各种同工酶的染色方法
各种同工酶的染色方法
一、淀粉酶
⑴、制胶方法：
分离胶（6%）：
分离胶贮液：2.95 mL
Tris-柠檬酸（pH8.9）：10.95 mL
2%Na2SO4：0.4 mL
1%过硫酸铵：0.4 mL
TEMED：20 μL
配制方法：
分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis贮液）：30 g Acr + 0.8 g Bis加重蒸水
50 mL（可加热溶解）→定溶至1000 mL（pH 4.8～
5.1，冰箱内可放置2～3个月）
Tris-柠檬酸（pH8.9）：15.5 g Tris + 1 g 柠檬酸（C6H8O7·H2O）加
重蒸水溶解，调pH至8.9（用1 mol/L NaOH或1 mol/L
HCl调），最终定溶至1000 mL，滤纸过滤后置冰箱中
保存。
2%Na2SO4：1 g Na2SO4加重蒸水定溶至50 mL，冰箱中可保存1个
月。
1%过硫酸铵：0.5 g过硫酸铵加重蒸水定溶至50 mL，冰箱中可保
存1周。
浓缩胶（3%）
分离胶贮液：2.0 mL
Tris-柠檬酸（pH6.8）：2.0 mL
2%Na2SO4：0.2 mL
蒸馏水：14.8 mL
1%过硫酸铵：0.6 mL
TEMED: 30 μL
配制方法：
浓缩胶贮液：同分离胶贮液。
Tris-柠檬酸（pH6.8）：1.55 g Tris + 0.1 g 柠檬酸（C6H8O7·H2O）加重
蒸水溶解，调pH至6.8，最终定溶至100 mL，滤纸过
滤后置冰箱中保存。
⑵、染色方法：
1.1%可溶性淀粉（一定要在沸水中煮沸到无色透明无沉淀为止），均匀地涂倒
在胶板面上。静置1小时。
2.用0.15mol/L HAc缓冲液（pH 5.0）洗去胶板表面剩余的淀粉，然后加100 mL
0.15 mol/L HAc缓冲液（pH 5.0），在37℃温箱保温1.5小时。
3.加显色碘液10 mL，在兰色背景上出现白色透明、粉红、红或褐色条带，即
为淀粉酶。
配制方法：
1%可溶性淀粉：0.1 g可溶性淀粉溶于10 mL pH8.9的Tris-柠檬酸缓冲
液中，在水浴中煮沸，搅拌到完全透明无沉淀为止：
——本试剂需随配随用。
0.15mol/L HAc缓冲液（pH 5.0）：称取11.9 g NaAc，加重蒸水溶解，用
冰HAc调pH至5.0，最终加重蒸水至1000 mL。
显色碘液：称取KI 15.8 g，加到10 g 碘溶液中（先在95%乙醇中溶解），
最终加重蒸水至1000 mL，用时稀释20倍。
⑶、保存液：
固定液：冰醋酸: 甲醇: 水= 40 : 100 : 320
⑷、电极缓冲液贮液：
采用低离子强度电极缓冲液，称取6.2 g Tris，加入2.0 g Gly，加重蒸水定容至1000 mL，用时稀释5倍，pH值8.7。
⑸、2%溴酚蓝溶液：
称取1.0 g溴酚蓝加蒸馏水至50 mL。
二、过氧化氢酶：
⑴、制胶方法：
分离胶（7%，20 mL）
分离胶贮液：4.5 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：7.5 mL
重蒸水：7.5 mL
1%过硫酸铵：0.5 mL
TEMED：35 μL
配制方法：
分离胶贮液：同上
1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）缓冲液：称取121.14 g Tris放入1000 mL
烧杯中，加重蒸水800 mL溶解，用浓HCl调至pH8.8，
倒入1000 mL容量瓶，定容至1000 mL，滤纸过滤，
冰箱中可保存3个月。
浓缩胶（4%，10mL）
分离胶贮液：1.3 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：1.3 mL
重蒸水：6.4 mL
1%过硫酸铵：1.0 mL
TEMED：10.0 μL
配制方法：
浓缩胶贮液：同分离胶贮液。
1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：称取12.114 g Tris放入100 mL烧杯中，
加重蒸水溶解，用浓HCl调至pH6.8，倒入100 mL容
量瓶，定容至100 mL，定性滤纸过滤，冰箱中可保存
3个月。
⑵、染色方法：
1、用蒸馏水将电泳胶板冲洗1～2次，然后用0.3% H2O2溶液100 mL浸泡胶板
1～5分钟，在浸泡过程中不断振荡染色盘使之浸泡均匀。
2、浸泡结束，倒掉过氧化氢溶液，并用蒸馏水将胶板冲洗1～2次。再用4%可
溶性淀粉溶液100 mL（染色前一天配置更好）浸泡胶板1小时。
3、浸泡结束，倒掉淀粉溶液，用蒸馏水把胶板冲洗1～2次。再用50 mL 2%铁
氰化钾和50 mL 2%三氯化铁混合物进行负染色10分钟，待胶板在草绿色背
景上出现浅黄色酶带时停止染色，倒掉染色液，水洗胶板1～2次。
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
4%可溶性淀粉溶液：4 g可溶性淀粉溶于100 mL pH8.8 Tris-HCl缓冲液
中，在水浴中煮沸至透明无色为止。
2%铁氰化钾：铁氰化钾2 g溶解至100 mL。
2%三氯化铁：三氯化铁2 g（3.33 g FeCl3·6H2O）溶解至100 mL。
⑶、保存液：可直接用重蒸水。
⑷、电极缓冲液：
称取141.2 g Gly，加30 g Tris，加重蒸水定容至1000 mL配成原液，用时稀释25倍，pH值8.3。
三、苹果酸脱氢酶
⑴、制胶方法：
分离胶（7%）
分离胶贮液：6.8 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：22.4 mL
1%过硫酸铵:0.8 mL
TEMED：40 μL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
浓缩胶（3%）
分离胶贮液：4.0 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：4.0 mL
重蒸水：30.8 mL
1%过硫酸铵: 1.2 mL
TEMED：60 μL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
⑵、染色方法：
染色液：NAD+：0.05g
NBT：0.03g
PMS：0.002g
1 mol/L L-苹果酸钠（pH7.0）：10 mL
0.5 Tris-HCl缓冲液（pH7.1）：20 mL
水：70 mL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，于37℃保温30～60分钟，显示深兰色区带。
用无离子水漂洗，再用7.5%醋酸固定保存（或者用7.5%醋酸-30%乙醇-15%
甘油）
四、乳酸脱氢酶
⑴、制胶方法：
分离胶（7.5%）
分离胶缓冲液：3 mL
分离胶贮液： 6 mLl
0.14%过硫酸铵12 mL
水：3 mL
TEMED :15 uL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
浓缩胶（2.5%）
浓缩胶缓冲液：1.5 mL
浓缩胶贮液：3 mL
核黄素：1.5 mL
蔗糖：6 mL
TEMED：18 uL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
⑵、染色方法：
染色液：NAD+: 0.05g
NBT: 0.03g
PMS: 0.002g
1 mol/L乳酸钠液（pH7.0）：10 mL
0.1 mol/L氯化钠：5 mL
0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.1）：15 mL
水：70 mL
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，于37℃保温30～60分钟，即可显示蓝紫色区带。可用无离子水漂洗，再用7%醋酸固定，以终止酶促反应。
五、醇脱氢酶
制胶方法：同乳酸脱氢酶
染色方法：NAD+：0.025g
NBT：0.015g
PMs：0.001g
95%乙醇：2 mL
0.2M Tris-HCl 缓冲液：7 mL
水：41 mL
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，于37℃保温直至显示深兰色区带，用无离子水
漂洗，固定保存于7.5%醋酸。
六、酯酶
制胶方法：同乳酸脱氢酶
染色方法：
染色液：1% α、β-醋酸萘酯：3 mL
坚牢蓝RR：0.1g
0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.1）:10 mL
加水配制成100 mL.
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，于37℃保温约40分钟，或室温下直至显示出棕色的区带。用无离子水漂洗。固定保存于7.5%醋酸-30%乙醇-15%
甘油中。
七、过氧化物酶
制胶方法：同乳酸脱氢酶
染色方法：
染色液：2% 联苯胺：10 mL
抗坏血酸：35.2 mg
0.6% H2O2: 10 mL
水：30 mL
注意：在配制联苯胺贮液时，加几滴酒精或微温热冰醋酸可起助溶作用。
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，室温下1-5分钟后显示兰色区带。用无离子水漂洗，固定保存于（乙醇：乙酸：甘油：水= 5：2：1：4）的混合液中八、苹果酸酶
制胶方法：
分离胶（10%）：
分离胶贮液：6.5 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：7.5 mL
蒸馏水：5.5 mL
1%过硫酸铵：0.5 mL
TEMED：35 uL
浓缩胶（4%）：
分离胶贮液：1.3 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）：1.3 mL
蒸馏水：6.4 mL
1%过硫酸铵：1.0 mL
TEMED：10 uL
染色方法：
电泳结束用水漂洗胶板后，倒入50 mL染色液（内含NADP15 mg，NBT15 mg，PMS1 mg，MgCl2 50 mg，1mol/L L-苹果酸钠盐，(pH7.0) 5mL，0.2mol/L Tris-HCl
(pH8.0) 10 mL,蒸馏水35mL）中。在37℃黑暗条件下保温，直至显出深蓝色酶
带。弃染色液用水漂洗胶板后放入乙醇：甘油：水=1：1：2 溶液中保存。
九、超氧化物歧化酶
制胶方法：
分离胶（10%）
分离胶贮液：6.5 mL
1 mol/L Tris-HCl (pH8.8)：7.5mL
蒸馏水：5.5 mL
1%过硫酸铵：0.5 mL
TEMED：35 uL
浓缩胶（4%）
分离胶贮液：1.3 mL
1 mol/L Tris-HCl (pH6.8)：1.3 mL
蒸馏水：6.4 mL
1%过硫酸铵：1.0 mL
TEMED：10 uL
染色方法：
电泳结束后，将凝胶置于染色液中，至酶带清晰为止。染色后，凝胶柱用水漂洗并保存。
步骤：
1、将凝胶浸泡在2.45×10-4mol/l的NBT溶液中20min。注意要遮光，在黑暗
中，温度最好低一点，在冰箱里也可；NBT如变成无色或有沉淀，则需重新
再配
2、然后转移到0.028 mol/L四甲基乙二胺，2.8 ×10-5mol/L核黄素和0.036
mol/L磷酸盐缓冲液(PH值7.8)中浸泡20 min。在80瓦光下进行，来回振
荡
3、最后将胶放在0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.8），10-4 mol/L的EDTA
溶液中光照20min并显带。也是在80瓦光照下进行，EDTA要溶解充分注意：以上步骤，要严格控制好时间，NBT，磷酸盐缓冲液可以先配保存。
细胞染色方法总结
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！ 染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential)，而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。 JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1～5mg/ml)，储存于-20℃，用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦 下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。
同工酶分析
锰胁迫下美洲商陆CAT, POD活性的变化以及同工酶谱分析 专业：生物科学 作者：范英姿指导老师：彭喜旭，王海华 (湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201) 摘要:采用室内培养及生理指标测定方法，研究了不同锰胁迫水平（0.005，0.010，0.015 mol/L）下，美洲商陆幼苗中过氧化氢酶（CAT）活性、CAT和过氧化物酶（POD）同工酶谱带的变化，结果表明：随着锰浓度的增加，美洲商陆幼苗中CAT活性呈一个先增大后降低的趋势，CAT同工酶电泳分析表明，处理和对照中，CAT谱带均为一条，迁移率相同(Rf=0.41)；CA T谱带亮度变化表明，第2d的10000 mmol/L CAT同工酶活性最强，而到第4d美洲商陆CA T活性降低，与CA T紫外光光度计测活性结果一致；POD同工酶电泳分析表明，POD活性变化趋势与和CA T一致，提示在0.005～0.015 mol/L浓度范围的锰胁迫下，美洲商陆的活性氧清除能力增强，而0.015 mol/L时，美洲商陆活性氧清除能力下降。 关键词:锰胁迫；美洲商陆；CA T；POD；同工酶谱分析 Manganese to deal with excessive land CAT, POD and changes in the activity of the isozyme spectrum analysis Major：Life Sciences Author: Fan Yingzi Director: Peng Xixu, Wang Haihua (School of Life Science, Hunan University of Science and Technology Xiangtan 411201, Hunan) Abstract: Indoor cultivation and use of physiological indicators of method to study the different stress levels of manganese (0.005,0.010,0.015 mol / L), Phytolacca americana seedlings in the catalase (CAT) activity, CAT and peroxidase (POD) Isozyme bands change, The results showed that: With the increasing concentration of manganese, Phytolacca americana seedlings in the CAT activity increased after the first was a decreasing trend, CAT isoenzyme electrophoresis analysis showed that the treatment and control of, CAT are a band, the same rate of migration (Rf = 0.41); CAT bands brightness changes show that the first 2 d of 10000 mmol / L CAT isozyme of the strongest, and to the first American to land 4 d CAT activity decreased, and CAT ultraviolet spectrometer measurement of results are consistent; POD isoenzyme electrophoresis analysis showed that, POD activity of CAT and consistent with the trend, Tip in the 0.005 ~ 0.015 mol / L manganese concentration of the stress, the Inter-American to land the ability to enhance the removal of reactive oxygen species, and 0.015 mol / L, Phytolacca americana active oxygen scavenging ability. Key words: manganese stress; Phytolacca americana; CAT; POD; isozyme spectrum analysis.
细胞染色方法大全
细胞染色方法大全 The manuscript was revised on the evening of 2021
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合 (主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察 效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种 hoechsts33258， hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！ 染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚
细胞染色方法
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)的配制 贮存液：70%酒精溶解，浓度100 μg/ml，配好后用锡纸包起来，避光，可在4摄氏度下长期保存。 使用浓度：贮存液用1xPBS稀释1000倍，最终浓度100 ng/ml。 10x PBS的配制 80 g NaCl 2 g KCl g 无水Na2HPO4 2 g 无水KH2PO4 加水到1000ml 贮存液可根据需要用蒸馏水稀释 荧光封片液 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合， 染色与观察： 制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色10分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm.
注意事项： DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。 上：正常绍鸭成纤维细胞核，下：凋亡核 Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。 Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。 Lyso-Tracker Red呈红色荧光，检测时的最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm。 按照1:20000的比例稀释，可以配制1000ml Lyso-Tracker Red工作液。 可用于家蚕脂肪体细胞autophage监测。见李胜文章。
病理切片的特殊染色方法
1. Van Gieson苦味酸和酸性品红法 【染色方法】 (1)中性甲醛固定组织，石蜡切片； (2)组织切片脱蜡至水； (3)用Van Gieson液染1?5分钟； (4 )倾去染液，直接用95 %乙醇分化和脱水； (5) 无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 【结果】胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞呈黄色。2. Masson氏结缔组织三合染色法 【染色方法】 (1)石蜡切片厚6ym,脱蜡至水； (2)0.2 %冰醋酸水溶液浸泡片刻； (3)Masson氏染色液中5分钟或更长时间； (4)0.2 %冰醋酸水溶液浸泡片刻； (5) 5 %磷钨酸水溶液2?3分钟，再入0.2 %冰醋酸水溶液浸洗 (6 )投入淡绿、冰醋酸水溶液浸染5分钟或更长时间； (7)再入0.2 %冰醋酸水溶液浸洗片刻； (8)脱水、透明和封固。 【结果】胞浆和神经胶质纤维染红色，胶原纤维染绿色。 【染色方法】 (1 )石蜡切片、脱蜡至水； (2)0.25 %高锰酸钾液3分钟； (3 )蒸馏水洗2次； (4) 1 %草酸漂白即可； (5 )蒸馏水洗2次； (6) 2.5 %铁明矶水溶液媒染5?10分钟，蒸馏水洗多次; (7)二氨氢氧化银浸染1分钟，蒸馏水洗3次； (8)10 %甲醛液还原2分钟，蒸馏水洗3次； (9)0.2 %氯化金液调色1?2分钟，蒸馏水洗3次； (10)5%硫代硫酸钠固定5分钟； (11 )蒸馏水洗，需要时复染； (12)水洗、脱水、透明和封固。
【结果】网状维呈黑色，其他组织呈复染的颜色。 显示弹性、胶原纤维的双重组合染色法 【染色方法】 (1)中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水； (2)切片入70%乙醇中洗2分钟； (3)将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染0.5?2小时； (4)直接入95%乙醇中分色数秒钟； (5)浸入蒸馏水洗2分钟； (6)用丽春红S液滴染切片5分钟； (7)直接用无水乙醇冲洗多余染色液2次； (8 )将切片在空气中或冷风干燥； (9)二甲苯透明，中性树胶封固。 【结果】弹性纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色 【染色方法】 (1)冰冻切片厚度8?15ym; (2)Harris苏木素，染约1分钟； (3)自来水洗后，用0.5%盐酸乙醇分化，再水洗直至胞核返蓝为止； (4)蒸馏水洗后移入70%乙醇内浸洗一下； (5)浸入苏丹III染液中约30分钟或更长时间(如果置于56 °C温箱中可适当缩短时间)； (6)在70 %乙醇分化数秒钟； (7)待切片在空气中稍凉干或用冷风机吹干； (8 )及时用明胶甘油封片。 【结果】脂肪呈橘红色，脂肪酸不着色，胞核淡蓝色。 高碘酸一Schiff ( Periodic acid Schiff ，PAS)染色法 【染色方法】 (1) 切片脱蜡至蒸馏水； (2) 浸入高碘酸氧化液中10?20分钟； (3 )蒸馏水洗2次； (4) Schiff液染色10?30分钟；
细胞固定、染色原理与方法
细胞固定、染色原理与方法 一、固定与固定液 (一)固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。 1.目的 (1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。 (2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。 (3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。 (4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。 (5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。 2.时期 (1)有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。 (2)减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。 小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm，花药长度大致在1-2mm左右，黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。 玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。 蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。 3.固定时的注意事项 (1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。 (2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。 (3)固定的时间要合适： 与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。 经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。 (二)固定液固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好，而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡诺氏固定液等。 1.固定液的条件 (1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。 (2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。 (3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。 (4)使细胞内的成分凝固或沉淀。 (5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。
细胞各种染色方法
细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法，本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。 第一节培养细胞的常规检查和观察方法 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞常规检查观察的内容为： 一、肉眼观察 一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH，会影响细胞的生长，甚至造成细胞退变死亡。所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代。一般更换培养液的时间，依营养物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。 二、显微镜观察 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。 三、细胞的生长状态 细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系，胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，3～4天便可连接成片。成体组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。 四、微生物污染 细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等
2017年主管检验技师考试临床血液学检验练习题第四章血细胞化学染色的临床应用
2017 第四章血细胞化学染色的临床应用 一、A1 1、采用过氧化物酶染色鉴别急性粒细胞白血病与急性淋巴细胞白血病的主要鉴别点是 A、急性粒细胞白血病阳性颗粒呈弥散分布，急性淋巴细胞白血病阳性颗粒呈局灶分布 B、急性粒细胞白血病阳性颗粒较多且粗大，急性淋巴细胞白血病阳性颗粒较小且细小 C、急性粒细胞白血病阳性颗粒较小且细小，急性淋巴细胞白血病阳性颗粒较多且粗大 D、白血病性原始粒细胞呈阴性反应，原始、幼稚淋巴细胞均呈阳性反应 E、白血病性原始粒细胞呈阳性反应，原始、幼稚淋巴细胞均呈阴性反应 2、过氧化物酶染色呈阴性的细胞是 A、早幼粒细胞 B、中性中幼粒细胞 C、淋巴细胞 D、嗜酸性粒细胞 E、单核细胞 3、过氧化物酶染色阳性反应程度最强的是 A、中性分叶核粒细胞 B、嗜酸性粒细胞 C、嗜碱性粒细胞 D、单核细胞 E、淋巴细胞 4、过氧化物酶染色结果显示“颗粒较粗，局灶分布”，结果判断应为 A、（－） B、（＋） C、（＋＋） D、（＋＋＋） E、（＋＋＋＋） 5、属于细胞化学染色的是 A、瑞氏染色 B、革兰染色 C、墨汁染色 D、抗酸染色 E、铁染色 6、过氧化物酶染色中，被初生态氧氧化的物质是 A、酒石酸 B、重氮盐 C、过碘酸 D、四甲基联苯胺 E、亚铁氰化钾
7、关于氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色，下列概念不正确的是（）。 A、其活性随粒细胞的成熟而增强 B、淋巴细胞、浆细胞和幼红细胞均呈阴性 C、单核细胞为阴性，个别呈弱阳性 D、急性粒细胞白血病原始细胞多呈阳性 E、原粒细胞为阴性反应或阳性反应，自早幼细胞至成熟中性粒细胞均为阳性反应 8、中性粒细胞碱性磷酸酶积分（NAP）在下列疾病的鉴别中，哪项是不正确的（）。 A、慢粒时NAP积分明显降低，而类白血病时则明显升高 B、急淋时NAP积分明显降低，而急粒时则明显升高 C、PNH病时NAP积分明显降低，而再障时则明显升高 D、真性红细胞增多症时NAP积分明显升高，而继发性红细胞增多症时NAP无明显变化 E、骨髓增生异常综合征，NAP积分值减低，骨髓纤维化NAP可增高 9、最适宜用于鉴别原粒和原淋的细胞化学染色是（）。 A、过氧化物酶 B、糖原 C、碱性磷酸酶 D、α-丁酸萘酚酯酶和氟化钠抑制试验 E、酸性磷酸酶 10、关于α-丁酸萘酚酯酶（α-NBE）染色，下述概念不正确的是（）。 A、粒细胞系统均为阴性反应 B、幼单核细胞为阳性反应，不被NaF抑制 C、组织细胞呈阳性反应，不被NaF抑制 D、非T非B细胞可呈颗粒状阳性 E、幼单核细胞为阳性反应，可被NaF抑制 11、中性粒细胞碱性磷酸酶活性增高主要见于（）。 A、多发性骨髓瘤 B、阵发性睡眠性血红蛋白尿 C、急性粒细胞白血病 D、慢性粒细胞白血病 E、细菌性感染 12、关于醋酸AS-D萘酚酯酶（AS-D-NAE）染色，下述概念不正确的是（）。 A、急粒时，白血病细胞可呈阳性反应，且不被NaF抑制 B、急单时，白血病细胞可呈阳性反应，但被NaF抑制 C、红细胞系统均呈阴性反应 D、淋巴细胞呈弱阳性反应 E、急性粒-单核细胞性白血病，部分白血病细胞呈阳性反应，部分呈阴性反应 13、最适宜用来鉴别急性单核细胞白血病和急性粒细胞白血病的细胞化学染色是（）。 A、过氧化物酶 B、糖原
细胞染色方法大全
染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI 单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不 同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane
常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法
常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法 吕俊耀1, 于晓军1, 刘卯阳2 ( 1.汕头大学医学院法医学教研室, 广东汕头515031; 2.北华大学医学院法医学教研室, 吉林吉林132003) 常规组织切片的制作过程较繁琐, 按具体制作效能分为固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等九大步骤。其中脱水有12 个步骤、透明有2 个步骤、浸蜡有3 个步骤、染色有23 个步骤, 一般要经过总计40～45 个步骤, 各个实验室根据自身的实际情况及工作习惯各有不同。事实上, 从尸体储藏到切片染色的整个过程中, 任何步骤出现问题均可影响切片的质量, 因此, 要提供高质量的石蜡切片, 必须对各种潜在的影响因素严加注意, 同时, 观察组织切片时, 还应对可能出现的切片染色质量问题给予充分考虑, 以避免制片过程中的人为假象干扰而作出错误诊断。现综合有关文献及笔者的经验, 讨论常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法( 表1) 。 1 固定和取材 组织切片的固定剂主要为甲醛和酒精, 固定剂可与蛋白质交联结合、使之变性, 组织硬化、结构固定,此外其本身的变性物质可与染料结合, 增强着色能力。同时, 固定交联和沉淀蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞内物质成分, 产生不同的折光率, 使得光学显微镜下易于更清晰地观察组织细胞的微细结构。 常见的与固定过程相关的组织切片染色问题及解决方法见表1。在诸多影响切片质量的因素中, 尤以固定较为重要。 1.1 减少或去除组织切片中甲醛颗粒 甲醛饱和液偏酸, 影响细胞核的染色, 特别是放置较久后, 易析出沉积在组织切片中, 呈细小的黑褐色或黄黑色颗粒物, 影响观察。以甲醛饱和液和pH7.2 的PBS 缓冲液配制的10%中性甲醛固定液( 体积比为1∶9) 应用最普遍, 效果也相对较好, 可以减少和消除甲醛颗粒。如果现场无法配制PBS 缓冲液, 可在固定溶液中加入一些普通白粉笔, 使溶液呈中性或弱碱性。甲醛颗粒易于出现在血液和血浆分布区, 以及自然腐败较重的组织, 可作为组织出血和血浆渗出指示剂。 1.2 防止组织固定不良
实验十 同工酶分析
实验四同工酶分析 同工酶概述 酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。 同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。可以进行同工酶分析的酶已有100多种。不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。 从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因： （一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。这个 学说有广泛的实验证据。如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基， 按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、 LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。 （二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。因而产生同工酶。由不同基因引起的同工酶存在于 同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族 中。 （三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体 （26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。 （四）多肽链的续发变化多肽链合成后的续发变化与遗传因素无关。续发变化如果只改变部分分子的非活性中心局部结构、组成或对部分分子影响程度不一，都回产 生不同的同工酶。常见的续发改变有脱氨基作用、甲酰或乙酰化作用、巯基氧化、 磷酸基团相加、部分肽段脱落、多糖或辅酶的增减。 （五）酶空间构象的差异组成、结构相同但空间构象不同的酶分子，其暴露在分子外表的残基不同，会导致其理化性质上的差异，从而形成不同的同工酶。 从以上关于同工酶形成的来看，除了续发改变形成的次生同工酶外，可以说同工酶的差异都是由它们的基因决定的。因此同工酶作为基因表现的标记是可靠的。 同工酶多型性研究、原级和次级同工酶的鉴别、同工酶结构与功能关系的研究等，必须将不同的同工酶分子分离，区带电泳是分离同工酶的最佳方法之一，等电聚焦电泳可将一级结构相同而空间构象不同的同工酶分子分离开来，进而拓宽了该技术的使用范围。通过电泳分离出来的同工酶带，再采用酶组织化学技术染色形成酶谱即可进行分析鉴定。显色的主要方法有以下几种： （一）呈色法直接利用酶作用于底物产生有色产物。如以无色的磷酸酚酞作为底物，经酸性磷酸脂酶催化水解脱出酚酞，反应系统再改为碱性条件，酚酞即呈红色，直接标出同工酶带。同理，用兰色淀粉可测定淀粉同工酶谱，用联苯胺可测定过氧化物酶同工酶酶谱。 （二）化学反应显色法采用不同的化学试剂使酶促反应的产物或尚未分解的底物显
血细胞化学染色检验
血细胞化学染色检验 发表时间：2011-05-13T17:08:37.940Z 来源：《中外健康文摘》2011年第5期作者：张辉[导读] 中性、嗜酸性较细胞及单核细胞胞质能将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，生成蓝色颗粒。 张辉 (黑龙江省林甸县中医院 166300) 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)5-0146-02 【关键词】血细胞检验染色 (一)过氧化物酶(POX)染色中性、嗜酸性较细胞及单核细胞胞质内含过氧化物酶(POX)，能将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，生成蓝色颗粒。 1.酶活性增高可见于再生障碍性贫血、急性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、放射病，嗜碱性粒细胞在慢性粒细胞白血病时可出现阳性。 2.酶活性减低可见于肿瘤、MDS、链球菌感染、风湿热等。 (二)中性粒细胞碱性磷酸酶染色 中性粒细胞中的碱性磷酸酶(NAP)能使试剂中的成分产生一系列化学反应，形成棕黑色颗粒定位于胞质中。胞质中出现灰色到棕黑色颗粒为阳性反应，视反应强度可分为阴性反应，+～4+。由此可计算出NAP阳性细胞的百分率和阳性积分值。 1.NAP积分增高可见于①细菌性感染时，NAP活性明显增高，病毒性或寄生虫性感染时常无明显变化或减低，这有助于感染性质的鉴别；②真性红细胞增多症以及再生障碍性贫血；③类白血病，由化脓性球菌引起的白血病反应；④急性淋巴细胞性白血病；⑤多发性骨髓瘤时，NAP活性显著升高；⑥烧伤、中毒、手术、外伤等。 2.NAP积分降低可见于①慢性粒细胞性白血病时NAP活性明显降低，经治疗病情缓解时活性恢复正常，急变时活性增强，有助于对病情判断；②粒细胞缺乏症、脾功能亢进等疾病；③感染革兰阴性杆菌、结核、病毒感染以及立克次体病等。 (三)酸性磷酸酶染色 血细胞中的酸性磷酸F(ACP)在酸性条件下水解试剂中的成分，产生的化学反应形成黑色颗粒定位于胞质中。 1.单核细胞、网状细胞、巨噬细胞、组织细胞中此酶呈阳性反应，有助于急性单核细胞性白血病、组织细胞性淋巴瘤及恶性组织细胞病的诊断。 2.毛细胞白血病时呈阳性反应，且不为左旋酒石酸所抑制，有助于毛细胞白血病的诊断。 3.高雪细胞呈阳性反应尼曼-匹克细胞细胞呈阴性反应，有助于两者鉴别。 (四)特异性酯酶染色 特异性酯酶(SE)为粒细胞所特有，能将试剂成分形成不溶性红色沉淀定位于胞质中。 急性粒细胞性白血病时，原粒及早幼粒细胞的SE活性显著增强；急性单核细胞性白血病时一般呈阴性反应；急性淋巴细胞性及单核细胞性白血病时均呈阴性反应。 (五)非特异性酯酶染色 血细胞中的非特异性酚酶(NSE)能将试剂中的成分形成不溶性的有色沉淀定于胞质中。 NSE主要存在干单核细胞系，从原单核细胞到成熟单核细胞其活性逐渐增强，粒系细胞一般为阴性或弱阳性反应，淋巴细胞系一般呈阴性反应。在急性单核细胞性白血病时呈强阳性反应，但其活性能被氟化钠抑制。急性粒细胞性白血病时，有部分病理可呈弱阳性反应，但其活性不被氟化钠抑制，有助于急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病的鉴别。 (六)糖原染色 糖原染色又称过碘酸-雪夫(FAS)反应。过碘酸能将血细胞内的糖原氧化后与雪夫试剂反应形成紫红色化合物定位于细胞质中。胞质中出现红色颗粒或块状物质为阳性反应因细胞不同，其反应程度各异粒系细胞中原始粒细胞多呈阴性反应；早幼粒细胞以下各阶段随细胞成熟，阳性反应增强；红系细胞呈阴性反应；单核细胞呈弱阳性淋巴细胞多呈阴性；巨核细胞及血小板均呈阳性反应按阳性强度计算积分值。 1.鉴别良性与恶性淋巴细胞增生性疾病在良性淋巴细胞增生如传染性单核细胞增多症时，其淋巴细胞PAS阳性反应产物呈细小颗粒状，积分值正常；在恶性增生时如恶性淋巴瘤、急或慢性淋巴细胞性白血病时，其淋巴细胞中常呈粗颗粒或块状红细胞沉淀的阳性反应，积分值增高。 2.鉴别幼红细胞增生的性质在巨幼红细胞性贫血、溶血性贫血时，幼红细胞PAS反应积分值正常；在红血病、红白血病时则呈强阳性反应，积分值增高。 3.鉴别急性白血病的类型原始及幼稚粒细胞PAS反应呈阴性；原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞反应呈颗粒状或块状阳性；原始单核细胞及幼稚单核细胞反应呈弥漫性强阳性。 4.鉴别某些细胞类型如巨核细胞呈强阳性反应，尼曼-匹克细胞呈弱阳性或阴性，李-斯细胞一般为阴性或弱阳性反应。 (七)铁染色 骨髓组织中的含铁血黄素(细胞外铁)和幼红细胞中的铁粒(细胞内铁)在酸性溶液中与亚铁氰化钾反应，生成蓝色沉淀定位于含铁部位及胞质中。 1.细胞内外铁消失或减低，见于铁原料摄入降低，铁吸收功能障碍或铁的丢失和消耗过度，使幼红细胞血红蛋白合成量减少或障碍，如临床常见的缺铁性贫血及能引起机体缺铁的相关疾病，如钩虫病、ITP等均能使机体细胞内外铁减少，产生贫血症状。 2.细胞内外铁增多，见于机体造血功能障碍，铁利用和转换能力下降或迟缓，临床常见的疾病有再生障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血、骨髓增生异常综合征、溶血性贫血、白血病等。 3.铁染色与血清铁、总铁结合力联合检测，有助于了解机体内铁的动态变化以及铁剂治疗的效果，可评价骨髓代偿造血能力。参考文献
细胞染色方法
一、形态学观察方法 1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽” 现象。 2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色 质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜 完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞 质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 二、DNA凝胶电泳 （一）、检测原理 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA 片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 （二）结果判断 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA 法检测。 （一）检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体? 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合… 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合? 4、加酶的底物，测光吸收制。 （二）用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。 四、流式细胞仪定量分析 （一）检测原理 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 （二）应用价值 流式细胞仪检测具有以下特点： 1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2)、可以做许多相关性分析 3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期 ■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
常用血细胞化学染色原理及应用
常用血细胞化学染色原 理及应用 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
常用血细胞化学染色原理及应用 （1）过氧化物酶染色的原理和临床意义（POX） [原理]粒细胞和单核细胞胞浆中含有的过氧化物酶能将底物过氧化氢分解，产生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧化为蓝色联苯胺。后者进一步变成黑色化合物，沉积于胞质内。 正常血细胞的染色反应： 1.粒细胞系---原粒大多数呈阴性反应，有点渴出现少量蓝黑色颗粒。自早幼粒致成熟中性郡城阳性反应，细胞月成熟，阳性越强。中性分叶核强阳性，嗜酸性粒细胞阳性反应最强，其阳性颗粒比中性粗大，有折光性。定位于胞质内。嗜碱性粒细胞呈阴性反应。 2.单核细胞系-原始单核呈阴性反应，幼稚单核及单核呈弱阳性,阳性颗粒少而细小，均匀分布，有时也可呈阴性反应。 3.红细胞系、淋巴细胞系、巨核细胞系、浆细胞系---均呈阴性。有的巨噬细胞可呈阳性。 （2）过碘酸-雪夫染色的原理和临床意义（PAS） [原理]过碘酸-雪夫又称糖原染色。胞浆内存在的糖原或多糖类物质（如黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基经过碘酸氧化，转变为二醛基，与雪夫试剂中的无色品红结合，形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位。该反应称为过碘酸-雪夫（PAS）阳性反应。 正常血细胞的染色反应： 1.粒细胞系-----原粒细胞多呈阴性,至早幼粒至中性分叶核粒细胞呈阳性反应，并随细胞熟，阳性反应的强度逐渐增强。嗜酸粒细胞本身不着色，而颗粒之间的胞浆呈红色，嗜碱粒细胞为阳性反应，阳性物质为大小不一的紫红色颗粒。 2.单核细胞系---原单位阴性，幼单为（+）阳性反应，单核细胞为（+）~（++）阳性反应。 3.淋巴细胞系---大多数淋巴细胞为阴性反应，少数淋巴细胞可为（+）阳性反应。 4.红细胞系----红细胞系的各个阶段皆呈阴性反应。
组织切片制备及染色技术
组织切片制备及染色技术 （一）常规石蜡切片的制备： （1）取材与固定：切取组织时应使用锋利的刀、剪，切取组织块时，从刀的根部开始向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2~0.3cm，大小为1.5cm x 1.5cm x 0.3cm为宜。取好的组织块用10%福尔马林溶液固定24~48h。 （2）包埋：先经梯度乙醇脱水后用二甲苯透明，然后入溶融的石蜡中浸透每次30min，共3次；再包埋。 （3）切片：包埋好的石蜡块即可进行切片；切片的厚度为5μm左右。 （二）苏木精－伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色方法： （1）脱蜡：主要用二甲苯脱蜡。 （2）梯度乙醇水化。 （3）自来水冲洗。 （4）苏木精染色：水化后的切片放入苏木精染液中浸5~20min，染细胞核。自来水冲洗3~5min。 （5）1％盐酸乙醇分化5~30s。自来水冲洗1~3min。 （6）弱碱性水溶液返蓝30s~1min。自来水充分冲洗5~10分钟。 （7）伊红染色：充分水化后的切片直接入伊红染色液中，染细胞质5~15min左右。（8）梯度乙醇脱水。 （9）二甲苯透明。 （10）中性树胶封片。 二、组织化学及免疫组织化学技术 （一）组织化学（histochemistry）：一般称为特殊染色，基本原理是通过应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂，定位地显示组织细胞的特殊化学成分并保持原有的形态学改变，对一些代谢性疾病的诊断具有一定的参考价值。通过光镜或电镜观察，可以检测组织切片内的蛋白质、糖类、脂类、酶类、核酸与某些金属元素等。 1.过碘酸雪夫氏染色（periodic acid-schiff stain，PAS染色）：过碘酸是一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1.2乙二醇基使之变为二醛，醛与Schiff氏试剂结合，形成红色的取代色素而得到定位。PAS染色可显示糖原、中性黏液物质、基底膜、软骨、垂体、霉菌及寄生虫等物质。是广泛应用的染色方法。在肾小球肾炎时PAS染色可显示基底膜和系膜区的改变。 染色方法： （1）切片按常规脱蜡水洗，再用蒸馏水洗涤。 （2）0.5%~1％过碘酸水溶液氧化5~10min。 （3）蒸馏水充分洗涤，至少3次。 （4）Schiff氏试剂染10~30min。 （5）倾去染液后，直接用亚硫酸冲洗液处理切片3次，每次2 min，以达到分化。 （6）自来水冲洗5~10 min，使之显现出红色。然后蒸馏水洗1次。 （7）明矾苏木精染核，自来水充分洗涤。 （8）95%乙醇及无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。 结果判定：PAS阳性物质呈鲜紫红色，其它组织淡粉红色，细胞核呈浅蓝色。 2.结缔组织的染色方法 一般所说的结缔组织是指纤维性结缔组织而言，其结构特点是细胞间质内基质外含有较多的纤维成分，主要是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维，我们仅简述这三种纤维的常见染色方法。