基因工程与克隆技术讲义答案复习进程

基因工程与克隆技术

讲义答案

基因工程与克隆技术

考点1 基因工程

1.(2015·浙江10月选考,节选)答案:限制性核酸内切酶

2.(2016·浙江4月选考,节选)

答案:(1)逆转录重组DNA分子农杆菌 B (2)摇床维持渗透压

3.(2018·浙江4月选考,节选)回答与基因工程和植物克隆有关的

问题:

(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切,在切口处形

成。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形

成,获得重组质粒。

(2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的

是 ,

从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。

解析:(1)EcoRⅠ酶切目的基因和载体,在切口处形成粘性末端;DNA连接酶使具有相同粘性末端的两个片段形成磷酸二酯键,能获得重组

质粒。

(2)目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。经转化的农杆菌,在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,以使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态。

答案:(1)粘性末端磷酸二酯键

(2)转化使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态

1.基因工程的工具

2.基因工程的原理与操作步骤

(1)基因工程的原理

①基本原理:让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。

②基本要素:多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。

(2)基因工程的基本操作步骤

3.形成重组DNA分子

(1)单酶切法

将同一种限制性核酸内切酶切割的质粒与目的基因片段混合,加入DNA连接酶,两两连接的产物(重组DNA分子)有以下3种:目的基因与目的基因的连接物;质粒与质粒的连接物;目的基因与质粒的连接物。其中,只有目的基因与质粒的连接物才是真正需要的。

(2)双酶切法

双酶切法的优点主要在于防止质粒和目的基因自身环化以及保证目的基因单向插入质粒。

【自我诊断】

1.转入外源基因的动物称为转基因动物。( √)

2.从猪血液中提取的胰岛素属于基因工程药物。( ×)

3.限制性核酸内切酶作用于DNA分子的氢键,使DNA双链断开。( ×)

4.限制性核酸内切酶能够特异性识别并切割烟草花叶病毒遗传物质。( ×)

5.基因工程的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶及质粒。( ×)

6.质粒中的抗生素合成基因等标记基因通常会用于含有目的基因受体细胞的筛选。( ×)

7.质粒是一种直链DNA分子,可作为基因工程中的载体。( ×)

8.DNA聚合酶和限制性核酸内切酶是基因工程中常用的两种工具酶。( ×)

9.土壤农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组,然后将重组DNA分子导入植物受体细胞。( ×)

10.基因工程的原理是让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定的保存和表达。( √)

11.多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞是进行基因工程操作的基本要素。( √)

12.目的基因序列未知,可采用PCR扩增获得目的基因。( ×)

13.构建基因文库时需包含目的基因。( √)

14.将目的基因导入动物细胞和植物细胞最常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法。( ×)

15.利用氯化钙处理农杆菌细胞,可以增加其细胞膜的通透性。( ×)

16.在宿主细胞中检测到目的基因存在,说明转基因技术操作成功。( ×)

17.限制性核酸内切酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要手段。( √)

18.基因治疗是向目的细胞中导入正常基因以替换细胞中不正常的基因。( ×)

考向1 基因工程的工具

【例1】下列关于基因工程的有关叙述,正确的是( )

A.基因工程常用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体

B.一种限制性核酸内切酶能识别几种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA

C.质粒是一种常用载体,是拟核外能自主复制的很小的环状DNA分子

D.DNA连接酶可代替DNA聚合酶用于DNA的复制

解析:基因工程常用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶,载体是工具;一种限制性核酸内切酶能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA;质粒是独立于拟核区之外的特殊环状DNA分子,具有自主复制能力;DNA聚合酶以DNA的一条链为模板进行复制,DNA连接酶不需要模板,将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起,形成重组DNA分子。

答案:C

基因工程操作中的6点易错

(1)在切割目的基因时要求用同一种限制性核酸内切酶,目的是产生相同的粘性末端。

(2)将目的基因从DNA分子中切割出来需要消耗4分子水,形成4个粘性末端,目的基因上含有2个粘性末端。

(3)不同DNA分子用相同限制性核酸内切酶切割产生相同的粘性末端,同一种DNA分子用不同的限制性核酸内切酶切割,产生的粘性末端一般不同。

(4)基因工程中用到的载体并非只有质粒,还有λ噬菌体、植物病毒和动物病毒,其中质粒和λ噬菌体可将外源基因载入到大肠杆菌等宿主细胞中,而植物病毒和动物病毒能够将外源基因分别载入到植物细胞和动物细胞内。

(5)基因工程中载体与细胞膜上载体本质不同,前者化学本质为DNA,后者为蛋白质。

(6)标记基因与目的基因的表达无关,其作用为筛选含有目的基因的受体细胞。

【例2】如表所示列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。下列说法错误的是( )

限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ

识别序列及

切割位点

A.一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后,含有4个游离的磷酸

基团

B.用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割

C.图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状,不能使用EcoRⅠ

D.为了获取重组质粒,最好用BamHⅠ和HindⅢ同时切割质粒和外源DNA

解析:质粒切割前是双链环状DNA分子,所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键,故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出,质粒上只含有一个SmaⅠ的切点,因此被该酶切割后,质粒变为线性双链DNA分子,因每条链上含有一个游离的磷酸基团,因此切割后含有两个游离的磷酸基团;重组DNA分子中应具备目的基因、标记基因等,图中质粒的标记基因为抗生素抗性基因,而SmaⅠ的切割位点就在该基因上,因此用质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割;由于同种限制性核酸内切酶切割形成的粘性末端相同,图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状,不能使用EcoRⅠ;使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA,各自会有不同粘性末端,能防止自身环化。

答案:A

考向3 基因工程的应用

【例3】 (2018·浙江全能生9月联考)重瓣紫堇具有较高观赏和药用价值,但自然状态下几乎高度不育。为解决重瓣紫堇的繁殖难题,科学家利用另一种植物的可育基因M,完成了对重瓣紫堇的改造,流程如图:(图中箭头指的是不同限制性核酸内切酶识别的位点)

请回答:

(1)在本例中,应选用的限制性核酸内切酶是,以避免质粒自身环化、错向连接等问题。连接目的基因和质粒时,关键需要催化键的形成。

(2)导入受体细胞时,应先用CaCl2处理,使其,从而有利于重组质粒的导入。

(3)利用紫堇根尖细胞培养成完整植株,依据的原理是

,理论上, (填“能”或“不能”)用紫堇的叶肉细胞代替根尖细胞完成上述改造工作。

(4)若图中所得的转基因紫堇植株自交一代,子代中能稳定遗传的个体所占的比例为。

解析:(1)根据质粒和目的基因所在DNA均存在三个限制性核酸内切酶切位点,且BalⅠ酶切位点处于目的基因M的中间,不适宜选用,因此应该选择HindⅢ和XhoⅠ进行酶切,且符合题中“避免质粒自身环化、错向连接”等问题;目的基因与质粒的连接需要DNA连接酶,具体催化的化学键是磷酸二酯键。(2)本题采用的是农杆菌转化法,其中重组质粒首先导入的受体细胞为农杆菌,再借助农杆菌侵染植物细胞的特性,将农杆菌细胞内的目的基因转移至最终的植物细胞中,因此CaCl2处理的对象是农杆菌,其具体机理是使得细菌处于感受态。(3)植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性,由于叶肉细胞同样具有本物种生长、发育、繁殖的全部遗传信息,所以也可作为受体细胞进行培养。(4)该转基因植物可写作“MO”型,在自交时,相当于杂合体,会导致后代性状分离,具体为MM∶MO∶OO=1/4∶1/2∶1/4,因此可稳定遗传的植株基因型为MM,占1/4。

答案:(1)HindⅢ和XhoⅠ磷酸二酯

(2)农杆菌处于感受态

(3)植物细胞的全能性能

基因工程中分子或个体水平的检测方法

【热点变式】人血清蛋白(HSA)具有重要的医用价值。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。

(1)如果HSA基因序列未知,可以采用的方法获取该目的基因,为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建后才能导入宿主细胞。

(2)方框中的“?”一般选用的生物是,为了提高Ⅱ过程的导入成功率,通常用处理大肠杆菌。

(3)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)途径获取rHSA更有优势。

(4)为了鉴定宿主细胞中是否产生rHSA,可以用方法来进行检验。

A.检验HSA基因是否导入

B.检验细胞中是否产生相应的mRNA

C.抗原—抗体杂交

D.检测是否有标记基因

解析:(1)获取目的基因的方法有:从基因文库中获取、采用PCR技术扩增(适用于目的基因的核苷酸序列已知的情况下)、人工化学合成(适用于目的基因较小且序列已知的情况下)。因此如果HSA基因序列未知,可以采用从基因文库中提取的方法获取该目的基因;为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建基因表达载体(重组DNA)后才能导入宿主

细胞。

(2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,因此方框中的“?”一般选用的生物是农杆菌;将目的基因导入微生物细胞时常用感受态细胞法,即用氯化钙处理微生物细胞,使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态。

(3)由于大肠杆菌是原核生物,其细胞中不含内质网和高尔基体,而人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择Ⅰ途径获取rHSA更有优势。

(4)检测目的基因是否表达形成蛋白质可以采用抗原-抗体杂交法。

答案:(1)从基因文库中提取重组DNA分子(2)农杆菌氯化钙(3)Ⅰ(4)C

考点2 克隆技术

1.(2018·浙江4月选考,节选)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行,然后接种到培养基中培养,幼胚发生

形成愈伤组织,并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及

(答两点即可)。

解析:组织培养时对幼胚先进行消毒处理,以免污染;幼胚经脱分化形成愈伤组织;影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素还有水稻的基因型、愈伤组织继代的次数等。

答案:消毒脱分化水稻的基因型、愈伤组织继代的次数

2.(2017·浙江11月选考,节选)(1)利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径:一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的途径。二是由愈伤组织的细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗,再诱导生根获得再生植株,其原因是腋芽中存在。

(2)利用植物克隆培育新品种,一方面可利用带有目的基因的侵染植株,若将目的基因通过的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株。另一方面利用异源植物的进行融合产生杂种植株,或利用异源植物在试管内进行,对其产生的胚进行培养产生杂种植株。

(3)下列属于植物克隆和动物克隆共有的培养方法是。

A.悬浮培养、器官培养

B.贴壁培养、传代培养

C.器官培养、愈伤组织培养

D.原生质体培养、传代培养

解析:(1)利用愈伤组织获得再生植株,可以将愈伤组织通过器官发生途径分化成根和芽等分生组织后,获得完整植株,也可以由愈伤组织的细胞产生胚状体后再形成完整的植株。若不采用愈伤组织获得植株,还可利用茎段培养成丛状苗,然后诱导其生根,进而获得再生植株,该方法之所以采用腋芽等幼嫩组织进行培养,主要原因是腋芽等幼嫩组织中存在分生组织,能够完成器官分化和重建。(2)利用植物克隆培育新品种,可以利用带有目的基因的农杆菌侵染植株,或将目的基因通过显微注射导入植物细胞,进而获得转基因植株。也可利用异源植物的原生质体进行原生质体融合产生杂种植株,或利用异源植物进行试管内受精,将获得的未分化的胚进行培养进而获得杂种植株。(3)植物克隆和动物克隆时,都可进行液体悬浮培养,都存在组织和器官培养,贴壁生长是动物细胞培养的特点,愈伤组织和原生质体培养是植物克隆所特有的。

答案:(1)器官发生分生组织

(2)农杆菌显微注射原生质体受精

(3)A

3.(2016·浙江10月选考,节选)某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答:

(1)原生质体的分离:在无菌条件下,取烟草无菌苗的叶片,放入含有0.5 mol/L甘露醇(维持较高渗透压)的

混合液处理,经过离心纯化后获得原生质体。

(2)原生质体的培养:将原生质体进行培养,重新长出细胞壁,形成胚性细胞。此时,应该培养基中甘露醇的浓度,以利于胚性细胞继续培养形成细胞团,然后经两条途径形成再生植株。途径一:细胞团经球形胚、和胚状体,最后发育成植株。途径二:细胞团增殖为愈伤组织,然后在发芽培养基上诱导出芽,切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是,

胚性细胞的主要特点是(A.液泡小、细胞核小 B.液泡大、细胞核大 C.液泡大、细胞核小 D.液泡小、细胞核大)。

(3)为了对烟草的某些性状进行改良,分离得到两种烟草的原生质体后,通过方法将它们的遗传物质组合在一起,经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA,采用扩增相关基因,来鉴定遗传物质是否成功重

组。

解析:(1)用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体。(2)降低培养基中甘露醇的浓度,利于细胞团的形成。再生植株的形成途径之一是经球形胚、心形胚和胚状体,后发育成植株;发芽培养基中细胞分裂素浓度大于生长素浓度。胚性细胞液泡大,细胞核大。(3)两种烟草的原生质体通过原生质体融合将其遗传物质组合在一起。扩增DNA的技术是PCR。

答案:(1)纤维素酶和果胶酶

(2)降低心形胚细胞分裂素 B

(3)原生质体融合PCR

1.植物细胞全能性与表达能力下降原因分析

(1)概念:植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性,因而都具有发育成完整植株的潜能。

(2)植物细胞全能性的原因:生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部基因。

(3)植物细胞全能性表达的条件

①离体、无菌操作。

②一定的营养物质,如水、无机盐、蔗糖、维生素等。

③添加植物激素,如细胞分裂素和生长素。

④一定的外界环境条件(温度、酸碱度、光照的控制等)。

(4)植物细胞全能性的体现

①植物体的几乎所有组织的细胞通过诱导都可再生新植株。植物细胞的全能性比动物细胞更容易体现。

②植物组织培养中细胞全能性下降的原因

a.有可能是遗传物质变化:染色体畸变、细胞核变异、非整倍体产

生等。

b.生长发育条件变化:激素平衡被打破;细胞对外源生长物质的敏感性改变。

c.随时间推移,由于其他各种原因产生缺乏成胚性的细胞系。

2.植物组织培养的途径

(1)理论基础:植物细胞的全能性。

(2)植物组织培养途径

配制培养基:配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的半固体培

养基

↓

切取消毒的组织块

↓

获得愈伤组织:由相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织

①器官发生途径

愈伤组织芽和根→完整植株

②胚胎发生途径

愈伤组织胚性细胞(单细胞)→细胞团→球形胚→心形胚→胚状体→完整植株

(3)植物组织培养的意义

①可以在实验室、试管等器皿中进行植物受精过程和自受精卵进行的植物胚胎发育过程,以及调节控制这些过程的环境因素、遗传基础和分子及生理生化机理研究。

②可以进行遗传工程的操作,完成与植物生长发育有关的重要基因或影响因素的研究。

③可以方便地通过实验手段培育植物新品种。

3.原生质体培养与植物细胞工程

(1)原生质体的获得方法:在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液环境(较高渗透压)下用纤维素酶和果胶酶混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞,除去细胞壁。

(2)植物细胞工程操作过程

外源遗传物质

(DNA)受体植物细胞

(包括原生质体受体)

转基因细胞或重组细胞新植株。

4.动物细胞和组织培养流程及相关名词

(1)动物细胞和组织培养流程

(2)动物细胞、组织培养过程中的相关名词

①原代培养:从机体取出后立即进行的细胞、组织培养的过程。

②传代培养:将原代培养细胞分成若干份,接种到若干份培养基中,使其继续生长、增殖。

③细胞系:指可连续传代的细胞。可分为连续细胞系(恶性细胞系,具有异体致瘤性;不死性细胞系,保留接触抑制现象,不致癌)和有限细胞系。

④细胞株:通过一定的选择或纯化方法,从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞。可分为连续细胞株和有限细胞株。

⑤克隆培养法:把一个单细胞从群体中分离出来单独培养,使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。基本要求是必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞。

5.动物的细胞融合技术及其应用

(1)细胞融合

多核体杂交细胞多个杂交细胞

聚乙二醇(PEG)、灭活的仙台病毒等

(2)单克隆抗体的制备流程

①优点:特异性强、灵敏度高,可大量制备。

②用途:用于治疗疾病;作为特异探针,研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功能。

6.细胞核移植和动物的克隆繁殖

(1)核移植:利用一个细胞的细胞核来取代另一细胞中的细胞核,形成一个重建的“合子”。

(2)动物的克隆繁殖

(3)动物难以克隆的根本原因

在动物的个体发育过程中,分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化,这是由于细胞内伴随着它们在发育过程中时间、空间的变化,基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。

7.植物组织培养和动物细胞培养的比较

比较项目植物组织培养动物细胞培养

理论基础细胞的全能性细胞的增殖

培养基类

型

固体或半固体培养基液体培养基

成

分

水、无机盐、维生素、

蔗糖、琼脂、植物激素

葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清

取材部位植物幼嫩部位或花药动物胚胎或幼龄动物的器官和组织对光的

需求

再分化阶段需光不需光过程

结果获得植株新个体或获得

大量的细胞和细胞产物

只能获得大量细胞或细胞产物,不能得到生物个体

用途①植株快速繁育

②脱毒植物的培育

③制造人工种子

④生产药物、杀虫剂等

⑤转基因植物的培育

①蛋白质生物制品的生产;②皮肤移植材料的培养;③检测有毒

物质;④生理、病理、药理学研究

共性①都需无菌条件,培养基中含有有机物和无机物等营养物质;②细胞都进行有丝分裂过程

1.植物组织培养的理论基础是植物细胞具有全能性。( √)

2.通过液体悬浮培养,可将愈伤组织分散成单细胞。( √)

3.动物细胞培养过程中,用胰蛋白酶处理可使动物细胞分散开来。( √)

4.胚性细胞具有细胞核大,细胞质丰富,液泡大的特点。( ×)

5.去掉植物细胞壁常用的酶是纤维素酶与果胶酶。( √)

6.恶性细胞系具有异体致瘤性,不死性细胞系保留接触抑制。( √)

7.植物组织培养过程中,器官发生和形态重建主要是通过平衡植物激素的种类进行调控。( ×)

8.制备原生质体时,采用低渗甘露醇,防止原生质体失水过多失去生物活性。( ×)

9.不同种类植物或同种植物的不同基因型个体,其细胞全能性的表达程度大不相同。( √)

10.植物组织培养过程中,培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的可能原因有染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生等,但其结果是可逆的。( ×)

11.克隆培养必须保证分离出来的细胞是一种类型的多个细胞,而不是多种类型细胞。( ×)

12.动物细胞培养时,通入CO2的目的是刺激细胞呼吸。( ×)

13.原生质体培养需要先对原生质体的活力进行检测,可以采用质壁分离的方法。( ×)

14.诱导动物细胞融合常用的化学方法有聚乙二醇(PEG)或灭活的仙台病毒作为诱导剂。( ×)

15.获得植物次生代谢产物(如某些中药:紫草素等),通过大量培养特定细胞系即可(获得愈伤组织即可),无需获得植株。( √)

16.单细胞发育成胚的过程为单细胞→细胞团→心形胚→球形胚→胚状体。( ×)

17.有限细胞系大多是发生转化了的细胞系,具有异倍体核型。( ×)

18.理论上各种细胞都可被克隆,但是单细胞通常不如群体细胞;原代细胞、有限细胞系通常不如无限细胞系、转化或肿瘤细胞。( √)

19.在单克隆抗体的制备中,取小鼠的B淋巴细胞之前,一定要给小鼠注射相应的抗原(或相应的疫苗)。( √)

考向1 植物克隆

【例1】如图中的①②③代表通过植物组织培养技术培育新植株的三条途径,请回答:

(1)外植体c来自同种植株,植株C中的细胞,全能性表达程度(填“相同”或“可能不同”)。

(2)途径②和③需要用到和(填培养基的物理性质)两种培养基。将含B1的试管放在摇床上,通过培养可以分散成单细胞。

(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的(A.甘露醇 B.盐酸 C.蒸馏水 D.氯化钠)以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着技术又向前迈进了一步。

(4)通过大量培养特定细胞系,可以实现能产生重要(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。

解析:(1)外植体a、b、c来自同种植株,由于不同细胞的分化程度不同,因此植株C中的细胞全能性表达程度可能不同。(2)途径②中用到摇床,因此需要用液体培养基,而途径③需要用到固体(或半固体)培养基。将含B1的试管放在摇床上,通过液体悬浮培养可以分散成单细胞。

(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着植物细胞工程技术又向前迈进了一步。

(4)通过大量培养特定细胞系,可以实现能产生重要次生代谢产物(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。

植物克隆涉及的技术比较

技术名

称

具体应用

植物组

织培养

外植体脱分化成愈伤组织(薄壁细胞),再分化为植株

植物细

胞培养

由愈伤组织获得大量单细胞,培育特定细胞系,实现能产生重要次生代谢产物(如某些中药)的细

胞的大量克隆和产物的工业化生产

悬浮细

胞培养

愈伤组织在摇床上分散成单个细胞,再发育成胚状体,形成植株

原生质

体培养

利用纤维素酶和果胶酶分解细胞壁,获得原生质体,用适当方法进行原生质体培养,获得新植株,

具体图示如下:

转基因

技术

利用全能性诱导为完整植株,克服远缘杂交不亲和的障碍,定向改造植物的性状植物体

细

胞杂交

利用全能性诱导为完整植株,克服远缘杂交不亲和的障碍

花药离

体培养

进行单倍体克隆,获得单倍体植株

(1)将外源遗传物质与受体植物细胞(包括原生质体受体)遗传物质重新组合,除了转基因技术外,还有

等方法,这些方法解决了传统育种方法存在的的缺陷。植物原生质体的获取可以在较高渗透压环境下,用酶处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞的细胞壁。

(2)如果构建重组细胞的目的是为了获取重要的次生代谢产物(如某些中药),可以通过大量培养特定来达成目的。

(3)如果农杆菌侵染对象为某植物叶片,将被侵染的叶片除菌后进行培养,最终得到转基因植物。下列叙述中正确的

是。

A.愈伤组织在合适条件下经脱分化形成再生植株

B.再生的芽在细胞分裂素含量较高的培养基上生根

C.叶片在含合适浓度生长素的培养基上经再分化形成愈伤组织

D.愈伤组织在细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽

解析:(1)将外源遗传物质与受体植物细胞(包括原生质体受体)遗传物质重新组合,除了转基因技术外,还有细胞融合或显微注射等方法,这些方法解决了传统育种方法存在的远缘亲本难以杂交(或生殖隔离)的缺陷。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,根据酶的专一性原理去除植物细胞壁应该用纤维素酶和果胶酶。(2)如果构建重组细胞的目的是为了获取重要的次生代谢产物(如某些中药),可以通过大量培养特定细胞系来达成目的。(3)愈伤组织在合适条件下经再分化形成再生植株;再生的芽在细胞分裂素含量较高的培养基上发芽,在生长素含量较高的培养基上生根;叶片在含合适浓度生长素的培养基上经脱分化形成愈伤组织;愈伤组织在细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽。

答案:(1)细胞融合或显微注射远缘亲本难以杂交(或生殖隔离) 纤维素酶和果胶(2)细胞系(3)D

考向2 动物细胞和组织培养

【例2】如图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线(图中B,E两点表示经筛选、分装后继续培养),请据图回答下列问题:

(1)OB段的培养称为培养,AB段可能发生了现象,使增殖速率减缓,用酶可使组织细胞分散开来,分装到多个卡氏瓶中进行培养。

(2)B点的细胞群体称为。B点时筛选出一个细胞,通过单独培养使之繁衍成一个新的细胞群体,该细胞群体称为。

(3)E点后的细胞大多数具有核型,从而可连续传代。

解析:(1)人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养,分瓶后的培养称为传代培养;当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖,即会发生接触抑制现象,用胰蛋白酶可使组织细胞分散开来。

(2)细胞系指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群,称细胞株。

(3)已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系,称连续细胞系或无限细胞系,无限细胞系大多已发生异倍化,具异倍体核型。

答案:(1)原代接触抑制胰蛋白传代

(2)细胞系克隆培养法细胞株

(3)异倍体

考向3 动物的细胞融合技术及其应用

【例3】 (2018·绍兴9月模拟)回答与动物克隆有关的问题:

(1)广义的动物组织培养包括

和器官培养,器官培养是指、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存、生长。

(2)细胞融合是细胞工程的主要技术手段之一,其中电融合技术的原理是在低压交流电场

中;而细胞杂交是的细胞间的融合。

(3)单克隆抗体的制备中,往往在经过免疫的动物的(器官)中获得能产生抗体的B细胞,经融合和筛选再培养,其培养的基本要求是

。

(4)若想通过基因工程制备大量的单一抗体,下列方法可行的是( )

A.将抗体基因直接导入小鼠骨髓瘤细胞

B.将含有抗体基因的重组DNA分子导入小鼠骨髓瘤细胞

C.将含有抗体基因的重组DNA分子导入人的浆细胞

D.将含有调控抗体产生基因的重组DNA分子导入人的浆细胞

解析:(1)广义的动物组织培养包括细胞培养、组织培养和器官培养,器官培养是指器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存和生长。(2)细胞融合可以在基因型相同也可以在基因型不同的细胞间进行,而细胞杂交是基因型不同的细胞间的融合。电融合技术的原理是在低压交流电场中击穿质膜脂双层,导致细胞质融通。(3)单克隆抗体的制备中,从经过免疫的动物的脾脏中获得能产生抗体的B细胞,与无限传代的骨髓瘤细胞融合,经过筛选、克隆培养,获得来自单一细胞的既能产生特异抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞克隆。(4)若要通过基因工程制备大量的单一抗体,可将含有抗体基因的重组DNA分子导入小鼠骨髓瘤细胞中。

答案:(1)细胞培养、组织培养器官的原基

(2)击穿质膜脂双层,导致细胞质融通不同基因型

(3)脾脏获得既能产生特定抗体又能无限增殖的单个细胞(4)B

考向4 细胞核移植和动物的克隆繁殖

【例4】 (2018·嘉兴9月基础测试)回答与动物克隆有关的问题:

(1)克隆培养法的基本要求是所建立的克隆必须来源于,以下不属于提高克隆成功率的是(A.添加血清

B.持续通入氧气

C.使用CO2培养箱

D.胰岛素刺激)。

(2)克隆绵羊的诞生证明的体细胞还能恢复到类似

时期的功能,同时在胚胎和个体发育中具有调控细胞核发育的作用。

(3)人—鼠杂交细胞通常会丢失人的染色体,因此, (填“能”或“不能”)利用该细胞杂交技术对鼠的基因进行定位。通过杂交瘤技术制备的单抗可以作为与抗原发生反应,用以研究抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功能。

解析:(1)克隆培养法的最基本要求是保证所建立的克隆来自于单个细胞。提高细胞克隆形成率的措施有:选择适宜的培养基、添加血清、滋养细胞支持生长、激素(胰岛素)刺激、使用二氧化碳培养箱等。(2)克隆绵羊的诞生证明高度分化的体细胞还能恢复到类似受精卵时期的功能,同时在胚胎和个体发育中细胞质具有调控细胞核发育的作用。(3)人—鼠杂交细胞通常会丢失人的染色体,因此,可以利用该技术对人的基因进行定位。通过杂交瘤技术制备的单抗可以作为特异性探针与抗原发生反应,用于研究抗原蛋白的结构、细胞学分布及其

功能。

答案:(1)单个细胞 B (2)高度分化受精卵细胞质(3)不能特异性探针

【热点变式】 (2018·浙江质检)回答与基因工程和动物克隆有关的问题:

FtsZ是病原菌中引导细胞分裂的蛋白质。靶向FtsZ蛋白的抑制剂可有效抑制细菌的分裂。

(1)持续用抗生素杀灭病原菌,易产生,但使用FtsZ蛋白抑制剂不易产生,原因是FtsZ蛋

白

。

(2)为减少家畜养殖过程中抗生素的使用,科学家合成了可抑制FtsZ蛋白合成的sula蛋白基因,并通过下列方法培育出转sula基因奶牛。

①根据sula蛋白中氨基酸序列化学合成了多个目的基因,则这些目的基因的碱基序列及控制的性状是(A.一种、相同性状 B.一种、不同性状 C.多种、相同性状 D.多种、不同性状)。

②未受精的卵母细胞去除细胞核时常用的物理方法是

。核移植时需借助精密的显微操作仪和高效率的法,得到重组细胞。

③重组细胞培养至胚胎过程中, (填“需要”或“不需要”)在培养基中添加饲养层。为提高胚胎的利用率,可对所得胚胎进行。

解析:(1)持续使用抗生素,会因选择作用,造成细菌产生抗药性。FtsZ是细菌正常分离合成的一类蛋白质,使用该蛋白质抑制剂不会造成细菌抗药性。(2)①由于密码子具有简并性,因此通过氨基酸序列逆推DNA序列,可得到多种基因序列,但是各种基因表达的蛋白质序列相同。②克隆操作时,未受精卵母细胞去除细胞核常用的方法是紫外线照射破坏细胞核,进行核移植时需要借助精密显微操作仪和高效率的细胞融合法,获得重组细胞。③饲养层抑制细胞分化,胚胎培养过程中,不需要加入饲养层。为提高胚胎的利用率,可对胚胎进行胚胎分割。

答案:(1)耐药性是细菌正常分裂必须合成的蛋白质

(2)①C ②紫外线(照射)处理细胞融合(或电脉冲细胞融合) ③不需要胚胎分割

考向5 植物克隆与动物克隆综合分析

【例5】 (2018·浙江9月联考)回答与植物克隆和动物克隆有关的问题:

(1)植物组织培养:将经过的植物组织块,放在半固体培养基上培养,获得一团的薄壁细胞组成的愈伤组织,再以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导再生出新植株。培养过程中不同植物细胞全能性表达程度有很大的不同,是因为不同植物之间存在

。

(2)动物细胞培养:首先用胰酶消化动物组织中的和细胞外的其他成分,获得,制成细胞悬浮液;然后在人工控制的条件下培养,由于细胞之间的相互依存,培养的细胞也会像在体内一样呈现一定的。

(3)下列关于植物克隆和动物克隆的叙述,正确的是( )

A.离体的植物组织或器官都必须通过脱分化才能形成愈伤组织

B.植物组织培养过程中都会形成细胞质丰富、液泡小而细胞核大的胚性细胞

C.在动物细胞培养时,培养保持接触抑制的细胞在卡氏瓶上可形成多层细胞

D.同属于一个细胞系的细胞群,由于来自一个共同的祖细胞,所以称为纯系

解析:(1)进行植物组织培养,需要先对待培养的组织块进行消毒处理,以杀灭病菌。进行植物组织培养,经脱分化会得到一团相对未分化的愈伤组织,配以适当的植物生长调节剂,可诱导产生新植株。植物组培时,由于不同植株的遗传差异,因此不同植物细胞全能性表达程度不同。(2)进行动物细胞培养,首先用胰蛋白酶消化动物组织中的胶原纤维和一些细胞外成分,获得单个细胞,制成细胞悬液。这些单个的细胞也会像在体内一样呈现一定的组织特性。(3)离体的植物细胞经脱分化后才可形成相对未分化的愈伤组织;愈伤组织细胞经液体悬浮培养才会形成胚性细胞;动物细胞具有接触抑制,不能形成多层细胞;纯系是来自一个细胞分裂的后代,细胞系中具有不同类型的细胞。

答案:(1)消毒相对没有分化遗传性的差异 (2)胶原纤维单个细胞组织特性(3)A

克隆技术简介

克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。

基因工程实验技术介绍

一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置

由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液

【精品】2021年高中高三生物二轮复习专题练习含答案解析4：基因工程

2021年高三生物二轮复习专题练习4含答案解 析：基因工程 一、选择题 1.下列关于基因工程应用的叙述，正确的是( ) A．基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因 B．基因诊断的基本原理是DNA分子杂交 C．一种基因探针能检测水体中的各种病毒 D．利用基因工程生产乙肝疫苗时，目的基因存在于人体B淋巴细胞的DNA中 2.1970年，特明和巴尔德摩证实了RNA病毒能依赖RNA 合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA 的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解分析，下列说法不．正确的是( ) A．催化①过程的酶是逆转录酶 B．从图示可以看出要将碱基对之间的氢键断开可以用核酸酶H和高温处理 C．从图中信息分析可知，②⑤过程为DNA复制，催化⑤过程的酶能耐高温 D．如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25%，U占15%，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶30

个 3.在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是( ) A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C．将重组DNA分子导入烟草原生质体 D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞 4.如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是( ) A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌 C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长 5.在基因工程操作中限制性核酸内切酶是不可缺少的工具酶。下列有关限制性核酸内切酶的叙述错误的是( )

《克隆技术》教案

第二节克隆技术 一、【教材分析】 前面学习了动植物的生殖和生物的遗传和变异的特征。本课是以此为基础，在学生已有的认知和经验基础上，进一步引领学生感悟生命过程的复杂多样，讨论克隆技术给人类带来的影响，思考科学技术的双面性。 二、【教学目标】 （一）知识目标： 1、能通过讨论等方式探究克隆技术带来的影响；能将所收集的资料进行整理，设计成有条理的讲演 稿向其他人介绍；能有一定根据地提出自己的观点，并能对其他同学的观点进行评价。 2、能体会到科学技术的“双刃剑”含义。（难点） 3、能用自己的话解释克隆技术。 4、能从正反两个方面说出克隆技术给人类带来的影响。（重点） （二）能力目标： 1.学会收集资料，能通过各种方法和途径收集到有关克隆技术的发展的资料。 2.学会交流和汇报，能够将自己的收获展示给大家，并能够在交流活动中获得他人的信息。 （三）情感目标： 1.通过收集有关克隆人方面的信息，增强关注社会热点问题的意识； 2.通过分工合作，培养团结互助的协作精神； 3.激发对生物技术发展研究的兴趣和探究的欲望。 四、【教学准备】 教师准备： 收集相关的资料和图片作成多媒体课件； 学生准备： 1、准备“假设我会克隆”小作文；

2、收集有关克隆人方面的信息和资料，为“关于是否应该禁止克隆人的辩论”做准备。 五、【教学过程】 教学环 节及时间安排教师活动学生活动 设计意 图 一、创设情景，激发兴趣： （3分钟）1、【展示】孙悟空图片或视频： 2、【提问】你喜欢孙悟空吗？他有哪些本领？ 3、【过渡】孙悟空拔出一根毫毛能变出千万个一 样的自己来。这个神话引发人类复制自身的幻 想，用现代的眼光看就是“克隆”。今天我们学 习第二节克隆技术。 回答孙悟空会：①七 十二变；②腾云驾 雾；③有一双火眼金 睛，能看穿妖魔鬼怪 的伪装；④一个筋斗 能翻十万八千里；⑤ 拔一根毫毛变出一 样的自己等。 孙悟空 形象和故 事，家喻户 晓。易于激 发学生学 习兴趣。 二、知识回顾: （4分钟）1、【展示图片过渡】植物的“克隆”，老百姓可 能每天都在做。 扦插 嫁接 2、【提问】 植物的扦插、嫁接、压条、组织培养和用种子繁 殖相比，有什么特点？ 3、【过渡】无性生殖在生物学上就叫“克隆”。 植物的克隆我们每天都可以做，高等动物的克隆 看图片回顾植物的 扦插、嫁接、压条、 组织培养的知识。 思考回答：扦插、嫁 接、压条、组织培养 都是无性生殖，没有 两性生殖细胞的结 合而直接由母体产 生新个体。 学生对无 性生殖很 熟悉，但不 知道无性 生殖就是 克隆。教师 利用原有 的知识做 基础，引导 学生回顾、 复习。使课 堂能够顺 利过渡到 克隆技术。

基因工程》课程实验指导书

《基因工程》课程实验指导书 生物技术专业 黄淑坚黄良宗编写 佛山科学技术学院 2005年12月

目录 前言 (Ⅱ) 实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） (1) 实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接 (7) 实验三重组DNA的转化 (10) 实验四重组DNA的鉴定 (13) 实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 (16) 实验六表达产物的检测与分析——SDS-PAGE (18) 附录 (22) 参考文献 (34)

前言 基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。 由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。 编者 2005年12月

实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） 一、目的和要求 了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR 反应的基本技术。 二、实验内容 RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。 三、仪器、设备和实验准备 1、仪器 恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。 2、试剂 反转录酶、RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。 3、实验准备 用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。 四、实验原理 RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。 反转录反应是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。

高中生物《基因工程》练习题(含答案解析)

高中生物《基因工程》练习题 题号一二总分 得分 一、单选题（本大题共20小题，共20.0分） 1.如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（） A. 解旋酶、限制酶、DNA连接酶 B. 限制酶、解旋酶、DNA连接酶 C. 限制酶、DNA连接酶、解旋酶 D. DNA连接酶、限制酶、解旋酶 2.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 选用细菌为重组质粒受体细胞是因为质粒易进入细菌细胞且繁殖快 D. 只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达 3.如图为基因表达载体的模式图。下列有关基因工程的说法错误的 是（） A. 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建 B. 任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别 C. 图中启动子和终止子不同与起始密码子和终止密码子 D. 抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了载体 4.一些细菌能借助限制性核酸内切酶抵御外来入侵者，而其自身的基因组DNA经预先修饰能躲避 限制酶的降解。下列在动物体内发生的过程中，与上述细菌行为相似的是（） A. 巨噬细胞内溶酶体杀灭病原体 B. T细胞受抗原刺激分泌淋巴因子

C. 组织液中抗体与抗原的特异性结合 D. 疫苗诱导机体产生对病原体的免疫 5.某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性核酸内切酶位点如图所示，最好应选用下列哪种质粒 作为载体（） A. B. C. D. 6.下图是研究人员利用供体生物DNA中无限增殖调控基因制备单克隆抗体的思路流程。下列相关 叙述正确的是（） A. 酶a、酶b作用位点分别为氢键和磷酸二酯键 B. Ⅰ是经免疫的记忆细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞 C. 筛选出既能无限增殖又能产生专一抗体的Ⅱ必须通过分子检测 D. 上述制备单克隆抗体的方法涉及转基因技术和动物细胞核移植技术 7.下列关于基因工程技术的说法，正确的是（） A. 切割质粒的限制酶均只能特异性地识别3-6个核苷酸序列 B. PCR反应中两种引物的碱基间应互补以保证与模板链的正常结合 C. 载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因 D. 目的基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制 8.在其他条件具备的情况下，在试管中进入物质X和物质Z，可得到相应产物Y．下列叙述正确 的是（）

浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景

浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景 肖婷2012333500202 浙江理工大学经管学院工商管理专业 指导老师：解纯刚浙江理工大学生科学院 【摘要】：随着生命科学时代的到来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，愈来愈引起社会各界的广泛关注。克隆技术作为人类的创造性活动，有其产生和存在的合理性，在诸多领域蕴藏巨大的应用潜力与巨大应用价值和广阔的发展前景。但克隆技术目前仍存在一些问题,如克隆技术对社会伦理和人类健康的影响。人类克隆技术的进步为人类带来的利益是巨大的,因而它的发展是难以阻止的。应对人类克隆技术带来的巨大挑战。 【关键词】：克隆技术；利弊；社会影响；应用前景 一、克隆是什么？ 克隆是英文Clone一词的音译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂）可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆的定义是指独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的物遗传质。 一个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗。凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。 自然界的许多动物，在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞（精子）与母方产生的雌性细胞（卵子）融合（受精）成受精卵（合子），再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎，最终形成新的个体。这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫做有性繁殖，但是，如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块，四块、八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个，八个……生物体，这些生物体就是克隆个体，而这些个体就叫做无性繁殖系。 二、克隆技术是什么？ 克隆技术是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，含义是无性繁殖。

克隆技术的发展与应用前景

克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面： 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和

基因工程实验指导 - 专业实验I

基因工程实验指导书

缩略词表

实验一植物总DNA 的抽提及电泳检测 一【实验目的】 1、了解植物DNA抽提的主要方法； 2、掌握快速抽提DNA的方法。 3、了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法； 4、了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素； 5、训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作。 二【实验原理】 该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。CTAB能溶解于乙醇。 改进的CTAB植物DNA抽提液迅速裂解细胞和灭火细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心步骤，进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。

基因工程练习题(附答案)

基因工程练习题 1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是( ) A、将目的基因从染色体上切割出来 B、识别并切割特定的DNA核苷酸序列 C、将目的基因与运载体结合 D、将目的基因导入受体细胞 2、基因工程中常用细菌等原核生物作受体细胞的原因不包括( ) A、繁殖速度快 B、遗传物质相对较少 C、多为单细胞，操作简便 D、DNA为单链，变异少 3、基因工程是DNA分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、限制酶只用于切割获取目的基因 B、载体与目的基因可以用同一种限制酶处理 C、基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA连接酶 D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测 4、运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有( ) A、抗虫基因 B、抗虫基因产物 C、新的细胞核 D、相应性状 5、转基因动物转基因时的受体细胞是( ) A、受精卵 B、精细胞 C、卵细胞 D、体细胞 6、基因工程中常见的载体是( ) A、质体 B、染色体 C、质粒 D、线粒体 7、水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是( ) A、促使目的基因导入宿主细胞中B、促使目的基因在宿主细胞中复制 C、使目的基因容易被检测出来 D、使目的基因容易成功表达 8、运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白质，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，据以上信息，下列叙述正确的是( ) A、Bt基因的化学成分是蛋白质 B、Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C、转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因 D、转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物 9、人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A、大肠杆菌 B、酵母菌 C、T 噬菌体 D、质粒DNA 4 10、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（） A．能复制 B.有多个限制酶切点C．具有标记基因D．它是环状DNA

基因工程实验(答案)

——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq

2018年全国卷高考生物总复习《基因工程及转基因技术的安全性问题》专题演练(三)(含答案)

2019年全国卷高考生物总复习《基因工程及转基因技术的安全性问题》专题演练(三) 1．（2019年北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。 下列操作与实验目的不符的是（） A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上 【答案】C 2．图9为培育转基因山羊生产人β-酪蛋白的流程图。 下列叙述正确的是（） A．过程①所用的人β-酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得 B．过程①可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植 C．过程①可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体 D．过程①人β-酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译 【答案】AC 3．2019年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。 据图分析，下列叙述错误的是（） A．该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代 B．捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给三亲婴儿 C．三亲婴儿的染色体全部来自母亲提供的细胞核 D．三亲婴儿的培育还需要早期胚胎培养和胚胎移植等技术

【答案】C 4．在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（）A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞 B．用选择培养基筛法导入目的基因的细胞 C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合 D．用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽 【答案】C 5．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（） A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得 B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点 C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来 D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用 【答案】C 6．（2019年新课标①卷，38）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题： （1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________。 （2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________作为载体，其原因是_____________________。 （3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_________________（答出两点即可）等优点。 （4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是___________________（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。 （5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以

克隆技术及其应用_陈大元

科技与社会 克隆技术及其应用 陈大元 (中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室　北京　100080) 摘要　“克隆”的含义是无性繁殖,即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系,这个细胞系中每个细胞的基因彼此是相同的。动物克隆,就是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致,形态非常相像的动物。随着动物克隆研究的发展、克隆技术将广泛应用于医学、畜牧业和濒危动物保护等领域。 关键词　克隆,动物,胚胎细胞, 体细胞 “克隆”是“clone” 的音译,其含义是无性 繁殖,即由同一个祖先 细胞分裂繁殖而成的 纯细胞系,该细胞系中 每个细胞的基因彼此 是相同的。动物克隆, 就是指通过无性繁殖 由一个细胞产生一个 和亲代遗传性状一致、形态非常相像的动物。 科学家们很早就开始了动物克隆的研究。早在1938年,德国胚胎学家Sp emann即提出“奇异的实验”的设想。1952年,英国科学家Briggs和King 首次报道了蛙的核移植研究。1962年,英国剑桥大学的Gurdon获得了成年蛙。我国已故科学家童第周教授在20世纪60—70年代曾用囊胚细胞进行鱼类细胞核移植工作,获得属间和种间移核鱼,使我国鱼类核移植研究居世界领先水平。 早期的动物克隆研究仅限于两栖类和鱼类,直到20世纪80年代,核移植克隆技术才开始应用于哺乳动物。根据供核细胞的不同,可将动物克隆研究分为三个阶段: 1　胚胎细胞克隆阶段 1981年,Illmensee和Hop pe报道了他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为核供体,直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中,重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫,获得克隆小鼠,这是第一次用胚胎细胞对哺乳类进行核移植获得成功。1983年,美国科学家利用核移植技术和细胞融合方法获得了克隆小鼠。1986年,英国的Willadsen用绵羊的8—16细胞阶段的胚胎细胞作为供体进行核移植,首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,科学家们又相继克隆出小鼠、绵羊、牛、兔、猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。 2　同种体细胞克隆阶段 1997年2月,英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布,他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植,成功地获得了克隆羊“多莉”[10]。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞,由此说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转, 　2002年中　国　科　学　院　院　刊第3期　收稿日期:2002年4月25日 DOI:10.16418/j.issn.1000-3045.2002.03.005

克隆技术发展简介

克隆技术简介 克隆技术，是由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一个生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（例如同卵双生一样）。但是我们通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。 “克隆”的来源及发展 克隆技术，已经经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 克隆技术的设想是由德国胚胎学家于1938年首次提出的，1952年，科学家首先用青蛙开展克隆实验，之后不断有人利用各种动物进行克隆技术研究。由于该项技术几乎没有取得进展，研究工作在80年代初期一度进入低谷。后来，有人用哺乳动物胚胎细胞进行克隆取得成功。1996年7月5日，英国科学家伊恩·维尔穆特博士用成年羊体细胞克隆出一只活产羊(多莉)，给克隆技术研究带来了重大突破，它突破了以往只能用胚胎细胞进行动物克隆的技术难关，首次实现了用体细胞进行动物克隆的目标，实现了更高意义上的动物复制。 多莉与那头6岁母羊具有完全相同的基因，可谓是它母亲的复制品。具体有四个步骤如下 ①从一只六岁雌性的芬兰多塞特(Finn Dorset)白面绵羊（称之为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。 ②从一头苏格兰黑面母绵羊（称之为B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞。 ③利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞。 ④将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（称之为C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多莉。 换言之，多莉有三个母亲：它的“基因母亲”是芬兰多塞特白面母绵羊（A）；科学家取这头绵羊的乳腺细胞，将其细胞核移植到第二个“借卵母亲”——一个剔除细胞核的苏格兰黑脸羊（B）的卵子中，使之融合、

基因工程试验指导

《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年5月

基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料

限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品； 3. 2菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内

基因工程作业题及答案

第二章 1. 名词解释：核酸内切酶、核酸内切限制酶、同裂酶、同尾酶、核酸外切酶、末端脱氧核苷酸转移酶 答： 核酸内切酶：是一类从多核苷酸链的内部催化磷酸二酯键断裂的酶。 核酸内切限制酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 末端脱氧核苷酸转移酶：可以不需要模板，在单链DNA或突出的双链DNA 3’-OH端随机 添加dNTPs的酶 2. 限制性内切核酸酶的命名原则是什么？ 答：限制性内切核酸酶按属名和种名相结合的原则命名的，即：属名+种名+株名+序号； 首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写； 第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写； (2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。 第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。 顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。 3．部分酶切可采取的措施有哪些？ 答：1）缩短保温时间 2）降低反应温度 3）减少酶的用量 4. 在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp 的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 答：回文序列是：5'-CATA TG-3， 5．什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影响? 答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松 动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星 活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性 内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8．0 以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 第三章 1．如何将野生型的λ噬菌体改造成为一个理想的载体? 答：①删除λ噬菌体的非必需区，留出插入空间；并在余下的非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体 ④删除λDNA必须区段上常用的限制酶切点

克隆技术及其应用与发展

克隆技术及其应用与发展 目前克隆技术、基因工程研究正突飞猛进向前发展，基因概念及其理论的建立，打开了人类了解生命并控制生命的窗口。基因研究已成为当前科学研究中最有决定性的领域之一，成为推动生物、食品和制药产业发展的引擎。众所周知，20世纪遗传学的发展举世瞩目，由于遗传学的发展，科学的社会功能以及社会对科学的制约更受关注，从试管婴儿到克隆技术再到人类基因图谱的绘制无不牵动着世人的心。21世纪是生物技术革命的世纪，克隆技术的应用将促进遗传学，细胞发育生物学，产科学等学科的研究进展，有利于整个世界的科学进步和生活质量的提高，对人类的生活将会产生深远的影响。 克隆、克隆技术 以及克隆的基本过程 “克隆”一词源于“Clone”的音译，指的是人工诱导动、植物的无性繁殖过程，这门生物技术就叫克隆技术。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式，如：由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后再被植入动物子宫中使动物怀孕便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。我们可将其研究或操作的对象分为基因克隆、细胞克隆和个体克隆三大类。 基因克隆是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。 细胞克隆则是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞。 个体克隆则是经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体，这种克隆所用的生物材料可能是一个细胞，也可能是一个组织。可以看出，基因克隆、细胞克隆和个体克隆是在三个不同的层次上开展的研究工作，以原有的基因或细胞或生物个体作为模板，复制出多个与原来模板完全相同的基因或细胞或生物个体来。这就有点像大家利用复印机复印资料，或用胶片冲洗照片一样，从原有的资料或底片复制出许多完全一样的资料或照片来。但实际上并非复制胚胎，只是从成年人体内的一个细胞抽取当中包含的基因资料，然后将植入一个没有核子的卵子细胞内，通过体外受精的方法使这个新细胞发育成一个胚胎。例如小羊多利就是利用体细胞进行细胞核移植而克隆成功的，多利羊的产生与三只母羊有关，其克隆过程如下：科学家选取了三只母羊，先将一只母羊的卵细胞中所有遗传物质吸出，然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞与之融合，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，并促使它分裂发育成胚胎，当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊多利，出生的“羊多”小绵羊与6岁母羊具有完全相同的外貌。 克隆技术在相关领域的应用 克隆的最终产物，如克隆牛、克隆鼠等都不是最重要的成果，基因克隆技术应是建立转基因动物模板的核心和关键性技术，利用转基因动物的体细胞大量复制出具有相同优良性状的个体。由于动物体细胞克隆可以复制出的数量巨大的优良个体，因此动物克隆技术可以首先应用于畜牧业育种上。通常在动物育种中所采用的方法主要是杂交育种，即把两个具有不同优良性状的雌雄个体进行交配，然后在后代中去选择人们所需要的个体。要获得一个优良品种，往往需要几年甚至几十年的时间，而且必须不断地进行育种。如果采用动物个体克隆技术，就可以大量复制出人类所需要的优良个体，还可以大大缩短育种时间和节省大量的人力、物力。克隆技术的完善为转基因动物的繁殖开辟了一条通道，应用克隆技术可以将转基因绵羊