纤维素酶的检测方法新
纤维素酶的检测方法
摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。
关键词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程
一、纤维素酶及其降解原理
纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55X109吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。
纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。
纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β
-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。
纤维素酶在降解纤维素过程中的作用机理至今还不是很清楚。目前关于Cx酶、C1酶和β
-1,4葡萄糖酶这3种酶的作用机理的假说比较公认的是以下3种，其中协同理论最为广泛接受。（1）C1-Cx假说。该理论认为首先由C1酶作用于纤维素酶的结晶区，再由外切酶和β-葡萄糖苷酶联合作用产生二糖和葡萄糖。其水解模式如图1所示。
图1 C1-Cx假说示意
（2）顺序作用假说。该假说认为首先由内切酶随机的作用于纤维素的葡萄糖苷键，打开缺口，然后由外切酶在新生键末端切下一个纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶将它水解成葡萄糖。
（3）协同作用假说。该理论认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖。
二、纤维素酶的检测方法
纤维素酶各组分的底物专一性不同，而且纤维素酶是多组分复合物。纤维素酶作用的底物也比较复杂，同时不同来源的纤维素酶其组成及各组分的比例有较大的差异，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。
其中主要的检测方法有：棉线切断法，滤纸崩溃法，羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增加的测定法[2]，分光光度计法[3]，快速测定纤维素酶CMC液化活力法[4]，平板法，巴鲁阿-斯温( Bamch and swain) 测定法[5]。
对于细菌等对纤维素分解能力强的微生物，由于对其酶的形成、分泌和作用机制研究较少，这些测定方法不一定适用。但目前对于这些方法测定的具体数值的可信度、可比性，却没有相关的报道研究。下面主要通过四种方法进行实验，研究这些实验方法的稳定性，从而为实验研究提供一定的参考依据[6]。
2.1、材料与方法
材料：主要仪器HH-6型恒温水浴锅；22PC型分光光度计；HG1001型电热鼓风干燥箱；FA2004型电子分析天平；UV-2401型紫外双光束分光光度计
实验方法：
2.1.1 试剂的配置：（1）PH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8ml 冰醋酸定容至100ml，称取27,2g 的醋酸钠溶解并定容至100ml将上述两种溶液等体积混合。
（2）3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）：称取3,5-二硝基水杨酸6.3g于500ml大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2mol/ml NaOH溶液262ml，再加入到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中，用蒸
馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。
（3）CMC-Na溶液：称取0.625g 羧甲基纤维素钠，加热溶解，定容至100ml[7]。
2.1.2 酶活测定方法
葡萄糖标准曲线的绘制
原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在520nm处的吸光度，得出还原糖的量。
葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，称取0.1080g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100ml。
取16支具塞试管，依次编号为0,1,2,3,4,5,6,7并作平行实验。由于各种方法反应体系的总体积不同，所以需作不同的标准曲线，所加的量也有所不同。
现以总体积为9ml体系为例：
表1葡萄糖标准曲线绘制方法
管号0 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖量（ml）0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 蒸馏水（ml）7 6.5 6 5.5 5 4.5 4 3.5 DNS(ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 摇匀后置于沸水浴中加热5min后，冷却定容至25ml。摇匀后以0号管为对照于最大吸收波长处测定OD值，以葡萄糖含量μmol为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
酶活测定方法的比较
配制不同浓度的标准酶液：用去离子水100ml来溶解100mg纤维素酶（≥1000IU），配制成1mg/ml酶液。测定时分别吸取0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml上述酶液用水补足至1ml即为不同浓度的酶液。
（1）滤纸酶活（FPA）测定方法
滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法，此方法应用广泛，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活（Filter Paper Activity，FPA）
方法：取1ml酶液加1ml 0.1mol/L、Ph4.6的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入1条1x6cm 新华滤纸（50±1mg），50℃保温1h。取出，沸水浴灭活5min，冷却至室温，用3ml DNS试剂
显色后稀释3倍，测OD值（520nm）。OD值越大，说明该菌株的酶活力越强[8]。
酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；
酶活力（μ/ml）=葡萄糖量60×Ew
其中：60为保温时间（酶与底物作用时间，min）；Ew为粗酶液的体积（ml）；
μ是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。
（2）羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定方法
原理：纤维素酶对CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等还原糖，再用DNS法显色，用标准葡萄糖溶液作标准液，22PC分光光度计在520nm处测其吸光度，以每分钟生成相当于1μmol 的葡萄糖为一个酶活性单位。
取3支带有20ml刻度的试管，1支管作空白对照，2支管作平行样品管。每支样品管中加1ml酶溶液，置于50℃水浴锅中预热2min，然后在3支试管中分别加入4ml已预热至50℃的底物溶液，准确计时5min取出，每管立即分别加入1ml 2mol/L氢氧化钠溶液和2ml DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1ml 酶液。将3支试管放入沸水浴中，5min后立即取出，流水冷却，用蒸馏水定容至20ml，于520nm处测OD值。
酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；
酶活力（μ/ml）=葡萄糖量5×Ew
其中：5为保温时间（酶与底物作用时间，min）；Ew为粗酶液的体积（ml）；μ是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。
（3）染色纤维素测定方法[9]
用考马斯亮蓝使滤纸染色酶解后在最大吸收波长处测释放的着色物的吸光值，代表酶活，以吸光度为纵坐标，酶浓度为横坐标做曲线。
在实际测定时，先利用紫外双光束分光光度计进行波长扫描，发现其在536nm 处吸收峰最高，因此在实验时以此波长作为测定波长。
（4）CMC粘度降低测定方法
底物溶液9ml，加酶液1ml，40℃，测定底物粘度减至一半时所需时间，以奥氏粘度计测定。以10min能使底物粘度降低一半的酶活作为一个单位。
2.2结果与分析
葡萄糖标准曲线绘制
实验中所用的标准葡萄糖曲线绘制结果如下：由于在以后的测定中，各方法的反应体系并
不相同，所以每个体系须有各自的葡糖糖标准曲线作为今后的参照。CMC糖化力测定参照图1，有三条曲线，是因为在常用测定中酶与底物不同，而造成它们各自体系的溶液的总体积也不相同，因此此方法的葡萄糖标准曲线有三条。滤纸法参照图2。
图1 CMC酶活测定法葡糖糖标准曲线(不同体系)
所得三条曲线的回归方程如下：
y1=0.0292x-0.0101
R12=0.9981
y2=0.0211x-0.0107
R22=0.9965
y3=0.0163x-0.0074
R32=0.9955
图2 滤纸法葡糖糖标准曲线
所得曲线的回归方程：
y=0.1418x-0.0141
R2=0.998
标准纤维素酶酶活曲线
酶活测定方法结果比较如下：
表2 标准纤维素的CMC酶活力和滤纸酶活力测定结果
CMC酶活力测定法滤纸酶活力测定法（FPA）
含酶量（mg/mL）OD值
查得葡萄糖
量（μmol）
酶活
（U/mL）
OD值
查得葡萄糖
量（μmol）
酶活
（U/mL）
0 0 0 0 0 0 0
0.2 0.102 3.84 0.768 0.054 0.480 0.008
0.3 0.146 5.35 1.069 0.090 0.734 0.012
0.4 0.202 7.26 1.453 0.115 0.910 0.015
0.5 0.258 9.18 1.836 0.148 1.144 0.019
0.6
0.296 10.48 2.097 0.182 1.380 0.023
所得曲线的回归方程:
y=3.5908x R2=0.9973
y=0.0383x R2=0.9985
实验结果表明：用标准纤维素酶所做的CMC酶活测定和滤纸酶活测定，从回归曲线可以看出他们的线性较好，可以充分说明这2种方法比较稳定。而且CMC酶活测定法和滤纸酶活
测定法在很多报道中均在采用，这样使实际实验的结果更具可比性。
所得曲线的回归方程：
y=0.728x-0.029
R2=0.8828
所得曲线的回归方程：
y=0.0316x-0.0007
R2=0.979
由上述结果可知：CMC粘度降低法的线性没有滤纸酶活测定法和CMC酶活测定法来得好，而且在实验过程中，两个平行实验之间有较大的误差。但从回归方程就能看出，该方法的稳定性较其他3种方法有很大的偏差。
表3 标准纤维素的CMC粘度降低法和染色纤维素法测定结果
CMC粘度降低法染色纤维素法
含酶量（mg/mL）所用时间（min）酶活（U/mL）OD值酶量（mg）
0 0 0 0 0
0.2 77.4 0.129 0.0048 0.2
0.3 60.6 0.165 0.0093 0.3
0.4 45.3 0.221 0.0107 0.4
0.5 37.5 0.267 0.0144 0.5
0.6 20.0 0.500 0.0195 0.6
2.3结论
本次实验研究了纤维素酶测定方法中常用的4种方法，即：FPA测定法、CMC-Na酶活性测定法、染色纤维素测定法以及CMC粘度降低测定法，比较了这4种方法测定的线性相关性以及稳定性，经过实验研究表明，FPA测定法和CMC-Na 酶活性测定法较稳定，线性相关性较高，可以作为研究测定的可靠方法。
三、纤维素酶的应用与发展趋势
纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸、和生物能源等工业应用上具有重要地位。
自20世纪90年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整理(biostoning and biofinishing)，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整理上酸性纤维素酶具有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；中性纤维素酶反应条件温和而且不易返染，织物档次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上，如去球(depilling)脱毛( reduced fuzz)以及增柔(softness)等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织物的整理并不需要纤维素酶的所有组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整理，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程改变内切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解决这个问题。
纤维素酶用于造纸工业，是利用外切纤维素酶只从末端切断纤维素的作用原理，提高纸张的光洁度。碱性纤维素酶用于洗涤剂工业，可以提高棉织物的洗净度，起主要作用的是内切酶(CMC酶)，是近些年来洗涤剂工业竞相开发的新酶种之一。这两种工业应用涉及的纤维素酶只需要纤维素酶系中的单一组分，基因工程技术可以在其中得到广泛的应用。
纤维素酶将来最大的用途，或者可以使其产量得到巨大增长的工业需求将是纤维素乙醇的开发。自上世纪70年代石油危机以来，世界各国都致力于开发新的可再生能源，而生物乙醇(bioeth-anol)是被普遍看好的新型燃料。进入21世纪，利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，可以避免对粮食作物的大量损耗，引起了各国政府和研究机构的重视，这其中的关键是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵活力较低，因此其应用成本也较高。同时纤维素酶相比其他糖苷水解酶类，比活力至少要低1~2个数量级，如滤纸酶的比活力为1 IU/mg左右，CMC的比活力约为10 IU/mg，从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题，也是纤维素酶研究的热点与难点。目前通过传统的菌种诱变和基因工
程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量，从而提高酶的发酵水平，如诺维信公司与美国能源部合作，将制造纤维素乙醇中的酶制剂成本由2001年的每加仑5美元降低到2004年的30美分，2005年又降低到每加仑18美分。还可以通过改善发酵条件和工艺，如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要，深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式，进而对其进行有效改造;或者通过筛选新的产酶菌种，发现具有开发潜力的新酶源。
总之，纤维素酶是目前糖苷酶类中惟一尚有大量亟待解决问题的酶，也是有着巨大工业和市场潜力的酶。进一步阐明纤维素酶的结构与功能，研究纤维素酶的基因表达与调控的关系；针对不同工业需要研制不同组分比例的纤维素酶；提高纤维素酶水解天然纤维素的比活力；开发适应不同温度(低温或高温纤维素酶)的纤维素酶是当前纤维素酶的主要研究趋势。
参考文献
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土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案 目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。 目前实验室采用测酶活方法： 1、葡萄糖标准曲线制作： 530nm比色。 2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。 单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000 1 )/(???=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug. 以下是近期所做的实验结果： 葡萄糖标准曲线 两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果 实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。 根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。 刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种， 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板 时就加入刚果红。方法一在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg ／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的 茵落周围将会出现透明圈。 方法二配制质量浓度为10 mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长 出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。 两种刚果红染色法的比较刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经 有超过20年的历史，课本中给出了两种方法。 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间 发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素 粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出
实验四 种子粗脂肪的提取
实验四种子粗脂肪的提取 一、实验目的 脂肪广泛存在于油料植物种子和果实中，测定脂肪的含量，可以鉴别其品质的优劣，也是油料作物选种和种质资源调查的常规测定项目。 二、实验原理 在了解了实验目的之后，关于这个实验有以下几个问题需要大家思考： 1.种子成分很复杂，脂肪的提取如何进行？ 2.什么是粗脂肪？ （答：脂肪不溶于水，易溶于有机溶剂（如石油醚）。利用这一特性，选用有机溶剂直接浸提出样品中的脂肪进行测定。提取物中除脂肪之外，还有游离脂肪酸、石蜡、磷脂、固醇、色素、有机酸等物质，故浸提物称粗脂肪。）通过以上问题的思考，我们知道了脂肪的提取主要是利用其易溶于有机溶剂的特性。具体的实验操作粗脂肪的提取，一般采用索氏脂肪提取器。 利用脂类物质溶于有机溶剂的特性。在索氏提取器中用有机溶剂（本实验用石油醚，沸程为 30 ～ 60 ℃）对样品中的脂类物质进行提取。 图索氏脂肪提取器 1. 浸提管 2. 通气管 3. 虹吸管 4. 小烧瓶 5. 冷凝管 索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的，提取管两侧分别有
虹吸管和连接管。各部分连接处要严密不能漏气。提取时，将待测样品包在脱脂滤纸包内，放入提取管内。提取瓶内加入石油醚，加热提取瓶，石油醚气化，由连接管上升进入冷凝器，凝成液体滴入提取管内，浸提样品中的脂类物质。待提取管内石油醚液面达到一定高度，溶有粗脂肪的石油醚经虹吸管流入提取瓶。流入提取瓶内的石油醚继续被加热气化、上升、冷凝，滴入提取管内，如此循环往复，直到抽提完全为止。 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料 大豆、花生、蓖麻、向日葵、芝麻等油料种子。 （二）仪器设备 索氏提取器（ 50 mL ），烧杯，干燥器，脱脂滤纸，镊子，分析天平，烘箱，恒温水浴，脱脂棉。 （三）试剂 石油醚（化学纯，沸程 30 ～ 60 ℃）。 四、实验操作 1.将洗净、晾干的芝麻种籽放在 80 ～ 100 ℃烘箱中烘 4 小时。待冷却后，准确地称取 2 ～ 4 g ，置于研钵中研磨细，将研碎的样品及擦净研钵的脱脂棉一并用脱脂滤纸包住用丝线扎好，勿让样品漏出。或用特制的滤纸斗装样品后，斗口用脱脂棉塞好。放入索氏提取器的提取管内，最后再用石油醚洗净研钵后倒入提取管内。 2. 洗净索氏提取瓶，在 105 ℃烘箱内烘干至恒重，记录重量。将石油醚加到提取瓶内约为瓶容积的 1/2 ～ 2/3 。把提取器各部分连接后，接口处不能漏气。用 70 ～ 80 ℃恒温水浴加热提取瓶，使抽提进行 16 小时左右，直至抽提管内的石油醚用滤纸检验无油迹为止。此时表示提取完全。 3. 提取完毕，取出滤纸包，再回馏一次，洗涤提取管。再继续蒸馏，当提取管中的石油醚液面接近虹吸管口而未流入提取瓶时，倒出石油醚。若提取瓶中仍有石油醚，继续蒸馏，直至提取瓶中石油醚完全蒸完。取下提取瓶，洗净瓶的外壁，放入 105 ℃烘箱中烘干至恒重，记录重量。 五、注意事项
食品脂质提取
一、如何提取食品中的总脂质？ 1.脂类的共同特点是在水中的溶解度非常小，能溶于有机溶剂中，因此可以根据相似相溶 的原理选取合适的有机溶剂提取食品中的脂质。常用来提取脂类的有机溶剂有乙醚、石油醚、氯仿-甲醇。 (1)乙醚-应用最多，国标采用。 ①优点沸点低；溶解脂肪的能力强于石油醚。 ②缺点能被2%水饱和，含水的乙醚抽提能力降低；非脂成分的溶解；易燃 (2)石油醚-稳定性好，测定较准确 ①优点沸点高，不易燃；吸收水分少；没有胶溶现象 ②缺点溶解脂肪的能力弱于乙醚 ③适用于已烘干磨碎样品，不适用于潮解结块的样品 ④只能提取游离态脂肪 (3)氯仿-甲醇 优点一种有效的溶剂，获得的脂质提取物纯净，不仅能提取游离脂，对脂蛋白、磷脂等结合脂的提取效率较高。 2.下面介绍几种提取脂质的方法： (1)索氏提取法：适用于脂类含量较高，结合态脂类含量少或经水解处理过的，样品应能 烘干、磨细、不易吸湿结块。适用于肉制品、豆制品、坚果制品、谷物油炸制品、糕点等食品中粗脂肪的测定。 (2)酸水解法：酸水解法测定的是食品中的总脂肪, 包括游离脂肪和结合脂肪。适用于各类、 各种状态的食品中脂肪测定，不适于测定含磷脂高含糖高的食品。 (3)氯仿/甲醇法：提取效率高，获得的脂质提取物纯净，不仅能提取游离脂，对结合脂的 提取也十分有效。适用于含结合态脂类，特别是含磷脂多的样品。 (4)碱水解法：本法适用于各种液状乳、各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋等能在碱性溶液中 溶解的乳制品，也适用于豆乳或加水呈乳状的食品。 二、如何提取鸡肉、鱼肉中的总脂质，选用什么提取剂？ 采用氯仿-甲醇法，提取剂为氯仿-甲醇-水的配比为1∶2∶0.8的氯仿-甲醇提取剂。具体实验步骤如下： ?样品→组织捣碎机捣碎成浆→取10 g →烧杯→加60 mL 甲醇→搅拌2 min→加氯仿30 mL搅拌（先后分两次）→静置2 min →布氏漏斗抽滤→残渣用氯仿抽提→搅拌后抽滤。?收集滤液，转移到分液漏斗中，加35 mLZn(AC)2（0.5％），振荡混合充分，放置24 h。
羧甲基纤维素酶测定原理
纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 （1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份× 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份× 4 （4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg （5）水杨酸苷 500mg 2．主要仪器 （1）722 型或其他型号的可见分光光度计 （2）恒温水浴2 台 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）万分之一分析天平 （7）恒温干燥箱 （8）冰箱 （9）试管架 （10）胶头滴管 （11）具塞刻度试管20mL×24 （12）移液管或加液器0.5 mL×3；2mL×7 （13）容量瓶100 mL×6；1000 mL×3 （14）量筒50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1 （15）烧杯100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1 3．试剂（均为分析纯）
（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。 （3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7 · H2O （MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)
土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板
本科开放项目 题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名： 指导教师： 学院： 专业班级： 2016年3月
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株
目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)
纤维素酶活力测定
山东大学实验报告2011年4月20日 姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105 一、实验目的 1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、巩固使用分光光度计 二、实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、实验器材 （1）722型分光光度计（2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平（7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球 四、实验材料 （1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）； （2）3、5—二硝基水杨酸显色液； （3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）； （5）蒸馏水。 五、实验操作 1.空白管的测定：
纤维素酶的检测方法
纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1.纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备 6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7．0标准曲线制作： 7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。 7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作
纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
蛋白质提取的几种简单方法
蛋白质的提取方法 选择材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况： （1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等； （2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 蛋白质的分离纯化 一，蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
纤维素酶活力的测定Measurement of Cellulase Activities
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纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定(CＭC) 一目的: 掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理: 纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠(CMＣ-Nａ)中分解出还原糖,还原糖又同3,５－而硝基水杨酸发生反应,产生一种黄橙混合色,用分光光度计可测定其色度,计算酶活力。 二试剂: 1.3,5-而硝基水杨酸显色剂(又称DNS试剂): 称取10g3,5-而硝基水杨酸,溶于蒸馏水中,加入20g分析纯NaOH,２00g酒石酸钾钠,加税5０0mｌ,升温溶解后,加入重蒸酚2ｇ,无水亚硫酸钠0、5g,加热搅拌,待全部溶解后,定容至1000mｌ。贮存于棕色瓶中,室温保存,放置一周后使用。 ２.０、1moｌ／ＬｐH4、5醋酸－醋酸钠缓冲液:称取结晶醋酸钠(CＨ3COOＮａ、3 Ｈ2Ｏ)13.６１g,醋酸(ＣH３COOH)6、０0g,用蒸馏水溶解,并定容至1００0 ml,配好后用pH计矫正。 3、1mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取10０mｇ分析纯葡萄糖(预先在70℃、60０nm汞柱下干燥5h至恒重),用少量蒸馏水溶解并定容至100ｍl,冰箱中保存备用。 ４.代测酶液:称取酶粉1、0ｇ(或吸取酶液1、０0ml),先用少量的０、05ｍoｌ／L pＨ４、5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再加上述缓冲液溶解,如此反复捣研３－4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,４0℃水浴锅中浸提1h,用四层纱布或脱
脂棉过滤,滤液供测定用。 5、底物:０.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,配制方法为城区0、5000g 羧甲基纤维素钠(Ｓigmａ公司生产),准确至０、0０1g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存,有效期3d。 三仪器: 分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。 四方法步骤: 1．标准曲线的绘制 分别吸取0.２, 0.４, 0、6, ０、8, 1.0, 1.2, １.4ｍl的1ｍg／ml葡萄糖液于７支20ｍl的比色管中,分别用蒸馏水补充体积至2、ｏml,各加３,５-而硝基水杨酸1、5ml,在沸水浴中煮沸5ｍiｎ,冷却后分别用蒸馏水定容至２0ｍl,摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液１、5mｌ,按上述同样操作为空白调零,在５40ｎm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标,葡萄糖毫克数Ｗ(mg)为横坐标绘制出标准曲线(理论上此线应过原点)。 标准曲线绘制各试管所含物质的体积
纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定（CMC） 一目的： 掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理： 纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。 二试剂： 1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。 2．0.1mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（CH3COONa.3 H2O）13.61g，醋酸（CH3COOH）6.00g，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。 3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。 4．代测酶液：称取酶粉1.0g（或吸取酶液1.00ml），先用少量的0.05mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂
棉过滤，滤液供测定用。 5．底物：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区0.5000g 羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至0.001g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。 三仪器： 分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。 四方法步骤： 1．标准曲线的绘制 分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml,各加3，5-而硝基水杨酸1.5ml,在沸水浴中煮沸5min，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。 以2ml蒸馏水加DNS溶液1.5ml,按上述同样操作为空白调零，在540nm 处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标，葡萄糖毫克数W(mg)为横坐标绘制出标准曲线（理论上此线应过原点）。 标准曲线绘制各试管所含物质的体积 2．酶样测定
纤维素酶活力的测定
实验二十纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维 素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C 酶、C 酶和 |?-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C 1 X 1 酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成 X 纤维寡糖，|?-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的 纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红 色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜 色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 （1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份 4 （4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg （5）水杨酸苷 500mg 2．主要仪器 （1）722 型或其他型号的可见分光光度计 （2）恒温水浴 2 台 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）万分之一分析天平 （7）恒温干燥箱 （8）冰箱 （9）试管架
（10）胶头滴管 （11）具塞刻度试管 20mL24 （12）移液管或加液器 0.5 mL3；2mL7 （13）容量瓶 100 mL6；1000 mL3 （14）量筒 50 mL2；100 mL1；500 mL1 （15）烧杯 100 mL6；500mL3；1 000 mL1 3．试剂（均为分析纯） （1）浓度为 1mg/mL的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至 100mL，充分混匀。4℃冰箱 中保存（可用 12～15 天）。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶 液 262mL，再加到 500mL含有 185g酒石酸钾钠（C H O KNa ! 4H O，MW=282.22）的热 4 4 6 2 水溶液中，再加5g结晶酚（C H OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na SO ，MW=126.04）， 6 5 2 3 搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色 瓶中，室温放置一周后使用。 （3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液 A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C H O ! H O（MW=210.14） 21.014g于 500mL 6 8 7 2 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至 1 000mL，充分 混匀。4℃冰箱中保存备用。 B 液（0.1 mol/L 柠檬酸钠溶液）：准确称取Na C H O ! 2H O（MW=294.12）29.412g 3 6 5 7 2 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中，然后用蒸馏水定容 至 1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶活性测定 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。