生化探针技术

第19卷　第2期2004年4月

生化探针技术

赵美萍Ξ　张新祥ΞΞ　常文保ΞΞΞ

(北京大学化学与分子工程学院　北京100871)

摘要　介绍了核酸探针、有机小分子探针和金属离子探针等生化探针技术的基本原理、发展

现状和趋势。

探针(Probe )通常是指针对某种特定目标物的探测器,生化探针可理解为一类能特异性识别目标分子并适合直接检测或带有可检测标记物的高效探测试剂。与一般测定方法相比,生化探针技术具有专一性强、灵敏度高、快速准确等特点。这些优势使其在生物大分子研究、药物分析、司法鉴定、临床疾病诊断和治疗等方面都发挥出巨大作用。根据探针本身的化学组成和性质,常见的生化探针有核酸探针、有机小分子探针和金属离子探针等。其中发展最早、应用最多的是基于核酸分子杂交原理的核酸探针。有机小分子探针既包括能与蛋白质、核酸等生物大分子直接作用的一些染料分子,也包括能选择性检测钙离子的螯合剂探针等;金属离子探针中最具代表性的是稀土离子荧光探针试剂,在生物和药物分析方面得到广泛应用。本文将着重介绍以上3类生化探针的基本原理及相应检测技术的发展现状。

1　核酸探针[1～6]

核酸是重要的生物大分子,具有典型的双螺旋结构。不同来源的核酸分子混合后,经热变性再冷却复性的过程中,具有相同序列的异源核酸分子间会形成杂交核酸分子。核酸探针就是利用核酸分子之间的这种杂交特性,将杂交链中的一条用某种可检测的物质标记制成探针,用来识别和检测另一条具有互补核酸序列的杂交链。由于核酸探针与互补链之间的识别作用是通过大量结合位点间的氢键作用力和碱基专一配对作用实现的,因此具有极高的特异性。

1.1　核酸探针的来源和种类

核酸探针主要有DNA 探针、RNA 探针、cDNA 探针和寡核苷酸探针等。前3种核酸探针一般是通过分子克隆获得的,称为克隆探针。寡核苷酸探针是人工合成的碱基数较少的DNA 片段,属于短链探针。寡核苷酸探针的优点是对靶序列变异的识别能力较强,因为短探针中碱基错配会导致杂交体的融链温度显著下降,而克隆探针对于单个或少数碱基不配的两个序列杂交信号差别很小,难以区分。此外,寡核苷酸探针还具有杂交时间短、可一次大量合成和成本低廉等优点。由于寡核苷酸探针序列较短,随机遇到互补序列的可能性大,所以特异性不如ΞΞΞΞΞΞ常文保:北京大学教授,博士生导师。

张新祥:北京大学教授,博士生导师。

赵美萍:北京大学副教授,博士。

大学化学

克隆探针。另外,克隆探针可标记的位点比寡核苷酸探针多,可获得较强的杂交信号,因此灵敏度较高。

1.2　核酸探针的标记

最早采用的标记方法是放射性同位素标记法,常用的放射性同位素有32P、3H和35S等。放射性同位素标记的探针灵敏度较高,但由于半衰期限制,标记后存放的时间有限,另外对操作者和环境有放射性危害,因而近年来越来越多地被非放射性标记技术所取代。非放射性标记试剂种类丰富,包括金属、荧光染料、地高辛半抗原、生物素和酶等,可通过酶促反应、光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。目前大多是先制成标记的脱氧核苷三磷酸dN TP (dA TP、d GTP、dCTP和d TTP),然后采用缺口平移法、末端标记法、随机引物法或聚合酶链反应法(PCR)等技术标记到核酸分子上。

缺口平移法的原理是用适当浓度的DNA酶Ⅰ在探针DNA双链上制造一些缺口,然后在DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′酶活性和5′→3′聚酶活性作用下,先切去带有5′磷酸的核苷酸,同时将标记的互补核苷酸(如γ232P2dA TP、bio2112dU TP等)补入缺口,两种活性的交替作用使缺口不断向3′的方向移动,同时DNA链上的核苷酸不断被标记的核苷酸所取代。

随机引物法是将DNA水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作为随机引物加到待标记DNA 探针溶液中,经变性退火后,引物与单链DNA在多处互补结合,同时在引物的3′OH端发生延伸反应,标记的单核苷酸(如bio2112dU TP)便掺入到新合成的DNA链中。

末端标记法适合标记合成的寡核苷酸探针,它是在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶(T4PN K)的催化下,将标记A TP的磷酸连接到带羟基的待标记寡核苷酸5′末端上。

PCR标记法是将标记的dN TP加到待扩增DNA溶液中,在DNA聚合酶的作用下,经过多次变性、退火和延伸过程的重复性循环,使合成的DNA片段中掺入标记物。这种标记法简便、快速、重复性好,对模板DNA纯度的要求低,适合大量制备。

1.3　核酸探针的杂交检测技术

核酸分子杂交有均相杂交和异相杂交之分。均相杂交中参加反应的两条核酸链都游离在溶液中;异相杂交则是一条反应核酸链固定在固体支持物上,另一条反应核酸链游离在溶液中,因而也叫固相杂交。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。早期建立的杂交检测方法主要依赖于固相杂交,将未杂交的游离片段漂洗除去后,膜上留下的杂交物容易检测,并能防止靶DNA自我复性,所以固相杂交至今仍为核酸探针杂交检测的主要模式。常用的固相杂交类型有:菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。近几年来,均相杂交检测技术取得了重要突破,以分子信标为代表的一系列新型探针的出现使杂交检测操作更加简便,分析速度大大提高。

1.3.1　传统印迹杂交法

传统的印迹杂交技术是典型的固相杂交检测法。在样品中,各种长短不同的DNA片段混在一起,给杂交检测带来很大困难,一般需先借助凝胶电泳将DNA片段按分子量从大到小分开,分子量相同的片段处于同一位置,有利于检出。但凝胶易碎且操作不便,为此,英国科学家Southern提出了印迹转移法,即将凝胶上的DNA片段转移(印迹)到硝酸纤维素膜上后再进行杂交检测。其基本原理是,硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强,电泳后的凝胶经过DNA变性处理后,覆以上述滤膜,滤膜上方压上多层干燥的吸水纸,借助吸水纸

对浓盐溶液的上吸作用将凝胶上的单链DNA转移到滤膜上。转移后的DNA片段相对位置保持不变,滤膜经烘烤后,DNA片段便原位地固定于膜上,这种转移方法后来就被称为South2 ern印迹法。类似地,将RNA变性后转移到纤维素膜上也可进行杂交检测,称为Northern印迹法。现在的转移方法更加多样化,除上述毛细法外还可采用电转移法和真空吸引转移法等。 作为目前的常规核酸检测方法,DNA印迹和RNA印迹法的主要缺点是操作步骤相对繁琐、费时,难以做到实时检测。新近发展的分子信标技术则克服了上述缺点,操作更加简单,还可用于活体内核酸的实时动态检测。

1.3.2　分子信标和实时荧光PCR技术

1996年,Tyagi等[7,8]提出了一种新型荧光标记的核酸探针,可以在均相体系中精确识别出特定的目标序列,并迅速发出荧光信号,使杂交和检测得以在短时间内快速完成,这类探针称为分子信标(molecular beacon)。分子信标的理论基础是荧光共振能量转移原理(fluores2 cence resonance energy transfer,FRET),即当两个荧光基团靠近时,高能量荧光团(供体)会将受激发后产生的能量转移到相邻的低能量荧光团(受体)上,FRET程度与供、受体的空间距离密切相关,一般为7～10nm时即可发生。图1是首例分子信标的结构示意图。

图1　首例分子信标的结构示意图

分子信标属于单链寡核苷酸探针,其巧妙之处在于独特的茎2环状(也称发夹型)结构。分子信标的环部含有与待测核酸链互补的序列,茎部由特征序列两侧非特异性的碱基对相互耦合形成闭合结构,在探针链的3′和5′末端分别带有一个荧光基团和一个淬灭基团。图1中的EDANS(5′2(2′2氨乙基氨基萘212磺酸))为荧光基团,DABCY L(42(4′二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸)为淬灭基团。当受到波长为336nm的紫外光激发时,EDANS发出波长为490nm的亮蓝荧光;DABCY L是非荧光分子,其吸收光谱与EDANS的荧光发射光谱重叠,因此可形成FRET体系。分子信标的检测原理如图2所示。未参加反应的分子信标由于荧光基团和淬灭基团紧靠在一起,不会发出荧光。当其在溶液中遇到含有靶序列的目标分子时,互补链间发生杂交反应,发夹结构打开,荧光基团和淬灭基团解离,于是产生荧光信号,荧光强度与溶液中靶分子的数量成正比[9]。

图2　分子信标的检测原理示意图

分子信标技术由于操作简便、反应均一,发展十分迅速并很快得到广泛应用。G iesendorf 等[10]利用分子信标检测了人甲叉四氢叶酸还原酶(M THFR)基因的点突变。M THFR基因点突变是导致心血管疾病和神经管缺陷的重要因素,研究结果表明分子信标可快速准确地对

M THFR基因点突变进行半自动化检测,并能避免核酸的交叉污染。这为致病基因点突变的自动化大规模检测奠定了基础。

唐志文等[11]利用分子信标DNA探针实现了核酸连接的实时检测。连接体系由DNA酶、两个待连接寡核苷酸和分子信标组成。其中,两个寡核苷酸连接后的产物与分子信标的环序列互补。开始时,两个寡核苷酸各自与分子信标环上和自身序列互补的一侧结合,形成中间为缺口的DNA结合物,此时分子信标的茎环结构略为张开,但并未完全打开。当DNA酶加入时,连接反应发生,缺口闭合,形成与分子信标环区完全互补的长DNA链,使分子信标完全打开,发出荧光信号。在此机制中,分子信标不仅是检测均相溶液中核酸连接的探针,也是连接过程中的两个寡核苷酸的模板。这种方法既可用来研究核酸连接的动力学,也可准确测定DNA酶的活性,对研究核酸连接和核酸之间的其他相互作用都十分有用。

利用多种不同荧光团标记的分子信标(又称多色分子信标)还可进行多元核酸分析。Tyagi[12]等建立了能同时检测4种不同逆转录酶病毒的方法。在另一项研究中,用金纳米颗粒作为淬灭剂替代常用的DABCY L,显著提高了灵敏度和特异性[13]。通过改变金属簇的形状、大小、组成等获得了一系列用于分子信标的金属淬灭剂。针对不同类型的荧光团选用不同的金属基底淬灭剂可实现不同目标物的同时定量检测。

图3　实时荧光PCR的检测原理示意图

图3是Whitcombe[14]设计的一种将PCR引物与分子信标相结合的蝎状引物荧光探针。在该探针中,PCR引物与分子信标之间有一间隔臂,使PCR反应不能往分子信标方向延伸。在PCR过程中,非特异扩增产物不会产生荧光信号,而当特异性扩增产物生成时,分子信标将立即与其进行分子内杂交,同时发出荧光信号。这种单分子内探针2目标物杂交的反应方式既解决了非特异结合问题,又突出了响应快的特点,形成的探针2目标物复合物也更稳定。这种将荧光标记探针与PCR扩增反应相结合建立的检测方法又称为实时荧光PCR技术,根据标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化可以测定PCR扩增产物的数量变化,从而达到实时检测的目的。下面的TaqMan技术和LightCycler技术是另外两种典型的实时荧光PCR检测技术。

TaqMan技术[15]是利用Taq酶的5′外切酶活性,合成一个能与PCR产物杂交的探针。探针的5′端和3′端分别标记不同的荧光分子,其中3′端的荧光分子能够吸收5′端荧光分子发出的荧光,这样在正常情况下只能检测到3′端荧光分子的荧光信号,而5′端荧光分子发出的荧光是检测不到的。当溶液中含有目标PCR产物时,探针与产物杂交,激活Taq酶的5′外切酶活性,将探针5′端连接的荧光分子从探针上切割下来,从而发出荧光。切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例,因此根据PCR反应液的荧光强度可算出初始目标产物的数量。这种方法本底相对较高,酶的性能对定量也有一定影响。

LightCycler[16]技术是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两种不同的探针上,两种探针可与目标物同一条链上相邻的两段序列杂交,其中发光探针上的荧光团标记在5′端,淬灭探针上的淬灭基团标记在3′端。当两探针与目标链杂交时,由于荧光基团和淬灭基团相互靠近发

生FRET而使荧光淬灭,荧光淬灭的程度与目标链的数量成正比,据此可以进行PCR定量分析。此方法的特点是淬灭效率高,但由于目标链上结合了两个探针,会对扩增效率造成一定影响;另外由于需要合成两个较长的探针,因此成本相对较高。

总体来说,实时荧光PCR省时,定量线性范围宽,并且减少了扩增产物受污染的可能性,因此应用前景十分广阔。

1.3.3　微阵列探针技术

微阵列探针技术也叫芯片技术,是将探针以高密度点阵的形式固定在小型固体支持物的表面,然后对待测生物样品中靶分子进行杂交检测的一种新型检出模式。它与传统探针技术的最大差别在于探针数量大、分布密集,一次可分析检测大量生物分子样品,自动化程度显著提高[17]。当固定化探针为cDNA和寡核苷酸时称为DNA芯片[18];而以多肽和蛋白质为固定化探针的芯片则称为蛋白芯片[19]。目前的大部分DNA芯片和蛋白芯片都是采用荧光标记,然后用激光共聚焦扫描仪或CCD荧光显微照相技术进行检测。这两种检测方法中,后者的灵敏度和分辨率不如前者,但检测速度较快,成本也比较低。

微阵列探针的固相载体有硅片、玻片和尼龙膜等。探针点阵可采用光导原位法合成,它是在常规DNA合成技术基础上,采用特制的多通道自动加样系统,直接在活化过的固相载体表面合成点阵排列的寡核苷酸探针,例如照相平板印刷技术(photolithography)。用此法合成的寡核苷酸芯片具有快速高效、探针密度高等优点。另一种制备微阵列探针的方法是离片合成后机械点样法,即将预先制好的单个探针用高速阵列仪机械点样,形成微阵列。这种方法制备的探针密度比前一种低,但它不仅能固定小片段核酸,还能固定基因片段、cDNA甚至蛋白质等[20]。

在现有的微阵列探针技术中,通常是对样品分子进行荧光标记,标记方式基本分为标记引物或标记核苷酸两种类型。常用的荧光标记物有荧光素、罗丹明、德克萨斯红和Cy3、Cy5(二者均为花青染料的衍生物)等。标记样品虽然相对简单易行,但标记后的靶DNA只要结合到芯片上就会产生荧光信号,而目前的检测系统还不能区分来自某一位点的荧光信号是由正常配对还是由非特异性吸附产生的,其中有无碱基错配的情形存在。为确保数据的可靠性, Hessner等[21]最近提出了用荧光标记的探针制作微阵列反应平台,这样可以在杂交反应前对点阵的形态学、DNA的固定、保留和背景荧光值等进行评估,从而消除背景影响和批间差异,使最终的杂交检测结果更为可靠。用于标记探针的荧光素与标记样品用的Cy3和Cy5在光谱性质上是相互匹配的,可用共聚焦激光扫描系统直接检测,因此该技术又称为三色cDNA微阵列检测技术。

Riccelli[22]对照研究了固定化的发夹型和线型cDNA探针捕获单链靶DNA的能力,结果表明发夹型探针比线型探针杂交速度快、与靶DNA的平衡结合容量大。而且,发夹型探针与靶DNA形成的复合物的热稳定性也比线型探针强。可见,发夹型探针在固相杂交体系中比传统的线型探针具有显著的优势。

微阵列探针技术在灵敏度、准确性和高通量检测等方面均取得了重大突破,在研究小分子2DNA相互作用、蛋白质2DNA相互作用和蛋白质功能的工作中显示出巨大的优势,对进一步了解基因功能、探明复杂的生物过程等均具有重要意义。应用微阵列探针寻找药物靶标,检查药物的毒副作用,还可省去大量的动物试验,缩短药物筛选所用时间,大大加快新药的研发进程。

2　有机小分子探针

2.1　染料探针

有机分子荧光染料除了可作为有色基团共价标记到核酸链上构成核酸探针外,还有一些可以通过嵌入、沟区或静电作用等结合方式与核酸分子相作用,实现对核酸的检测,这类有机分子染料称为染料探针。重要的染料探针有菲啶和吖啶类、吲哚和咪唑类及碳菁阳离子染料等[4]。

溴乙锭、吖啶橙及其二聚物等属于菲啶和吖啶类荧光探针,主要作为嵌入剂与DNA结合。苯酚基双(苯并咪唑)(Hoechst33258)、苯乙氧基双(苯并咪唑)(Hoechst33342)、4,62二脒基222苯基吲哚(DAPI)、4,62(二咪唑啉22)222苯基吲哚(DIPI)等是典型的吲哚和咪唑类染料。它们的膜渗透性较好,并且能选择性地结合A2T碱基对,可用于活细胞染色、细胞周期研究等。碳菁阳离子染料是较新的一类荧光染料探针,与DNA的作用方式有嵌入型、缔合型和共价键型等,结合产物的荧光强度大大增强,而与其他生物大分子的相互作用很小。碳菁阳离子染料根据所含芳香环分为苯并噻唑、苯并　唑、吲哚和苯并咪唑类等。噻唑橙和　唑橙二聚体,称为TO TO系列染料(又叫菁染料对称二聚体),主要包括TO TO、YO YO、BOBO和POPO 染料,目前认为是核酸染色最灵敏和亲和力最强的荧光探针,利用光成像和流式细胞光度法可检测由它们标记的单个核酸分子。

蛋白质荧光探针也是一类染料,吸附或共价结合到蛋白质上,会使荧光特性发生变化,从而可用于研究蛋白质的结构和测定蛋白质。已报道的蛋白质荧光探针有血管状黄素(va2 soflavine)、吖啶橙(AO)和四磺酸基酞菁2Al(Ⅲ)等。

2.2　荧光钙螯合剂探针

细胞内游离Ca2+浓度的测定和调控对认识各类细胞的生理活性具有重大意义,以EGTA (乙二醇2双(22氨基乙醚)四乙酸)为选择性螯合剂合成的一系列荧光钙探针试剂在无损伤测定单细胞内游离Ca2+浓度方面发挥了重要作用[23]。典型的荧光钙螯合剂探针有Fura2、Flu2 o3、Indo1和钙绿等[4,24,25]。图4为Fura2和Fluo3的结构式。

图4　Fura2和Fluo3的结构式

为使探针容易穿过细胞膜进入细胞,现在多使用它们酯化后的形式以增加探针的脂溶性,如Fluo32AM为(42(62乙酰氧甲氧基22,72二氯232氧292氧杂蒽基)24′2甲基22,2′(乙烯二氧)二苯胺2N,N,N′,N′2四乙酸四(乙酰氧甲基)酯。探针在进入细胞前,钙结合部位由于酯化而被保护起来,当探针进入细胞后,酯基团在细胞液内酯酶的作用下水解转化成对Ca2+敏感的羧

酸形式,从而实现对Ca 2+的选择性检测[26]。图5为荧光钙探针检测嗜中性粒细胞中Ca 2+的过程示意图。

根据检测波长的特点,荧光Ca 2+探针可分为单波长检测型和双波长检测型两类。Fluo3和钙绿属于单波长探针,激发波长都是506nm ,发射波长分别为526nm 和531nm ,二者与Ca 2+结合后发射强度显著增加,根据荧光强度的变化和Ca 2+2探针螯合物的解离常数,利用质量作用定律可以计算出游离Ca 2+的浓度。但是,这种只靠荧光强度的变化来确定Ca 2+浓度的方法有时会由于细胞形状和细胞间差异等因素造成的信号不同而引入较大误差。双波长Ca 2+探针则可以克服上述不足。以Fura2为例,其激发波长为340/380nm ,发射波长为505nm 。与Ca 2+结合后,激发光谱发生位移,因此可分别测到游离探针和Ca 2+2探针螯合物的荧光信号。由于两个信号都与细胞厚度和探针数量等因素有关,取二者之比则可消除这些因素的影响。进一步计算可确定与这一信号比相对应的细胞液内原游离Ca 2+的浓度。而单波长探针需要借助共聚焦成像技术才能给出较为可靠的结果[26]。

图5　荧光钙探针检测嗜中性粒细胞中C a 2+的过程示意图 氯四环素(CTC )是最早用于测量细胞液游离Ca 2+

的荧光螯合剂[27]。由于本身亲脂性强,CTC 易穿过细

胞内膜并很快分布均匀,但与Ca 2+结合后,无法再穿

过膜扩散,因而现在多用于标识Ca 2+的储存部位[28]。

FFP 218是在Fura2分子上加上长疏水链后得到的探

针,该探针易在细胞膜聚集,可用来监测细胞膜附近

Ca 2+的变化[29]。以上各种荧光钙探针的检测机制均

示于图5中。

郭传勇等[30]采用Fura22AM 荧光钙探针测定成纤

维细胞(HL F )内的Ca 2+浓度,研究了内皮素对HL F 细

胞内Ca 2+浓度的影响,发现内皮素可在短时间内显著

提高HL F 细胞内的Ca 2+浓度,且有明显的剂量依赖关系。测定结果表明,当细胞外液含Ca 2+时,HL F 细胞内的Ca 2+浓度明显高于细胞外液无Ca 2+存在时细胞内Ca 2+的浓度。并且在细胞外液无Ca 2+存在的情况下,内皮素也可使细胞内的Ca 2+浓度有所升高。这些结果指出内皮素在体内激发产生的物质可促进细胞内的线粒体和内质网等贮钙系统释放Ca 2+,也可促进细胞膜上钙通道开放,使细胞外钙流入细胞造成细胞内Ca 2+浓度升高。

2.3　光散射探针

光散射染料探针大多为三苯甲烷类,如溴酚蓝、铬天青、铝试剂和四碘酚磺酞等均属于非联苯型三苯甲烷试剂;溴连苯三酚红、茜素紫和茜素菁绿等属于联苯型染料。一些水溶性卟啉试剂(TCPP )和偶氮类试剂也具有光散射染料探针的性质。这类探针的共同特点是含有带电荷的亲水性基团(如酚羟基、羧基或磺酸基)及不带电的疏水基团,与蛋白质之间以非共价键形式结合,根据光散射信号的增加可实现对蛋白质的测定。另外还可用来测定金属和核酸。

2.4　大环化合物探针

一些大环化合物如冠醚、大环多胺和杯芳烃等以金属离子2配体和金属离子结合位点组装等作用方式,对某些有重要生理意义的阳离子表现出高选择性识别能力,可作为相应金属活性阳离子的检测探针。

3　金属离子探针

利用过渡金属离子作为离子探针,可通过光谱和波谱手段检测某些重要生物大分子中所含金属离子所处的构象、价态、环境和对称性等性质,探明其在生命过程中的重要功能。离子探针的关键在于替换生物分子中原金属离子后,仍能保持生物大分子的基本活性,并具有特征的检测信号。离子探针既包括游离(水合离子)形式,也可以是络离子形式。根据检测信息的特征可分为紫外可见吸收探针、磁共振探针、荧光光谱探针、圆二色谱探针和M ?ssb uer 探针等。

三价镧系稀土离子Tb (Ⅲ

)和Eu (Ⅲ)的水溶液均有荧光,且灵敏度很高,是一类重要的生物大分子荧光探针。由于稀土荧光探针谱线窄、寿命长(稀土荧光寿命通常为10～1000

μs ,而生物样品本底荧光寿命只有1～20ns ),非常有利于消除生物样品的背景干扰,因而在生物、药

物分析中得到广泛应用[4,31,32]。用Tb (Ⅲ

)和Eu (Ⅲ)作为荧光探针,可研究蛋白质的构象,确定生物大分子中金属离子的结合部位、生色基团与金属离子结合部位间的距离,获得有关生物大分子结构的许多有用信息[4,33]。

稀土离子与有机小分子配位体形成络合物后,激发态寿命进一步增加,荧光强度也增加。ED TA 和HEDDA (N ,N 2二(22羟乙基)乙二胺2N ,N 2二乙酸)等氨羧类络合剂、水杨酸等芳香羧

酸类络合剂及β2二酮类螯合剂等均可作为稀土离子的配位体。Tb (Ⅲ

)2ED TA 络合物体系已被用于检测水杨酸及其衍生物[34]和儿茶酚胺及相关化合物[35]。用稀土络合物标记抗原或抗

体,可获得一系列重要的荧光免疫探针,其中的双功能螯合剂稀土络离子探针(例如Eu (Ⅲ

)2对异硫氰酸苄基2DD TA 络离子、Eu (Ⅲ

)2二乙烯三胺五乙酸酐(D TPAA )和Eu (Ⅲ)22,42二氟242羟基232联苯羧酸(DIF )等)已成为标记抗原和抗体应用最多的荧光标记试剂。利用这些稀土荧光探针长寿命的特点,现已发展建立了多种时间分辨荧光免疫方法,并在临床检验中得到应用。

由于各镧系元素的发光波长不同,有时可将两个或多个不同的镧系元素标记物用于多元图6　二元免疫检测模式示意图　

免疫分析,同时检测不同的分析物。图6为以Tb 和Eu 的螯合物作为标记物建立的二元免疫检测模式示意图。Xu [36]等用Tb 、Eu 、Sm 和Dy 的螯合物标记探针,在一次分析中同时检测了肌酸激酶、17α2羟孕酮、免疫反应性胰岛素和促甲

状腺激素等4种彼此不相干的物质。利用镧系元

素螯合物的混合物进行多元标记的免疫分析方法

目前在临床分析中应用较多。实际上,这类探针

技术在环境和食品样品分析方面都具有巨大的应

用潜力。

稀土络离子还可作为核酸探针的标记物,建

立时间分辨荧光核酸探针检测技术。本研究组曾

用Tb (Ⅲ

)与邻二氮菲的络合物建立了测定核酸和核苷酸的方法[37,38];另外还发现Eu (Ⅲ

)2四环素络合物能选择性检测有RNA 共存时的天然和

变性DNA 的含量[39]。

除稀土络离子荧光探针外,常见的过渡金属

络离子如Pt(Ⅱ)和Ru(Ⅱ)等可作为发光探针或荧光探针,通过嵌入方式键合到DNA或RNA 分子上,称为金属嵌入剂,是一类重要的离子探针[4,40]。Ru(bpy)2(dppz)2+(bpy为2,2′2联吡啶;dppz为二吡啶[3,22a:2′,3′2c]并吩嗪)对核酸表现出优良的络离子荧光探针性能,被称为DNA分子的光开关(light switch)。Os(Phen)2(dppz)2+(Phen表示邻二氮菲)是在前者基础上合成的另一种DNA分子的光开关,是惟一在红外光区发射荧光的DNA探针。某些金属离子与卟啉的络合物也能通过嵌入的方式与蛋白质和DNA相互作用,成为一类有用的金属络离子探针。

生化探针的未来发展方向是继续开发适合更多目标物的探针分子,而进一步研究和简化探针的合成技术可以说是推动其从实验室走向普及性实际应用的关键所在。尽管目前已经有一部分商品化的探针试剂,但由于合成步骤复杂,成本较高,探针试剂的价格相当昂贵,离大批量推广应用还有相当长的距离。而其他大多数探针技术现在也还是停留在实验室研究阶段。另外,针对不同的样品体系,标记和检测过程还需要进一步探索和优化,使探针技术不仅能用于临床检验和新药开发,在环境监测和食品检验等方面也能发挥快速、灵敏和高通量的优势。作为一种简便快捷的检测手段,生化探针技术必将为医学、生命科学、药物学、环境科学和食品安全控制等领域的研究工作带来极大的便利。

参　考　文　献

1　周爱儒.生物化学.第5版.北京:人民卫生出版社,2001

2　王镜岩,朱正庚,徐长发.生物化学.第3版.北京:高等教育出版社,2002

3　蔡文琴,王伯　.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都:四川科学技术出版社,1994

4　张华山,王红,赵媛媛.分子探针与检测试剂.北京:科学出版社,2002

5　王申五.基因诊断技术———非放射性操作手册.北京:北京医科大学2中国协和医科大学联合出版社,1992

6　Wang E R,夏令伟.核酸探针的合成、标记及应用.北京:科学出版社,1998

7　Tyagi S,Kramer F R.N at Biotechnol,1996,14:303

8　陈忠斌,王升启,孙志贤.生物化学与生物物理进展,1998,25:488

9　Broude N E.T R ENDS Biotechnol,2002,20:249

10　G iesendorf B A,Vet J A,Tyagi S,et al.Cli n Chem,1998,44:482

11　Tang Z,Wang K,Tan W,et al.N ucleic Aci ds Res,2003,31:e148

12　Tyagi S,Bratu D P,Kramer F R.N at Biotechnol,1998,16:49

13　Dubertret B,Calame M,Libchaber A J.N at Biotechnol,2001,19:365

14　Whitcombe D,Theaker J,Guy S P,et al.N at Biotechnol,1999,17:804

15　Mackay I M,Arden K E,Nitsche A.N ucleic Aci ds Res,2002,30:1292

16　Wittwer C T,Ririe K M,Andrew R V,et al.Biotechniques,1997,22:176

17　Schena M,Shalon D,Davis R W,et al.Science,1995,270:467

18　Perraut F,Lagrange A,Poteau P,et al.Biosensors Bioelect ron,2002,17:803

19　Kukar T,Eckenrode S,Gu Y R,et al.A nal Biochem,2002,306:50

20　王立强,陆祖康,林斌.光学仪器,2002,24:74

21　Hessner M J,Wang X J,Hulse K.N ucleic Aci ds Res,2003,31:e14

22　Riccelli P V,Merante F,Leung K T.N ucleic Aci ds Res,2001,29:996

23　陈震华,何季平,胡缙昌.分析科学学报,1993,9:73

24　Minta A,Kao J P Y,Tsien R Y.J Biol Chem,1989,264:8171

25　Kao J P Y,Harootunian A T,Tsien R Y.J Biol Chem,1989,264:8179(下转第23页)