酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理

1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：

(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。

(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。

(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

二.所用的载体及相关信息

1. pGBKT7载体的图谱和相关信息

The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).

b. pGADT7载体的图谱和相关信息

pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.

三．实验主要流程

A.需要准备的药品和设备

1.两种酵母菌种(AH109,Y187)

2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acids

Agar (for plates only)

sterile 10×Dropout Solution

单缺-T,-L(clontech公司)

二缺-T/-L (clontech公司)

四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)

3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer

10×LiAc

40%PEG

carrier DNA

4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL

5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱

30℃摇床.

水浴锅

分光光度计

B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

1．纯化基因片段。

2．用相应的酶对DNA-BD载体进行酶切和纯化。

3．连接酶切片段和载体，转化到E.coli 。

4．通过内切酶分析或PCR对载体进行分析鉴定。

以上步骤基本同一般载体的构建。

C. BD自激活作用的检测。

1.把载体转化到AH109和Y187中。

把转化产物在三种培养基中生长,用空的DNA-BD载体作阴性对照。

SD/-Trp/x-ａ-Gal、

SD/-His/-Trp/x-ａ-Gal、

SD/-Ade/-Trp /x-ａ-Gal。

2.分析结果

如果转化克隆是蓝色，在SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp 上可以生长，说明其自身激活报告基因转录，则不能用做诱饵蛋白。

D.融合蛋白毒性的测试

比较带有DNA-BD 融合蛋白载体和空的DNA-BD 载体的Y187和AH109的转化子菌系在液体培养中的生长效率。如果bait菌系生长速率要明显慢很多，则此bait蛋白可能有毒性。

在SD/-Trp上筛选，如下准备过夜培养:

挑一个较大的克隆（2-3mm）在50ml SD/-Trp/Kan（20 ug/ml）培养液中生长。30°，250-270rpm培养16-24h。

检查培养液的OD600值，它应当〉0.8。若小于，则DNA-BD fusion可能有毒性。如果没有妨碍生长，则是非毒性的，可以用来做双杂交筛选。

E.酵母的小规模转化方法

1.在1ml的YPD培养基中，接种酵母AH109(或Y187)。

2.震荡，打散细胞。

3.将细胞转移到20mlYPD中，锥形瓶的规格为250ml比较合适，较多地空气有利于酵母生

长。30℃振荡培养12小时，OD600>1.6 /不大于2.0即可。

4.取合适的菌液至100mlYPD中，使OD600在0.2-0.3之间。

250rpm振荡培养3小时，直到OD600在0.4-0.6之间。

5.菌液移入50ml离心管中，室温下1000g,离心5分钟。

6.去上清，用25ml无菌水重悬细胞。

7.室温下1000g,离心5分钟。再去上清液，用1.5ml 1×TE/1×LiAc轻轻重悬细胞，制成感

受态酵母菌。

8.分装感受态细胞，100μl为一管。在每管中加入0.1μg的carrier DNA和0.1μg目的质

粒。轻轻混合均匀。

9.加入0.6mlPEG/LiAc，高速振荡10秒钟。

10. 30℃,250rpm摇床,摇30分钟。

11.每管加入70μl的DMSO,轻轻的混匀,不要剧烈震荡。

12.在42℃水浴锅中,热激15分钟。

13.在冰上冷却1—2分钟。

14.在室温下.14000rpm高速离心5秒,去上清液。

15.用0.5ml的1×TE buffer悬浮细胞。

16.以适量的菌液涂平板,在30℃下,培养2-4天。

F.转化效率的计算

数出稀释平板上的克隆数目：克隆数*1000=#转化数/3ug 载体。

预期结果：〉1×106转化数/3ug 载体。

G.酵母质粒的抽提

1．细胞沉淀在250μl 抽提液中悬浮

2．加入20μl 0.45-0.55mm玻璃珠，重复悬浮震荡。

3．加入250μl 酚：氯仿，混匀。

4．15000g，离心3min。

5．取上清，加入3倍体积无水乙醇，混匀。

6．15000g，离心5min。用70%乙醇洗涤沉淀。

7．20μl无菌水溶解。

质粒抽提液：10 mM Tris-Hcl，1 mM EDTA，200 Mm NaCl，PH8.0

四.几个重要的问题的说明和一些实验中的心得体会

注意问题一: 载体的构建需要考虑到移码问题。

在酵母双杂中，所用到的蛋白都是融合蛋白，基因本身的起始密码子A TG是不起作用的,所以特别要考虑到移码问题。无论是AD-基因，还是BD-基因，都是如此。在融合蛋白之间可以有一段连接序列，但必须是三的倍数，确保目的基因在表达时不会移码。

注意问题二：酵母感受态制备的心得。

酵母感受态的制备是个很重要和精细的过程。感受态的状态不佳，极大地影响到酵转化的效率。这里有两点要注意。

a.原始菌种接种的量。

在1ml YPD培养基中，接种AH109的克隆时，大于2-3mm的大克隆，接种一个；大小在2-3mm之间的克隆，接种2-3个；小于2mm的克隆，不能用于正常的接种，重新划板活化之后再行接种。

b.酵母转接时的OD值掌握。

对数生长期的酵母菌转接到100ml的YPD中，经验量:

1.6OD600 的原菌液，取4ml左右。

2.0OD600 的原菌液，取4ml左右。

OD600 大于2.0，原菌液就不能使用了，影响活性。

注意问题三：PEG浓度的改良。

一般经典的酵母操作手册上，在酵母转化时，用到的PEG的浓度都是40%。经过我的多次试验，40%的PEG所得到的转化效率不是最高的，35%的浓度为最好。

其配方改良如下：

PEG 50% 8ml 改良为PEG50% 7ml

10×LiAC 1ml ----------------------------- 10×LiAC 1.5ml

10×TE 1ml 10×TE 1.5ml

降低5% PEG浓度可以提高转化效率。

注意问题四：转化所用的质粒的量。

在酵母转化的时候，所用质粒的浓度和纯度都是很重要的指标。经验浓度为200ng/μl 以上，纯度则是尽可能的高。质粒的总量需要在1μg 以上。

注意问题五：AH109,Y187酵母菌种的保存和使用问题。

酵母的菌种长期不用的保存在-80℃冰箱中。但经常要使用的菌种保存在4℃冰箱的平板上最好。把克隆长到3mm大小的酵母菌种平板保存在4℃冰箱里，要用时就可以随时挑克隆了。但平板的保存时限为一个月，每个月需要重新划线转移一次平板，以保证其活性。直到酵母相关实验全部完成为止。

注意问题六：酵母菌落的颜色问题。

正常的酵母菌落颜色是纯白色的，但经过转化的酵母常常带有一定的微红色。Y187的菌种基本不会变红，颜色是正常的。而AH109的菌种中Ade 基因容易突变，从而导致酵母颜色的改变。但微红色的酵母基本上不影响下一步的操作。AH109经过酵母单转化之后，在平板上会有微红色，但共转化之后就没有红色了。

注意问题七：酵母双杂Mating的时间掌握。

一般认酵母双杂Mating的时间为16-24个小时。我经过试验，Mating的时间上限为28

个小时，下限为14个小时。以18个小时为最佳，低于14个小时的Mating是一定失败的。酵母Mating的时间，是一个重要的试验参数。

注意问题八：pCL1，pGBKT7-T和pGBKT7-53的阳性对照的问题。

pCL1载体不能用做互作对照，互作对照使用BKT7-T和pGBKT7-53。同时转入后个载体的酵母可以在相应的营养缺陷型培养基上生长。

注意问题九：酵母的显色问题。

蛋白互作到一定程度的酵母菌，可以在涂有x-α-Gal的平板上显色。这里所用的显色剂是x-α-Gal。而我们平时在大肠杆菌的蓝白斑筛选的时候所用的是x-β-Gal。两者的价格和作用相差很大，不能混用。

注意问题十：酵母的划线问题。

最后得到的结果，是要在平板划线拍照的。划线的质量好坏，严重的影响了结果的美观，同时也使结果的可靠性受到质疑。

划线使用的酵母菌液需要测量OD值，OD600值在0.5时划线最合适。低于0.5的菌液往往造成划线的不连续，太高的菌液会使克隆长成一团，看不到清晰的酵母菌落。

中考理化生实验操作考试方案(草稿)

中考理化生实验操作考试方案 市教育局有关初中毕业生升学及学业水平测试理科实验操作考查的精神，为做好2013年全市初中毕业生升学理化生实验操作考查工作，特制订本《实施方案》。 一、组织领导 实验操作考试工作在市、县市区教育局及全市高中阶段学校招生工作领导小组的统一领 导下，由市、县教育局具体组织实施。 二、考试范围、内容、对象 考试范围：依据《义务教育课程标准》，考查范围为学生初中阶段应掌握的分组必做实验 内容与基本实验操作规范，用开放性和探究性题目考查学生动手实践和解决问题的能力。理化生试题各1套，每科满分为10分，每套试题含6个不同实验内容、实验操作难度系数基 本相同、考查时间相同的考查题目，共18个实验考查题目。 考试内容：主要考查学生实验仪器的认识、装配、操作，实验设计，实验现象观察、数 据记录、实验结果表述等。 考试对象：2013年初中毕业生。 三、考试办法 1．由市教育局统一命题、制卷。命题将突出新课程标准教学理念，重点考查学生实验设计、实验探究、实验操作过程的规范。 2．由县市区教育局派出考务组到各考点组织学生现场测试，考生抽签确定实验测试项目；县市区考生由所在县市区教育局组织考试，市直由市教育局组织考试；考试实行封闭管理。 四、时间安排 1．4月20日前组织考生报名，以县市区为单位将参考人数报市教育局中教科；4月25日前完成考点资格审查并上报考点名单；5月4日各县市区到市教育局中教科领取试卷及考 试用品、材料；5月5日培训监考教师，5月6日至25日为全市统一考试时间。 2．考生实验操作考试时间为每场15分钟，间隔5-10分钟，每天考试场次由考务组依据 考点考生人数确定。 五、考前准备 1．报名、办理准考证 报名以学校为单位组织，4月20日前，各学校填写《佳木斯市2013年初中毕业生升学实验操作考试报名、成绩登记册》（一式3份），交县市区教育局中教科。报名时应注意与文

酵母表达系统使用心得

Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的

化学实验室基本操作中的注意事项

化学实验室基本操作中的注意事项 中学化学实验基本操作中的高考考点较多，为便于系统复习和认真掌握化学实验操作，现总结八点注意事项，以期对同学们有所帮助。 一、注意事“先后”顺序 1．组装仪器顺序：先零后整，由低到高，由左到右，先里后外，拆装置与之顺序相反。 2．加热器试管时，先均匀加热，后局部加热。 3．制取气体时，先检查装置的气密性，后装入药品。 4．使用容量瓶、分液漏斗、滴定管前先检查是否漏水，后洗涤干净。 5．用排液法收集气体时，先移导管后撤酒精灯。 6．用石蕊试纸、淀粉碘化钾试纸、醋酸铅试纸气体性质时，要先用蒸馏水将试纸润湿。再将试纸靠近气体检验。而用pH试纸时，要先用玻璃棒蘸取待测液少许滴到放在表面皿中央的干燥pH试纸上，再与标准比色卡比较。 7．中和滴定实验时，用蒸馏水洗净的滴定管、移液管要先用待盛液洗涤2~3次后，再盛装试液。注入滴定管中的液体液面开始在“零”刻度或“零”刻度以下。 8．点燃可燃性气体时，应先验纯后点燃。净化气体时，应先净化后干燥。

9．焰色反应试验中，每做一次，铂丝都应当先蘸取浓盐酸放在火焰上灼烧至无色后再做下一次。 10．配制一定物质的量溶液时，溶解或稀释后溶液应冷却再移入容量瓶。 11．气体在热固体表面时，应先将气体干燥后反应。 12．硫酸沾到皮肤上，先迅速用干布擦去，再用水冲洗，千万不得先用水冲洗；碱液沾到皮肤上，立即用较多水冲洗，再涂上硼酸溶液。 二、注意“数据”归类 1．托盘天平的准确度为0.1g；在测定晶体中结晶水含量时，为保证加热过程中使结晶水全部失去，实验中需加热、称量、再加热、再称量，直到最后两次称量不超过0.1g。 2．滴定管的准确度为0.01mL。 3．酒精灯内酒精的量不能少于容积的1/3，也不能多于2/3。4．试管在加热时，所盛液体不能超过试管容积的1/3；且要与桌面成45°角。用试管夹夹试管时应夹在离管口1/3处。 5．烧杯、烧瓶加热时，盛液体量均在容积的1/3~2/3处，蒸发皿加热液体时，盛液体量不宜超过容积的2/3。 6．液体取用时，若没有说明用量，一般取1~2mL。 7．配制一定的物质的量浓度溶液时，烧杯、玻璃棒要洗2~3次，用烧杯往容量瓶中加蒸馏水时，一般加到距离刻度线和1~2mL处，再用胶头滴管定容。

(完整word版)2017实验学校理化实验操作测试工作方案

2017年会昌实验学校理化实验操作考试工作方案 为认真贯彻落实会昌县教育局《关于做好2017年中考物理、化学实验操作考查工作的通知》精神。为了确保考试的顺利进行及安全有序，特拟定会昌实验学校理化实验考试方案。 一、工作领导小组 组长：刘旭东 副组长：许德友张会明何勋邹新华蓝晶晶 成员：初三年级组成员、总务处负责人、校务办负责人、校医、各班班主任、全体理化教师、学校保卫值班人员及值周值日教师。 二、实验考试地点及时间： 物理：考场物理实验室2 侯考室：物理实验室1 化学：考场化学实验室2 候考室：生物实验室2 时间：5月22至23两天（周一、周二） 三、具体分工及主要职责 总协调：邹新华 总体负责：郑志华 各班联系人：班主任 考场布置： 胡小荣、姚立军分别组织负责物理、化学侯考室的布置。5 月19日前，胡小荣、姚立军牵头、其他理化教师协助负责物理、化学考场内实验器材和药品的分组准备布置。 候考联络组：

职责：侯考室负责各班学生考试联系、学生实验顺序抽签、纪律秩序维护、实验中应注意的事项告知等。 物理：刘香荣（组长）柯小冬吴才长刘则萍余永真 化学：吴林飞（组长）张慧慧章珏曾金凤张臣唐三根 后勤保障组：王金生、汪罗发、周玲徐翠花（开水） 保卫组：邹剑及保卫值班人员 四、考前工作安排 1、各班务必在5月18日前完成所有考试题目的训练，并指出学生在理化集训中出现的操作问题。 2、请各班相关理化老师给学生并负责好考前对学生的叮嘱交代。 3、班主任利用考试当天早读课开好考务会，强调纪律和安全，并认真学习理化实验操作考试实施细则。 五、考试期间，具体工作安排： 1、所有考生在班级上课等待考试，没有安排考试的班级在教室按课表上课。班主任随时等候联络员的电话，期间班主任确保通信畅通；轮到考试的班级，班主任服从安排带好本班学生到指定地点候考并按顺序排好队，负责清点人数，发放准考证，组织学生入场。8：00开始考试。 2、行走路线：物理从综合楼东边楼梯上，化学从综合楼西边楼梯上，考完后统一从综合楼中间楼梯下。 3、考试完毕，全体学生有序回教室上课，然后等待下一科目考试。 4、考试具体安排：

毕赤酵母实验操作手册簿

毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制

化学实验操作注意事项

化学实验操作的注意事项 ?化学实验操作应遵循的七个原则： 1.“从下往上”原则。 2.“从左到右”原则。装配复杂装置应遵循从左到右顺序。 如上装置装配顺序为：发生装置→集气瓶→烧杯。 3.先“塞”后“定”原则。 4.“固体先放”原则。 5.“液体后加”原则。 6.先验气密性(装入药口前进行)原则。 7.后点酒精灯(所有装置装完后再点酒精灯)原则。 ?化学实验中的“七个关系” （1）先后关系 ①向试管中装人固体粉末时，先将试管倾斜，把盛药品的药匙送至试管底部，然后让试管直 立，使药品全部落到试管底；向试管中放入块状固体时，先把试管横放，用镊子把药品放在试管口，然后将试管慢慢竖立起来使固体缓慢落到试管底。 ②用胶头滴管吸取少量液体时，先在滴瓶外面挤压胶头排出滴管内的空气，然后再伸入滴瓶 内松手吸取液体。 ③用托盘天平称量药品时，先游码归零，再调节平衡，然后称量。 ④给玻璃仪器加热时，先把仪器外壁擦干，然后再加热。 ⑤给试管中的药品加热时，先使试管均匀受热，然后对盛放药品的部位固定加热。 （2）左右关系 ①用托盘天平称量药品时，药品放在左盘，砝码放在右盘。 ②连接实验装置时，应按从左到右(或自下而上)的顺序进行，拆除时顺序相反。 ③橡胶塞和橡胶管与玻璃管连接时，左手拿橡胶塞或橡胶管，右手拿玻璃管(玻璃管一端用 水润湿)；给容器塞橡胶塞时，左手拿容器，右手拿塞子。 （3）上下关系 ①给试管中的固体加热时，试管口应略向下倾斜；给试管中的液体加热时，试管口应向上倾 斜(与桌面大约成45。角)。 ②用试管夹夹持试管时，应从试管底部向上套，夹在试管的中上部。 ③手拿试剂瓶倾斜液体试剂时，应让标签向上对着手心。 （4）正倒关系 ①取试剂瓶里的药品时，拿下瓶塞，倒放在桌上。 ②用胶头滴管取完液体时，胶头滴管应该正放 (保持胶头向上)，而不能倒放或平放。 （5）多少关系

高中化学试验方法与注意事项

高一化学(必修1)人教版各章知识点归纳（期末复习） 第一章从实验学化学 第一节化学实验基本方法 一．化学实验安全 1．遵守实验室规则。 2. 了解安全措施。 （1）做有毒气体的实验时，应在通风厨中进行，并注意对尾气进行适当处理（吸收或点燃等）。进行易燃易爆气体的实验时应注意验纯，尾气应燃烧掉或作适当处理。 （2）烫伤宜找医生处理。 （3）浓酸沾在皮肤上，用水冲净然后用稀NaHCO3溶液淋洗，然后请医生处理。 （4）浓碱撒在实验台上，先用稀醋酸中和，然后用水冲擦干净。浓碱沾在皮肤上，宜先用大量水冲洗，再涂上硼酸溶液。浓碱溅在眼中，用水洗净后再用硼酸溶液淋洗。 （5）钠、磷等失火宜用沙土扑盖。 （6）酒精及其他易燃有机物小面积失火，应迅速用湿抹布扑盖。 3．掌握正确的操作方法。例如，掌握仪器和药品的使用、加热方法、气体收集方法等。 二．混合物的分离和提纯 1．过滤和蒸发 实验1—1 粗盐的提纯 仪器：天平，烧杯，玻璃棒，漏斗，铁架台，铁圈步骤： 注意事项： （1）一贴，二低，三靠。 （2）蒸馏过程中用玻璃棒搅拌，防止液滴飞溅。

2．蒸馏和萃取 3．（1）蒸馏 原理：利用沸点的不同，处去难挥发或不挥发的杂质。 实验1---3 从自来水制取蒸馏水 仪器：温度计，蒸馏烧瓶，石棉网，铁架台，酒精灯，冷凝管，牛角管，锥形瓶。 操作：连接好装置，通入冷凝水，开始加热。弃去开始蒸馏出的部分液体,用锥形瓶收集约10mL液体,停止加热。 现象：随着加热,烧瓶中水温升高至100度后沸腾,锥形瓶中收集到蒸馏水。 注意事项： ①温度计的水银球在蒸馏烧瓶的支管口处。 ②蒸馏烧瓶中放少量碎瓷片-----防液体暴沸。 ③冷凝管中冷却水从下口进，上口出。 ④先打开冷凝水，再加热。 ⑤溶液不可蒸干。 (2)萃取 原理：用一种溶把溶质从它与另一溶剂所组成的溶液里提取出来。 仪器：分液漏斗, 烧杯 步骤：①检验分液漏斗是否漏水。 ②量取10mL碘的饱和溶液倒入分液漏斗, 注入4mLCCl4,盖好瓶塞。 ③用右手压住分液漏斗口部, 左手握住活塞部分, 把分液漏斗倒转过来用力振荡。 ④将分液漏斗放在铁架台上,静置。 ⑤待液体分层后, 将分液漏斗上的玻璃塞打开,从下端口放出下层溶液,从上端口倒出上层溶液. 注意事项： A．检验分液漏斗是否漏水。 B．萃取剂：互不相溶,不能反应。 C．上层溶液从上口倒出,下层溶液从下口放出。 三．离子检验 四．除杂 1．原则：杂转纯、杂变沉、化为气、溶剂分。 2．注意：为了使杂质除尽，加入的试剂不能是“适量”，而应是“过量”；但过量的试剂必须在后续操作中便于除去。

毕赤酵母发酵手册

毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参

设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。

溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。

初中化学实验操作与注意事项完整版

类仪器名称 别 试管 (平口、翻 可口、具支) 直 接 坩埚 加 (坩埚钳、 热泥三角、 三脚架) 蒸发皿 燃烧匙 烧杯 隔 网 可 烧瓶： 可分为圆加 底烧瓶、平 热底烧瓶和 蒸馏烧瓶。 注意圆底 烧 瓶与蒸馏 烧 瓶的区别。 锥形瓶 不集气瓶 能 加 热滴瓶 试剂瓶 化学实验常用仪器 一、常用仪器的名称、用途、使用注意事项 主要用途使用方法和注意事项 用来盛放或溶解少①可直接加热，用试管夹夹在距试管口1/3 量药品、常温或加热处。 情况下进行少量试②放在试管内的液体，不加热时不超过 剂反应的容器，可用试管容积的l/2，加热时不超过l/3。 于制取或收集少量③加热后不能骤冷，防止炸裂。 气体。④加热时试管口不应对着任何人；给固 体加热时，试管要横放，管口略向下倾斜。主要用于固体物质 一般为瓷质。把坩埚放在三脚架上的泥 三 的高温灼烧。角上直接加热。取、放坩埚时应用坩埚 钳。定量实验时应在干燥器中冷却。 蒸发或浓缩溶液或可直接加热，但不能骤冷。 结晶。盛液量不应超过蒸发皿容积的 2/3， 结 晶时，近干时可停止加热。 取、放蒸发皿应使用坩埚钳。加热后的 蒸发皿要放在石棉网上冷却。 少量固体燃烧的反 应器。 用作配制溶液和较 加热时应放置在石棉网上，使受热均 匀。 大量剂量的反应容溶解物质用玻璃棒搅拌时，不能触及杯 器，在常温或加热时 壁或杯底，反应液量不超过容积 的2/3，加使用。（水浴加热）热时不超过1/2。 须注意常用规格的选用（如配100mL 溶液）。 用于试剂量较大而圆底烧瓶和蒸馏烧瓶可用于加热，加热 又有液体物质参加时要垫石棉网，也可用于其他热浴（如 反应的容器，可用于水浴加热等）。 装配气体发生装置。液体加入量不要超过烧瓶容积的2/3, 加 蒸馏烧瓶用于蒸馏热时不少于烧瓶容积的1/3，蒸馏时温度 以分离互溶的沸点计水银球应放在支管口处并加碎瓷片防 不同的物质。暴沸。 中和滴定反应器及液体不超过容积的1/3，中和滴定时应 蒸馏接受器。用右手振荡，（且只振荡不搅拌）。 收集或贮存少量气 瓶口磨砂，用磨砂玻片涂凡士林封盖。 燃 体及气体间的反应，烧时有固体生成时，瓶底应加少量水或 安全瓶、量气装置。铺少量细砂，不能加热，盛不同密度的 气体放置时瓶口方向不同。 须防止倒吸。 盛少量液体药品。见光易变质的试剂装入棕色瓶，带有 玻璃塞的试剂瓶不可装强碱性试剂；滴 管不能互换，倾倒液体时标签向手心， 滴瓶不存放强挥发性腐蚀性试剂（浓 溴水、浓硝酸等）。 广口：盛固体药品 棕色瓶盛见光易变质药品；盛碱液时应 橡

高中化学18实验基本操作及物质检验和提纯(教师版)

一、常见实验仪器的用途及使用 类别名称适用范围使用规范及主要注意事项 可直接加热的容器 试管少量物质溶解、反应、集气 加热前先预热，外壁无水，盛液不超容积 1／3 坩埚固体物质的高温灼烧取下的热坩埚要放在石棉网上冷却 蒸发皿溶液蒸发、浓缩、结晶盛液不超容积2／3，搅拌、余热蒸干 垫石棉网加热的容 器 烧杯较大量物质溶解、盛装、反应加热前外壁无水，盛液不超容积2／3 烧瓶较大量物质反应、加热、制气加热前外壁无水，盛液不超容积l／2 锥形瓶便于振荡的反应器；盛液；制气滴定时只振荡，不搅拌；其余同烧瓶 不能加热的容器 集气瓶集气、试验气体性质磨砂瓶口应配上磨砂玻璃片 试剂瓶广口瓶盛固体；细口瓶盛液体盛避光药品用棕色瓶；盛碱用橡皮塞滴瓶盛少量液体，便于移取滴加滴管专用，不必清洗；其余同细口瓶水槽排水集气不宜盛放热水 启普发生 器 固一液不加热制多量难溶气体先查气密性；不适用大量放热的反应 漏斗类 漏斗过滤；向小口径容器注入液体过滤时应“一贴二低三靠” 长颈漏斗装配反应器，添加液体长管末端插入液面以下，形成“液封” 分液漏斗装配反应器；分离不相溶液体关闭活塞能防止反应器内气体逸出 量筒粗略量取一定体积的液体不能加热、配液和作反应器；要平视托盘天平称量物质的质量，精确度0.1g 称前调零，称时左物右码，易潮解或腐蚀知识梳理 实验基本操作及物质的检验和提纯

二、物质的分离和提纯 1．过滤 分离____________与_____________混合物。 主要仪器：玻璃棒、漏斗、滤纸、烧杯、铁架台（带铁圈） 操作注意点：“一贴、二低、三靠” 典型例子：粗盐提纯 【答案】 不溶性固体；液体 2．蒸发与结晶 从溶液中分离出固体溶质的方法 （1）蒸发结晶：溶解度随温度变化较小的物质。如从食盐水中提取食盐晶体。 主要仪器：玻璃棒、蒸发皿、酒精灯、铁架台（带铁圈） 注意事项：溶质须不易分解，不易水解，不易被氧化；蒸发过程应不断搅拌，以免部过热；_____________时应停止加热，利用余热把剩余水蒸干，以防___________。 （2）加热浓缩、冷却结晶 典型例子：硝酸钾（混有少量氯化钠）的提纯 【答案】较多晶体析出；固体飞溅 3．蒸馏和分馏 利用液体混合物沸点不同，进行分离或提纯。 蒸馏：分离两种互溶的液体。 分馏：利用蒸馏原理分离多种液态混合物。 主要仪器：温度计、蒸馏烧瓶、酒精灯、冷凝管、牛角管、锥形瓶、酒精灯等 注意事项：①在蒸馏烧瓶中放少量沸石，防止液体暴沸； ②温度计的水银球在蒸馏烧瓶的_________________处； ③冷凝水从冷凝管______进______出。 典型例子：乙醇和水的分离、石油分馏 【答案】支管口；下；上 试样 加水、溶解 混合溶液（KNO 3、NaCl ） 蒸发浓缩、冷却结晶 过滤 滤液（NaCl 、饱和KNO 3） 滤渣（KNO 3晶体） 重复上述操作（重结晶） KNO 3晶体 干燥 KNO 3晶体

2011年合肥市区初中毕业学业理科实验操作考试实施方案

2011年合肥市区初中毕业学业理科实验操作考试实施方案 为全面贯彻党的教育方针，大力推进素质教育，促进学校提高实验教学水平和质量，培养学生实验操作能力和创新精神，根据省教育厅相关文件精神，结合我市实际，制定本实施方案。 一、考试科目和分值 （一）理科实验操作考试科目为：物理、化学。考生随机抽考其中一科。理科实验操作考试按照现行教材中的学生分组实验要求命题。 （二）分值为10分，计入考生初中毕业学业考试总分；同时，考试结果分为A（10－9分）、B（8－7分）、C（6－5分）和D（4分及以下）4个等级，作为初中生综合素质评价“实践与创新”方面重要实证材料之一。 二、考试时间和地点 （一）4月11日公布理科实验操作考试具体范围。 （二）考试时间为4月19日－22日，共4天。 （三）考点分别设在合肥一中（滨湖区）、合肥五中、合肥六中（寿春路校区）、合肥七中、合肥八中（政务区）和合肥九中等6所学校。每个考点设物理、化学考场各2个。 三、对残疾和伤病考生的有关规定 因残疾丧失实验操作能力（须有残疾证）或因伤病确实不能参加实验操作考试的考生（须有病历或有关证明），由

本人申请，学校审核确认（学校应将申请免试的学生名单在学校公示栏公示，不少于3天），无异议后，在4月7日之前报区教育局（教育主管部门），并做好复查的准备。区教育局复核后，于4月8日汇总上报市教育考试院审批。免考的证明材料进入考生档案。被批准理科实验操作免试的考生按6分计算。考试时因考生本人操作因素造成事故受伤而中断考试的学生以实际已得分计算。 四、考试安排 （一）物理、化学试卷均为A、B、C、D、E、F各6套，每套8组。 （二）考生考前30分钟抽签决定考试科目和座位号，以座位定题。 （三）每场开考前30分钟，负责抽签的工作人员要核对考生理科实验操作考试准考证，安排考生抽签，考生按抽签号顺序列队等候入场。 （四）理科实验操作考试时间为每场20分钟。 （五）每个考场由8名考评教师组织考试，含1名主考教师、1名检录员。2名考评教师同时考评8名考生，分别评分后当场交给主考教师，由主考教师、检录员登录实验操作成绩并算出平均分后送交微机登录室登录、打印、公布。 （六）考生允许带钢笔（或圆珠笔）、铅笔、直尺和橡皮，不允许携带任何书籍和其他用品。 （七）考生要按指定时间到达考场，无故缺考的不予补

毕赤酵母表达实验手册

xx酵母表达实验手册 （作参考） 部分试剂中英文名称： 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶） 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 500*B（ 0.02%生物素Biotin）、100*H（ 0.4%Histidine组氨酸） 10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇） 10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（ 0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH 6.0） Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer） YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基） YPD培养基的配制： 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注：

配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基} 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%（NH 4） 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注： 这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。 完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）： 省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g （NH 4）

高考化学实验知识点归纳及典型例题

高考化学实验知识点归纳及典型例题 一、实验基础知识 1.常用化学仪器 （1）应用要点：熟悉常用仪器结构特点、用途和应用注意事项，主要有加热容器、分离仪器、计量仪器等。 （2）注意事项：加热容器要区分是直接加热还是隔石棉网加热；分离仪器要区分是用于分液、过滤还是蒸馏；计量仪器要特别注意零刻度的位置及读数的精度要求。 2.常用试剂的使用与贮存 （1）应用要点：着重了解露置在空气中易变质的试剂、见光或受热易分解的试剂、易挥发的试剂、易燃试剂、不宜用玻璃试剂瓶盛放的试剂等。 （2）注意事项：试剂的使用和贮存方法是由试剂的物理性质和化学性质所决定的。易与空气中氧气、水蒸气和二氧化碳反应的试剂不能长时露置在空气中；见光易分解的试剂应存放在棕色瓶中，置于冷暗处；受热易分解的试剂和易挥发的试剂应存放在冷暗处；能与玻璃中的二氧化硅反应生成硅酸钠的试剂，如NaOH、Na2CO3等不宜放在磨口玻璃试剂瓶中。 3.气体制备与净化 （1）应用要点：掌握常见气体的制备反应、制备装置、收集方法、尾气吸收等。 （2）注意事项：气体的制备装置的选择主要根据反应物的状态和是否需要加热；收集方法的选择主要看气体的水溶性和密度，以及是否与空气中的氧气反应；尾气吸收时要注意防止倒吸。 4.物质的检验、分离和提纯 （1）应用要点：要注意区分检验、分离、提纯的区别；掌握常见离子检验的检验方法；掌握分离和提纯的试剂选择依据和分离操作方法。 （2）注意事项：要注意三者在目的上的不同。检验是对物质进行鉴别或鉴定；分离是将混合物中各组分分开；提纯是除去混合物中的杂质。由于目的不同，所选试剂及分离方法也要相应地变化。 5.定量实验 （1）应用要点：掌握四个定量实验（中和滴定、配制一定物质的量浓度的溶液、中和热的测定、硫酸铜晶体中结晶水含量的测定）的实验原理、主要仪器和装置、操作要点、数据处理和误差分析等。 （2）注意事项：要在熟悉仪器构造的前提下掌握操作方法和读数方法；在深入理解原理的基础上掌握数据处理和误差分析方法。 二、综合实验 （1）应用要点：能够根据实验目的选择仪器和装置、确定装置的接口顺序；能够设计简装实验；能够对实验原理、仪器、操作等的进行评价。 （2）注意事项：要注意区分洗气瓶长进短出和短进长出时的不同用途；。实验设计要遵循科学性、安全性、可行性和简约性四个基本原则；在掌握好实验基础知识的前提下才有可能正确地评价实验。 1．典型例题： 例1．某同学在实验报告中写有以下操作和实验数据，其中合理的是_________________（填编号） ①用托盘天平称取11.7g食盐 ②用量筒取5.62mL某浓度的盐酸 ③用pH试纸测得某溶液的pH值为3.5 ④滴定某未知浓度的盐酸用去23.15mLNaOH标准溶液 ⑤用500mL容量瓶配制250mL 0.1mol/L Na2SO4溶液 ⑥用酸式滴定管量取25.00mL已知浓度的KMnO4溶液 答案：①④⑥ 例2．如图是一套实验室制气装置，用于发生、干燥和收集气体。下列各物质中 能利用这套装置进行实验的是 A．铜屑和稀硝酸 B．二氧化猛和浓盐酸

毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主

有机化学实验操作要求规范

实用标准文案 有机化学实验 操作规范

实用标准文案 目录 《有机化学实验》操作规范 (1) 一、有机化学实验教学目的和要求 (1) 二、使用标准磨口玻璃仪器注意事项 (1) 三、仪器的装配 (1) 四、加热 (2) 五、回流 (2) 六、分液漏斗 (3) 七、搅拌装置 (4) 八、干燥 (4) 九、蒸馏 (5) 十、减压蒸馏 (7) 十一、水蒸气蒸馏 (9) 十二、分馏 (10) 十三、重结晶 (11) 十四、有机化合物的合成 (13)

实用标准文案 《有机化学实验》操作规范 一、有机化学实验教学目的和要求 通过有机化学实验，加深学生对有机化学基本理论与概念的理解；增强运用有机化学理论解决实验问题的能力。要求掌握： 1、本规范内所拟订的各项有机化学实验的基本技能； 2、正确选择有机化合物的合成、分离和提纯的方法； 3、养成实事求是的科学态度，良好的科学素养和工作习惯。 二、使用标准磨口玻璃仪器注意事项 1、标准口塞应保持清洁 2、使用前在磨砂口塞表面涂以少量真空油脂或凡士林，以增强磨 砂接口的密合性，同时也便于接口的装拆。 3、用后应立即拆卸洗净。否则，对接处常会粘牢，以至拆卸困难。 4、能正确说出各仪器的名称 三、仪器的装配 1、在装配仪器时，所选用的玻璃仪器和配件都要干净。否则会影 响产物的产量和质量 2、一般根据热源的高低来确定待加热仪器和其他仪器的高度。 3、仪器安装应先选好主要仪器的位置，按先下后上，从左到右顺 序安装，做到正确、整齐、稳妥、端正，其轴线应与实验台边沿平行。在拆卸时应先移走热源，后停冷凝水，再拆装置，拆卸顺序与安装相反，其顺序是由右至左，先上后下。 4、其他注意事项

高中化学实验注意事项总结

高中化学实验注意事项总结 一.中学化学实验操作中的七原则掌握下列七个有关操作顺序的原则，就可以正确解答“实 验程序判断题”。 1.“从下往上”原则。以Cl2实验室制法为例，装配发生装置顺序是：放好铁架台→摆好酒 精灯→根据酒精灯位置固定好铁圈→石棉网→固定好圆底烧瓶。 2.“从左到右”原则。装配复杂装置应遵循从左到右顺序。如上装置装配顺序为：发生装 置→集气瓶→烧杯。 3.先“塞”后“定”原则。带导管的塞子在烧瓶固定前塞好，以免烧瓶固定后因不宜用力而 塞不紧或因用力过猛而损坏仪器。 4.“固体先放”原则。上例中，烧瓶内试剂MnO2应在烧瓶固定前装入，以免固体放入时 损坏烧瓶。总之固体试剂应在固定前加入相应容器中。 5.“液体后加”原则。液体药品在烧瓶固定后加入。如上例中浓盐酸应在烧瓶固定后在分 液漏斗中缓慢加入。 6.先验气密性(装入药口前进行)原则。 7.后点酒精灯(所有装置装完后再点酒精灯)原则。 二.常见的需要塞入棉花的实验有哪些需要塞入少量棉花的实验： 热KMnO4制氧气制乙炔和收集NH3其作用分别是：防止KMnO4粉末进入导管；防止实验中产生的泡沫涌入导管；防止氨气与空气对流，以缩短收集NH3的时间。 三.常见物质分离提纯 1.结晶和重结晶：利用物质在溶液中溶解度随温度变化较大，如NaCl，KNO3。 2.蒸馏冷却法：在沸点上差值大。乙醇中(水)：加入新制的CaO吸收大部分水再蒸馏。 3.过滤法：溶与不溶。 4.升华法：SiO2(I2)。 5.萃取法：如用CCl4来萃取I2水中的I2。 6.溶解法：Fe粉(A1粉)：溶解在过量的NaOH溶液里过滤分离。 7.增加法：把杂质转化成所需要的物质：CO2(CO)：通过热的CuO；CO2(SO2)：通过NaHCO3 溶液。 8.吸收法：用做除去混合气体中的气体杂质，气体杂质必须被药品吸收：N2(O2)：将混 合气体通过铜网吸收O2。 9.转化法：两种物质难以直接分离，加药品变得容易分离，然后再还原回去：Al(OH)3， Fe(OH)3：先加NaOH溶液把Al(OH)3溶解，过滤，除去Fe(OH)3，再加酸让NaAlO2转化成A1(OH)3。 10.纸上层析（不作要求） 四.常用的去除杂质的方法 1.杂质转化法:欲除去苯中的苯酚，可加入氢氧化钠，使苯酚转化为酚钠，利用酚钠易溶 于水，使之与苯分开。欲除去Na2CO3中的NaHCO3可用加热的方法。 2.吸收洗涤法:欲除去二氧化碳中混有的少量氯化氢和水，可使混合气体先通过饱和碳酸 氢钠的溶液后，再通过浓硫酸。 3.沉淀过滤法:欲除去硫酸亚铁溶液中混有的少量硫酸铜，加入过量铁粉，待充分反应后， 过滤除去不溶物，达到目的。 4.加热升华法:欲除去碘中的沙子，可采用此法。 5.溶剂萃取法:欲除去水中含有的少量溴，可采用此法。 6.溶液结晶法(结晶和重结晶):欲除去硝酸钠溶液中少量的氯化钠，可利用二者的溶解度

2019年初中实验操作考试工作方案.doc

2019年初中实验操作考试工作方案 为规范实验操作考试工作，确保实验考试公平、公正、安全，根据教育部、省教育厅有关规定，结合我市实际，制定本工作方案。 一、考试组织 共划分4个考区，分别为东港考区（包括东港区、日照经济技术开发区、山海天旅游度假区，由东港区组织）、岚山考区、莒县考区、五莲县考区。 各考区要成立实验操作考试工作组织机构，制定实验操作考试工作方案，报市教育局备案。 各考点要成立相应的组织机构，设置考务、检录、医务、后勤、安保等专项工作组，具体负责实验考试各个环节的组织工作。要制定实验操作考试工作手册和突发事件应急预案，报区县教育和体育局。 二、考试内容 日照市教育局《关于公布<2019年初中实验操作考试内容及评价标准>的通知（日教便字〔2019〕12号）》中确定的内容。 三、考试时间 五月底前完成，不安排补考。具体考试时间由各考区确定。每学科实验操作考试用时均为10分钟。 四、考试方式 初三物理和化学实验操作考试，每名考生在两个学科中各抽

考一个实验；初二生物实验操作考试，每名考生抽考一个实验。 每学科实验操作考试满分均为10分。各科实验操作分别按实际得分计入中考成绩。 每考场内有1名评委组长和6名评委，每名评委监考4名考生。每考场共安排24名考生，单人单桌考试。实验考试采取评委现场赋分、考生摁手印确认的方式进行。 五、考务管理 （一）考区统筹。 1．周密部署安排。根据考生人数合理安排考试日程，各考区可设置若干考试小组，每个考试小组由领队、检录员、评委组长、评委、成绩登录员等人员组成。 2．严格安全管理。各考区要组织专家对各考点的消防安全、实验设施、仪器装备等情况进行全面检查，对考场布置进行验收。达不到要求的学校一律不得安排考点。 3．严格评委培训。各考区要遴选责任意识强、业务素质高、身体状况好的教师承担考试工作, 参与人员都要签订《实验操作考试工作人员承诺书》。当年有子女、直系亲属等参加考试者不得参与考试工作。 各考区要做好评委培训工作，加强相关法律法规、职业道德、考试规程、作弊识别、安全管理、风险防范等方面的培训，确保评委准确把握实验操作考试内容及评分要点，监督考生遵守安全规程进行实验，及时处置突发情况。 4．严格证件管理。工作人员必须佩戴由各考区统一印制的工作证。考生使用由市教育局统一模板印制并由各区县教育主管

毕赤酵母表达手册

版权声明： 本站几乎所有资源均搜集于网络，仅供学习参考，不得进行任何商业用途，否则产生的一切后 果将由使用者本人承担！ 本站仅仅提供一个观摩学习与交流的平台， 将不保证所提供资源的完 整性，也不对任何资源负法律责任。所有资源请在下载后 24 小时内删除。如果您觉得满意， 请购买正版，以便更好支持您所喜欢的软件或书籍！ ☆☆☆☆☆生物秀[https://www.wendangku.net/doc/b78612195.html,] ☆☆☆☆☆中国生物科学论坛[https://www.wendangku.net/doc/b78612195.html,/bbs/] ☆☆☆☆☆生物秀下载频道[https://www.wendangku.net/doc/b78612195.html,/Soft/] 生物秀——倾力打造最大最专业的生物资源下载平台！ ■■■ 选择生物秀，我秀我精彩！！■■■ 欢迎到生物秀论坛（中国生物科学论坛）的相关资源、软件版块参与讨论，共享您的资源，获 取更多资源或帮助。

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥