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细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析

细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析
细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析

细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析

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磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)又称丝氢酸磷脂,二酰甘油酰磷酸丝氨酸,是一类普遍存在的磷脂,磷脂化合物中的磷酸甘油酯类,是细胞膜组分之一,与一系列的膜功能有关。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。

磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与PS有高度亲和力,它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin-V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PH+):而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。

Annexin-V可作为FACS(流式细胞分选)方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin-V-EGFP,EGFP与PS的结合比例为1:1,还可进行定量检测。除此之外,还提供生物素偶联的Annexin V,可通过常用的酶联显色反应来检测。另外,MACS公司将磁珠包被Annexin V,可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着

细胞凋亡试验常用的方法

细胞凋亡试验常用的方法(MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法) (一)药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法: 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L,在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组,设加完全培养基不加药物的阴性对照,并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照,每组均设4-6个复孔(平行孔)、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT(5g/L),培养4-6h后,阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应,于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值,按下式计算抑制率 抑制率(%)=(1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值)x 100%。 (二)荧光法: 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞,培养细胞48h后,收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液,并用PBS洗2次后,用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min,用PBS冲洗3次,取10ul滴片,干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 (三)DNA琼脂糖凝胶电泳法: 1、DNA提取: 用大方瓶培养肿瘤细胞,每瓶10ml,细胞浓度为3 x 108个/ml,每隔药物浓度、作用时间均设2瓶,共分3个时间段,4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物,于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h,收货细胞,用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中,加1ml细胞裂解液,再加蛋白酶K,轻轻振摇使悬液混匀,成黏糊状,50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液,混合后10000r/min离心10min,吸出上层水相,移至另一离心管中,再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次,直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇(24:1)按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液,混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇,混合置-20℃处理30min后,10000r/min离心10min,沉淀部分为提供的DNA,弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA,再加入25ul的RNA酶,置37℃作用30min,置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳: TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解,待冷却至60℃时,加入溴化乙锭,使其终浓度为0.5mg/ml,混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内,使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4:1比例混匀后点样。 60V电泳1h,用紫外透射仪观察梯形条带。

磷脂酰丝氨酸是什么

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 宝利美 https://www.wendangku.net/doc/ba8404493.html, DHA+PS (磷脂酰丝氨酸) 磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine ,PS ) 又称丝氨酸磷脂,二酰甘油酰磷酸丝氨酸。 磷酯化合物中的磷酸甘油酯类,是细胞膜组分之一,尤其在人体的神经系统,是大脑的细胞膜的重要组成成分之一,同时对大脑的各种功能(尤其是对大脑的记忆力和情绪的稳定)起到重要的调节作用,如它能影响着细胞膜的流动性、通透性,并且能激活多种酶类的代谢和合成。 如人红细胞膜 上就有磷脂酰胆碱 (占19%)、鞘磷脂 (占8%)、磷脂酰乙 醇胺(占16%)和磷 脂酰丝氨酸(占1 0%)。并且只有后 者在细胞膜上具有 净负电荷,有助于 膜的不对称性。还 能活化已损伤表面凝血酶原。并与磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺在体内可互相转化。由于R1和R2的各不相同而使磷脂酰丝氨酸实际成了一类化合物的总称。 1942年由Jordi Folch 首次提取并定性。PS 由三部分组成:亲水性的甘油骨架为头部,两个较长烃链的亲油基团为尾部。头部由三个基团组成:丝氨酸残基与磷酸残基结合后与C-3位甘油的羟基连接;甘油的另外两个羟基分别与脂肪酸成酯后组成尾部。甘油C-2位的脂肪酸与C-1位的脂肪酸相比,碳链一般更长,而且不饱和键更多。 磷脂酰丝氨酸(PS )指的是一组化合物,而并非单一成分,这是由于不同来源的原料提取的产品脂乙酰残基变化非常大。PS 具有双亲性,即它有亲水性的同时又具有亲油性。其结构决定了它的独特性质,带有负电荷的头部为亲水性(或水溶性),由脂肪酸组成的尾部为亲脂性(或脂溶性)。 它的产品呈白色或淡黄色松散粉末,能乳化于水。不溶于乙醇、甲醇;溶于氯仿、乙醚、石油醚。人工合成物仅溶于氯仿。从牛脑提取物在室温内,又暴露于空气中,则每日变性约0.5%。天然物(L-α-磷脂酰-L-丝氨酸)多由牛(羊)脑或大豆等提取。由于R1和R2差异,实是诸多化合物的混合物。如牛脑制品其R1和R2的大致组成:16:0,约1%;1.8:0,40%~41%;18:1,28%~30%;18:3,约4%;18:4,约1%;20:4,约1%;20:5,约2%;22:6,9%~14%。人工合成产品具有很多异构体,纯化过程复杂。如合成产品1,2-二、二十六烷酰-rac-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸,C38H74NO10P ,分子量336.0。 磷脂酰丝氨酸(PS)可由人体利用丝氨酸合成产生, 它可影响脑内化学讯息的传

PS(磷脂酰丝氨酸)--脑营养素

PS(磷脂酰丝氨酸) ---脑营养素 一、PS(磷脂酰丝氨酸)的定义 磷脂酰丝氨酸,英文名Phosphatidylserine,简称PS,又称丝氨酸磷脂,二酰甘油酰磷酸丝氨酸,由天然大豆榨油剩余物提取。是细胞膜的活性物质,尤其存在于大脑细胞中。其功能主要是改善神经细胞功能,调节神经脉冲的传导,增进大脑记忆功能。 二、PS(磷脂酰丝氨酸)的性质 是一类普遍存在的磷脂,通常位于细胞膜的内层,磷酯化合物中的磷酸甘油酯类,是细胞膜组分之一,与一系列的膜功能有关。尤其在人体的神经系统,是大脑的细胞膜的重要组成成分之一,同时对大脑的各种功能(尤其是对大脑的记忆力和情绪的稳定)起到重要的调节作用,如它能影响着细胞膜的流动性、通透性,并且能激活多种酶类的代谢和合成。 如人红细胞膜上就有磷脂酰胆碱(占19%)、鞘磷脂(占8%)、磷脂酰乙醇胺(占16%)和磷脂酰丝氨酸(占10%)。并且只有后者在细胞膜上具有净负电荷,有助于膜的不对称性。还能活化已损伤表面凝血酶原。并与磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺在体内可互相转化。由于R1和R2的各不相同而使磷脂酰丝氨酸实际成了一类化合物的总称。 三、PS(磷脂酰丝氨酸)的组成 1942年由Jordi Folch首次提取并定性PS由三部分组成:亲水性的甘油骨架为头部,两个较长烃链的亲油基团为尾部。头部由三个基团组成:丝氨酸残基与磷酸残基结合后与 C-3位甘油的羟基连接;甘油的另外两个羟基分别与脂肪酸成酯后组成尾部。甘油C-2位的脂肪酸与C-1位的脂肪酸相比,碳链一般更长,而且不饱和键更多。磷脂酰丝氨酸(PS)指的是一组化合物,而并非单一成分,这是由于不同来源的原料提取的产品脂乙酰残基变化非常大。PS具有双亲性,即它有亲水性的同时又具有亲油性。其结构决定了它的独特性质,带有负电荷的头部为亲水性(或水溶性),由脂肪酸组成的尾部为亲脂性(或脂溶性)。 四、PS(磷脂酰丝氨酸)的功效 (1)提高大脑机能,改善老年痴呆症:随年龄增长,磷脂酰丝氨酸和其它重要的脑内化学物质会逐渐减少,从而导致记忆力、认知力减弱。补充磷脂酰丝胺酸能增加脑突刺数目、脑细胞膜的流动性及促进脑细胞中葡萄糖代谢,从而使脑细胞更活跃。意大利、斯堪的纳维亚半岛和其他欧洲国家都广泛应用磷脂酰丝氨酸补充剂来治疗衰老引发的痴呆症及老年记忆损失。 (2)帮助修复大脑损伤,磷脂酰丝氨酸是脑部神经的主要成分之一,具有营养和活化脑中各种酶的活性,可延缓神经递质的减少进程,有助于修复、更新大脑受损细胞和清除有害物质。 (3)缓解压力,促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪:多项研究表明,磷脂酰丝氨酸能显著降低工作紧张者体内过多的应激激素的水平,减轻压力,缓解脑部疲劳,还可以促进注意力集中、提高警觉性和记忆力,缓解不良情绪。

高中生物细胞凋亡的知识点(一)

高中生物细胞凋亡的知识点(一) [背景知识互动] 1.人的自然寿命是多少岁?人的寿命的长短与什么有关? 2.人体每天都有哪些细胞死亡?举例说明。 答案: 1.人的自然寿命是120岁。人的寿命与细胞衰老有直接关系。 2.人体每天死亡的细胞有小肠上皮细胞、皮肤细胞、血红细胞等。知识链接 人体的衰老与细胞的衰老有关。 人体内每天都有大量的细胞死亡。 [典型例题探究] 【例1】什么是细胞凋亡? 解析:高等真核生物的大多数细胞,在丧失生理功能或严重受损时,激活固有的细胞自杀程序而自灭。这一过程称为细胞程序化死亡。细胞凋亡这个词指细胞程序化死亡所表现的生理变化和形态变化,其中包括细胞收缩、膜泡化、染色质浓缩和降解成小片段。 答案:细胞凋亡是指生物体生长发育过程中,由基因控制的,按照一定的程序发生的'细胞死亡,因而细胞凋亡又称为程序性死亡。规律发现 细胞凋亡中的细胞经常降解成为膜包裹的凋亡体,被巨噬细胞或邻近的细胞吞噬或消化,但不产生炎症反应。 【例2】细胞凋亡的大致过程可分为三个阶段,它们是:________、________、 ________。 解析:.细胞凋亡的过程的三个阶段为: 凋亡的起始:细胞皱缩,细胞连接消失,内质网膨胀,染色体固缩并沿着核膜分布,但细胞膜依然完整。 凋亡小体的形成:核膜破裂,染色体断裂为大小不等的片段,与一些细胞器聚集后被内折的细胞膜包围,在细胞表面形成了许多泡状和芽状的突起,这些突起叫做凋亡小体。 细胞的解体:凋亡小体逐渐与细胞分离,脱落至细胞间质,最终被周围的细胞吞噬并消化。 答案:凋亡的起始凋亡小体的形成细胞的解体注意对细胞凋亡过程的掌握。 1

第五章:流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V检测细胞凋亡 Annexin V (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的断裂片段分析 (7) DNA 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits检测细胞增殖 BrdU Flow (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3检测细胞凋亡 Active (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变,因此,与DNA碎片检测比较,使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用,来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液:含0.1%NaN3,过滤后2-8°C保存。 3. 微量加样器和加样头。

PS的制备纯化方法(磷脂酰丝氨酸)

PS的制备方法 PS 20%、40%、50%、60%,90%(中国/美国) PS的制备方法主要有:1、大豆、动物内脏及大脑提取法;2、PLD催化合成法;3、化学合成法。前两种方法已经应用与工业化生产,化学合成法目前已经取得了重大的进展,但还没有应用于工业化生产。

2.大豆提取法(CN102964379A) 二、酶催化法 酶催化工艺流程

1.磷脂酶的制备 菌种通过各种培养基培养直至发酵,其目的就是得到磷脂酶(PLD),PLD是后面合成反应的催化剂,目前对PLD的利用有两种,如下: 1)利用发酵液通过细胞破碎后让胞内酶释放出来,过滤除掉菌体和一些培 养基等,PLD在滤液中,利用滤液做催化反应,当然此方法的的滤液中含有许多杂质(微生物代谢产物不只是PLD)。 2)(200810053813.1)对发酵液进行相应的处理,如盐析、除盐、离子交 换、凝胶层析等得到较为纯净的PLD,应用于酶合成催化反应。 2.催化反应 1)两相体系:正己烷(甲苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯等)---水体系(JP 2001-186898)PC70%,得50%PS反应收率85.2%,转化率60.8%,反应 成本较高,同时转化率较低。

2)水均质化(JP2002051794、DE102004002053)水的用量是原料的60%~95%, 需要有特殊的均质化设备,已达到理想的均质化水平,保证产品的转化 率。 3)水反应体系(CN200810017261.9):PC用3~10倍的水搅拌分散(因为 PC就是很好的表面活性剂),再加入含有丝氨酸、钙盐和缓冲溶液配制 成的无机体系,在PLD催化下反应。产品收率高,纯度高,其主要的副 产物为磷脂酸 4)均一有机溶剂反应体系(CN102676600):?—戊内脂和2-甲基四氢呋喃 混合溶剂:ps的产率可以达到90%以上 5)临界介质中反应。 说明:个人认为其中的1、3、4更可行,其三者中1、4更适合工业化, 3放大后对设备要求更高。 3.纯化 1)溶剂萃取法:根据产物和杂质在不同溶剂中的溶解度不同,选用合适的 溶剂进行萃取,如正己烷、石油醚、乙醚、氯仿等。 2)薄层色谱分离法:硅胶薄板,洗脱液氯仿—甲醇 3)柱色谱:硅胶和氧化铝,洗脱液氯仿—甲醇 4)高效液相色谱: 说明:适合大规模工业生产的只有1. 三、化学合成法

磷脂酰丝氨酸项目投资建议书

磷脂酰丝氨酸项目 投资建议书 投资建议书参考模板,仅供参考

摘要 该磷脂酰丝氨酸项目计划总投资4340.58万元,其中:固定资产 投资3349.89万元,占项目总投资的77.18%;流动资金990.69万元,占项目总投资的22.82%。 达产年营业收入7518.00万元,总成本费用5896.41万元,税金 及附加82.31万元,利润总额1621.59万元,利税总额1927.57万元,税后净利润1216.19万元,达产年纳税总额711.38万元;达产年投资 利润率37.36%,投资利税率44.41%,投资回报率28.02%,全部投资回收期5.07年,提供就业职位131个。 报告根据我国相关行业市场需求的变化趋势,分析投资项目项目 产品的发展前景,论证项目产品的国内外市场需求并确定项目的目标 市场、价格定位,以此分析市场风险,确定风险防范措施等。 本磷脂酰丝氨酸项目报告所描述的投资预算及财务收益预评估基 于一个动态的环境和对未来预测的不确定性,因此,可能会因时间或 其他因素的变化而导致与未来发生的事实不完全一致。

磷脂酰丝氨酸项目投资建议书目录 第一章磷脂酰丝氨酸项目绪论 第二章磷脂酰丝氨酸项目建设背景及必要性第三章建设规模分析 第四章磷脂酰丝氨酸项目选址科学性分析 第五章总图布置 第六章工程设计总体方案 第七章风险应对说明 第八章职业安全与劳动卫生 第九章进度方案 第十章投资估算与经济效益分析

第一章磷脂酰丝氨酸项目绪论 一、项目名称及承办企业 (一)项目名称 磷脂酰丝氨酸项目 (二)项目承办单位 xxx集团 二、磷脂酰丝氨酸项目选址及用地规模控制指标 (一)磷脂酰丝氨酸项目建设选址 项目选址位于xxx经济开发区,地理位置优越,交通便利,规划电力、给排水、通讯等公用设施条件完备,建设条件良好。 (二)磷脂酰丝氨酸项目用地性质及规模 项目总用地面积13866.93平方米(折合约20.79亩),土地综合利用率100.00%;项目建设遵循“合理和集约用地”的原则,按照磷脂酰丝氨酸行业生产规范和要求进行科学设计、合理布局,符合规划建设要求。 (三)用地控制指标及土建工程

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法:常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察(普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜) 进行定量或半定量的研究方法:各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法:琼脂糖凝胶电泳,形态学观察(透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法),Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法:原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织:主要用形态学方法(HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测: 细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法: 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测: 1)典型的生化特征:DNA 片段化 2)检测方法主要有:琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记(TUNEL)等 3)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 4)通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP (多为dUTP)间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少(如活体组织切片)时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记,

抗心磷脂抗体的研究进展

gens[J].EndocrinoIogy,1996,137:1063. [15]Akingbemi BT,Ge RS,KIinefeIter GR,et aI.A metaboIite of methoxychIor,2,2-bis(p-hydroxyphenyI)-1,1,1- trichIoroethane,reduces testosterone biosynthesis in rat Ieydig ceIIs through suppression of steady state messenger ribonucIeic acid IeveIs of the choIesteroI side-chain cIeavage enzyme[J].Bi- oI Reprod,2000,62:571. [16]Akingbemi BT,Youker RT,Sottas CM,et aI.ModuIation of rat Ieydig ceII steroidogenic function by di(2-ethyIhexyI)pathaIate [J].BioI Reprod,2001,65:1252. [17]Gray LE,Ostby J,Monosson E,et aI.EnvironmentaI antiandro-gens:Iow dose of the fungicide vincIozoIin aIter sexuaI differenti- ation of the maIe rat[J].ToxicoI Ind~eaIth,1999,15:48.[18]Sohoni P,Sumpter JP.SeveraI environmentaI oestrogens are aIso anti-androgens[J].J EndocrinoI,1998,158:327. [19]Vom saaI FS,Timms BG,Montano MM,et aI.Prostate enIarge-ment in mice due to fetaI exposure to Iow doses of estradioI or di- ethyIstiIbestroI and opposite effects at high doses[J].Proc NatI Acad Sci USA,1997,94:2056. [20]NagaI SC,Vom saaI FS,WeIshons WV.DeveIopmentaI effects of estrogenic chemicaIs are predicted by an in vitro assay incor- porating modification of ceII uptake by serum[J].J Steriod Biochem MoI BioI,1999,69:343. [21]Spearow JL,Doemeny P,Sera R,et aI.Genetic variation in susceptibiIity to endocrine disruption by estrogen in mice[J]. Science,1999,285:1259. [22]杜克久,徐晓白.环境雌激素研究进展[J].科学通报,2000,45:2241. ?综述? 抗心磷脂抗体的研究进展 王宇泓综述,杨锡强审校 (重庆医科大学附属儿童医院免疫室400014) 关键词:抗心磷脂抗体;抗磷脂;进展 中图分类号:R593文献标识码:A文章编号:1671-8348(2003)04-0447-04 抗磷脂抗体(antiphosphoIipid antibody,APA)是一种容易引起高凝状态和许多临床表现的自身抗体,分为狼疮抗凝集物(Iupus anticoaguIant,LAC)和抗心磷脂抗体(anticardioIipin anti-body,ACA)。1906年在梅毒病人体内发现第1种APA,其相关抗原被鉴定为心磷脂,于是在此基础上用VDRL实验检测梅毒,后来在大规模筛查梅毒时发现很多系统性红斑狼疮(SLE)病人VDRL实验阳性,但没有梅毒的临床或血清学证据。随着更新实验方法的建立,发现SLE病人中检测到的ACA与LAC、VDRL 实验假阳性结果及血栓形成密切相关。随后的研究发现许多自身免疫性疾病和一些感染性疾病均可检测到APA,于是对该抗体的研究随即在世界范围内得到重视。APA可导致体内不明原因的动静脉血栓形成、习惯性流产、血小板减少等症状,临床把与之相关的一组多系统受累症状称为抗磷脂抗体综合征(an-tiphosphoIipid antibody syndrome,APS)[1]。 LAC分IgG,IgM或IgG/IgM型,结合位于细胞膜的磷脂质,包括磷脂酸、心磷脂、磷脂酰丝氨酸等,其靶抗原为与磷脂结合的凝血酶原,在体外能延长磷脂依赖的凝血试验。部分LAC同时具有抗心磷脂活性,被鉴定为抗!2糖蛋白1(!2GPI)自身抗体。ACA是一组异质抗体,分IgG,IgA,IgM三类,可结合心磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇,其靶抗原尚有争议,可为心磷脂,可为血浆中的磷脂结合蛋白如!2GPI等或这些蛋白与磷脂组成的复合物,还可能针对复合物形成后构象改变暴露出的磷脂或 !2GPI上的新的抗原决定簇。根据与临床的关系分为两类,在自身免疫性疾病和APS中的ACA为自身免疫型,其靶抗原为磷脂结合蛋白,可引起凝血机制的紊乱。在梅毒及其它感染性疾病中检测到的为非免疫型ACA,其靶抗原为心磷脂,不依赖于血浆蛋白如!2GPI的存在。以年轻健康的人为对照组,约1%~ 5%可同时检测到ACA和LAC,与APS的临床表现关系不大。!APA引起高凝状态的机制 APA引起高凝状态的机制与结合细胞膜上磷脂后使花生四烯酸释放减少及前列环素(血小板聚集抑制剂)合成降低有关,可通过与膜磷脂的结合改变凝血酶调节蛋白的表达和活性。此外可活化血管内皮细胞,促进粘附分子表达和白细胞与内皮细胞的粘附能力,降低膜联蛋白"(annexin")在滋养层细胞和内皮细胞上的表达,促进高凝状态的产生;还可促进血小板活化和聚集;ACA和!2GPI可抑制活化的蛋白C的活性,使因子"和#灭活减少,促进血栓形成;APA还可降低抗凝血酶-$的活性,可抑制激肽释放酶原的激活,从而抑制纤溶;通过抑制!2GPI的功能增强纤溶酶原抑制因子-1的活性;在抗磷脂抗体综合征中,凝血酶和抗凝血酶复合物形成受损,凝血酶原片段12增加,凝血酶水平增加,使机体易形成血栓[2]。 "ACA检测对临床疾病的意义 ".!ACA与血栓形成很多文献报道ACA是血栓形成的指标之一,一些年轻人出现不明原因的多发性深部静脉栓塞、肾静脉栓塞、视网膜静脉栓塞,实验室检查唯一不正常的就是ACA的升高。有人对健康中年男性做前瞻性的群组研究得出结论:高水平ACA是发生心肌梗塞的独立的危险因素[3]。亦有人报道脑梗塞、心肌梗塞患者ACA阳性率分别为63.3%和66.67%。Finnazzi等对360个未挑选的ACA或LAC阳性病人的研究提示高滴度ACA而不是LAC是预测血栓形成的有意义的指标[4]。"."ACA与反复流产Granger对387例复发性流产病人进行研究,16%可检测到APA。亦有报道在有不明原因反复流产史的其他方面健康的妇女中约12%ACL阳性。而在总的产龄妇女人群中检测到APA的比例不超过2%[5]。可能部分病人存在亚临床性的自身免疫性疾病。研究发现在自身免疫性疾病,某些因感染、药物导致的疾患中,如果ACA阳性,则习惯性流产的发生率较高,约28%左右,且高滴度的IgG ACA可作为预测高危妇女流产发生的一种较为敏感的指标。确切机理尚不清楚,可能与以下几点有关:ACA可使胎盘血管出现多发性梗塞,胎盘血流减少;能抑制胎儿血管内前列腺素产生,引起循环障碍;

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 (1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,全面皱缩,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体,凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 (2)染色细胞: 姬姆萨(Giemsa)染色、瑞氏染色等:正常细胞核色泽均一;凋亡细胞染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态;坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红(HE)染色:细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色(凋亡细胞),正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:Hoechst 33342,Hoechst 33258,DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标:PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但PI不能通过正常细胞膜,Hoechst则为膜通透性荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调

亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集。故PI着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法) 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜内侧,但在细胞凋亡早期,PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面,暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段,先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别

DHA与磷脂酰丝氨酸

D H A与磷脂酰丝氨酸 集团企业公司编码:(LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

DHA与磷脂酰丝氨酸 1.DHA的介绍: DHA,俗称脑黄金,是二十二碳六烯酸的简称,是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸,属于Omega-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员,DHA是神经系统及维持的一种主要元素,是和视网膜的重要构成成分,在人体大脑皮层中含量高达20%,在眼睛视网膜中所占比例最大,约占50%,因此,对胎婴儿和发育至关重要。 2.DHA的分类 鱼油DHA 藻油DHA 3.鱼油DHA和藻油DHA的优点: 鱼油DHA:鱼油类DHA制品是由鱼类脂肪中提取,含量低,存在海洋污染如甲基汞、二恶英、多氯联苯等有害物质。有重金属污染,并且含有EPA,EPA可以降低血液粘稠度,软化血管,适合中老年人服用,但是不适合孕妇,会造成非正常出血。 藻油DHA:海藻是DHA的原生体,深海鱼通过吃海藻获取DHA。而DHA藻油是直接从海洋藻类中提取出来,含量高,未经食物链传递,没有重金属污染。DHA藻油从海洋单细胞海藻直接提取,不含EPA,安全易吸收。直接补充藻油最符合孕妇需要。 4.DHA对人体的主要作用: (1)胎儿:促进胎儿智力和视力发育DHA是脑力和眼部中主要的结构性脂肪,占大脑的百分之九十七以及眼部的百分之九十三,

(2)孕妇:减少产后抑郁研究显示,我国50-75%的女性都随着孩子的出生经历一段产后抑郁,10%-15%的新妈妈会变得很强烈,被专门术语称为“产后抑郁症”。产后抑郁不仅会严重威胁产妇的身体健康,而且会影响宝宝的发育,导致婴儿发生情感障碍、行为异常。足量DHA可减少产后抑郁症的发生。延长妊娠期预防早产孕期补充足量的DHA可以将孕妇的妊娠期平均延长1.6~2.6天,对于有早产风险的妇女有延长妊娠期的功效。 (3)老人:改善老人痴呆由于随着年龄的增长,脑中的DHA就会逐渐减少,也就是说容易引起脑部功能的退化。事实上,脑细胞在二至三岁前会不断的成长,长大成人后,则会逐渐减少,根据调查,在二十至三十岁时,脑细胞会以十万个的比率逐渐减少,虽然如此,DHA仍具有使剩下的脑细胞活性化的力量,充分地提高记忆及学习能力。 (4)青少年:青少年补充DHA可以缓解不良情绪减轻压力提高记忆力更可能的提高学习力等功效。 1.什么是PS(磷脂酰丝氨酸) 磷脂酰丝氨酸,英文名Phosphatidylserine,简称PS,又称丝氨酸磷脂,二酰甘油酰磷酸丝氨酸,其功能主要是改善神经细胞功能,调节神经脉冲的传导,增进大脑记忆功能。 2.PS(磷脂酰丝氨酸)的性质 是一类普遍存在的磷脂,通常位于细胞膜的内层,磷酯化合物中的磷酸甘油酯类,是细胞膜组分之一,与一系列的膜功能有关。尤其在人体的神经系统,是大脑的细胞膜的重要组成成分之一,同时对大脑的各

流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 Annexin V 检测细胞凋亡

A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变,因此,与DNA 碎片检测比较,使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用,来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液:含0.1%NaN3,过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E):浓度为 10?,使用时,用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料: Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X)Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) PI(Cat. No. 66211E)或7-AAD(Cat. No. 34321X) Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X)PI(Cat. No. 66211E)Annexin V-PE(Cat. No. 65875X)7-AAD(Cat. No. 34321X) 6. FACS流式细胞仪:上样检测。 7. CELLQuest软件:获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管: Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管,按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次,再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料: 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀,室温(20?C ~25?C)避光处放置15分钟。

关于细胞凋亡与疾病

细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下,通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后,从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点,近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因,细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年,Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析,细胞有两种死亡形式:一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis),另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下,通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡,且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD),指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精

确调节的细胞死亡过程,是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡,一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机体细胞生长与更新间的平衡稳定,在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明,细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关,从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变,首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高,继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时,可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中,细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来,所以不引起周围的炎症反应。同一组织中,不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时,早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高,激活了Ca2+依赖性核酸内切酶,于180碱基对处将DNA 切断,胞质内蛋白质发生交联,产生单个核小体和穴聚核小

磷脂酰丝氨酸的主要功能

磷脂酰丝氨酸的主要功能 ?提高大脑机能,集中注意力,改善记忆力 随年龄增长,磷脂酰丝氨酸和其他重要的脑内化学物质会逐渐减少,从而导致记忆力、认知力减弱。补充磷脂酰丝胺酸能增加脑突刺数目、脑细胞膜的流动性及促进脑细胞中葡萄糖代谢,从而使脑细胞更活跃,促进注意力集中、提高警觉性和记忆力。意大利、斯堪的纳维亚半岛和其他欧洲国家都广泛应用磷脂酰丝氨酸补充剂来治疗衰老引发的痴呆症及老年记忆损失。 ?帮助修复大脑损伤 磷脂酰丝氨酸是脑部神经的主要成分之一,具有营养和活化脑中各种酶的活性,可延缓神经递质的减少进程,有助于修复、更新大脑受损细胞和清除有害物质。 缓解压力,促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪: 多项研究表明,磷脂酰丝氨酸能显著降低工作紧张者体内过多的应激激素的水平,减轻压力,缓解脑部疲劳;磷脂酰丝氨酸还可作用于大脑内影响心情的神经递质水平,帮助缓解不良情绪(如抑郁、沮丧等)。 科学趣闻:“情绪食品”热销英国 据东方卫视报道,最近几年,英国超市中的“情绪食品”越来越受到消费者的欢迎。这些食品是指含有欧米伽-3脂肪酸、y-氨基丁酸、L-茶氨酸、B族维生素和磷脂酰丝氨酸这几种营养素的食品,它们有利于提高人们的生活质量并增进健康。 专家认为,欧米伽-3脂肪酸能改善儿童的智力发育和行为举止。它可以添加在酸奶、面包、牛奶甚至糖果中。B族维生素在缓解紧张和抑郁情绪方面有功效,绿色蔬菜、肉类、大米和全麦面包都有B族维生素。磷脂酰丝氨酸有助于增强记忆力。而作为目前正在日本销售的平衡心态巧克力的一种成分,y-氨基丁酸能减轻焦虑。L-茶氨酸则存在于绿茶中,它有助于放松情绪和集中注意力。 生活小常识 1. 一般需要多少磷脂酰丝氨酸? 要想改善智力功能,需每天摄入200~500毫克磷脂酰丝氨酸。大多数临床试验每天使用300毫克。

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 (1)HE(苏木精—伊红染色法)染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。 (2)丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 (3)台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。 (4)透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发

生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体; 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物,测光吸收制。 用途 该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,

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