果分析：

在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。CD61 vs SSC 点图显示有三群，

CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成，CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小板的血细胞组成，CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的

碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此，不建议使用FSC-SSC图设门。在CD61 vs SSC点图中找出CD61 阳性的血小板群(单个血小板和黏附在WBC上

的血小板)，设门。

四、注意事项

1. 采血时请用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用。

2. 尽量避免标本受到物理振动。

3. 取血后10分钟内完成染色操作。

4. 在Falcon管中加血标本5 l，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果。

5. 为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量 控制 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在

流式细胞仪常用的几种检测方法

精品文档，放心下载，放心阅读 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档，超值下载 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。

流式细胞仪常用的几种检测方法

流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）

流式细胞仪试验方法

流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病

第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。 5．其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。

方法--流式细胞术检测细胞

2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期 2.2.2.5.1 实验原理 用流式细胞仪检测细胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染细胞核。PI在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。 2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤 收集对数生长期细胞，计数，以(1~5)×105/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日更换培养液，各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次。每个浓度设3个重复。 48 h后，中止培养，胰酶消化后，收集细胞于流式管1000 r/min离心5min，弃上，冷PBS洗涤细胞3次，离心去上清； 一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18 h以上；离心，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清； 加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震荡混匀。室温、避光反应30 min； 流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。 2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡 2.2.2.6.1实验原理 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV 是一种分子量为35～36 kD的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 2.2.2.6.2 结果判断 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI 有抗染性，坏死细胞则不能。 细胞膜有损伤的细胞的DNA 可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，

流式细胞术实验方法

流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。 9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。 胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：

流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 PBS溶液； PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 70%乙醇 400目筛网 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。 2. 3ml PBS洗涤1次。 3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。 4. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。 5. 400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。 6. 用1ml PI染液染色，4℃避光30min。 7. 流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。 8. 结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。 注意事项 细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

(完整word版)流式细胞术步骤.docx

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 (设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组，2μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L 辛伐他汀组 正常对照组 (NC 组)：胰岛素终浓度 0.058mg/L A 组：辛伐他汀终浓度2μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； B 组：辛伐他汀终浓度5μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； C 组：辛伐他汀终浓度10μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； 于 37℃， 5%CO2 培养箱中孵育 48h） 2. 胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3.800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。 4.用低速振荡器边震动边加入5 mL 预冷的 70%乙醇，固定， 4℃过夜。 5.次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃上清，加入 4 mL PBS 清洗一次，用 0.4 mL PBS 重悬细胞。 6. 加入 5 μL RNaseA（ 10 mg/ml ） 37℃消化 1 （propidium iodide PI ）4℃避光染色过夜（或者小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶37℃避光染色 1 小时），在 EPICS XL 流 式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3 . 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到 1.5 mL离心管中。 4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm ，小型离心机离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 3 次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS 中。

流式细胞检测方法

Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒使用（细菌） K：不加菲A：5000ug/L菲B: 500ug/L C: 500ug/L 1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600 2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。） 3、实验组（4组）：取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。 4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入10ul Annexin V-FITC单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。 7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。 8、Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。 9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 10、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过PI 通道（FL2 或FL3）检测，建议使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。 二醋酸酯荧光素（FDA）与碘化丙啶的流式细胞术 1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600 2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5ml PBS轻轻重悬 3、取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。 4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入200μl FDA，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入200ul FDA单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。 7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于 100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓

将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上

↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

流式细胞仪操作方法

一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

流式细胞术样品制备技术(完整)

流式细胞术样品制备技术 流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。 流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。 第1节样本单细胞悬液的制备方法 一新鲜实体组织样本的制备 FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。 （一）酶消化法 1 作用原理： 对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2 注意事项： ①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。 3 方法学程序 （1）将适合于酶消化的组织置于离心管中； （2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中； （3）一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打； （4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 点击次数：621 作者：佚名发表于：2008-07-24 15:51转载请注明来自丁香园 来源：51protocol 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆">）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆"克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有

FACSC精编ibur流式细胞仪操作维护规程

F A C S C精编i b u r流式 细胞仪操作维护规程 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

FACSCalibur流式细胞仪操作维护规程 1.目的 规范流式细胞仪FACSCalibur操作维护规程，正确使用和维护仪器，保证检测工作顺利进行和设备安全。 2.适用范围 适用流式细胞仪FACSCalibur的使用操作。 3.职责 操作人员按照本规程操作仪器，对仪器进行正常维护，并作使用记录。 保管人负责监督仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护和保养。 仪器管理人以及科室负责人负责仪器综合管理。 4.操作程序 安全操作注意事项和特别提示： 4.1.1该仪器必须有专人保管，使用前需通读仪器说明书。 4.1.2严格遵守操作规程，如仪器出现故障，应马上停止使用，并立即向保管人、仪器管理人以及科室负责人报告，严格按照单位有关制度实施，不得擅自“修理”，查明原因，处理后仪器保管人应及时做好故障情况及维修记录。 设备每日开机程序： 设备质控程序：

4.3.1.1取试剂盒中的Unlabeled试剂，充分混匀，加一滴到装有1ml鞘液的试管中，混匀，标记为unlabeled。 4.3.1.2取FITC、PE、PerCP、Unlabeled试剂，充分混匀，各加一滴到第二支装有3ml鞘液的试管中，混匀，标记为mixed。 上机操作： 4.3.2.1按电脑桌面的FacsComp进入质控程序。 4.3.2.2在出现的“Signin”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单击“Accept”。 4.3.2.3在试验选项中，选择Lyse/No-Wash(LNW)：免洗程序。 4.3.2.4在CalibriteBeadsLotIDs中,根据每种颜色的beads所对应的LotIds，输入编号，此编号在Calibritebeads试剂盒内，打开新买的试剂盒，里面有一张橙色胶纸，取出贴在试剂盒的背面，标题是Calibritebeads3BatchNO,选择FACSFlowSheath下的编号(右侧的编号)。APCLotID(此栏不能空，即使是三色校正试剂)。 4.3.2.5在右侧的保存选项中文件会自动保存,路径Facstation\BDfile\FACSComp\DDMMYY,还可以单击“Location”改变文件保存路径。 4.3.2.6按Run开始上样，在仪器面板上按RunHi。高速运行，速度不能低于400个细胞/秒，速度过低可在管中加一滴微球。

流式细胞仪试验方法2

第四部分流式细胞术分析血小板 流式细胞术分析血小板 血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。 一、流式细胞仪血小板分析应用范围 1.通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性。 2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的 获得性和遗传性缺陷。 3. 结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板。 4. 发现血小板抗体，做定性和定量分析。 二、血小板分析的临床意义 1. 血栓性疾病：活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性，非风湿 性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。 2. 血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺 陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍 3. 贮存池疾病：原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。 检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，而且一次检测的血小板数目有限。 全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法，一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。 4. 血小板减少性疾病：破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体（PAIg）是反 映血小板的破坏的指标，虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg，只要测定104甚至103个血小板，在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有