大规模细胞培养缩小模型开发及工艺表征的系统研究方法

A Systematic Approach for Scale-Down Model Development and Characterization of Commercial Cell Culture Processes

皇家药院译

摘要：工艺特性鉴定是为了阐明制造工艺的耐用性，主要研究关键操作参数和最终效能之间的关系。特性鉴定研究中的技术信息对于后续的工艺验证至关重要。近几年来这已经成为监管期望。由于进行生产规模的验证研究是几乎不可能的。开发能够代表商业工艺的缩小模型是实现可靠的工艺表征所必须的。在本研究中，我们介绍了一个开发生物反应器缩小模型和表征表达重组蛋白的CHO细胞培养工艺的系统研究方法。首先，我们使用2L反应器在2000L商业规模工艺的基础上开发缩小模型。对比两个规模的细胞生长状况、产量、产品质量、培养环境(pH、DO、pCO2)和代谢水平(葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、氨)，从而限定缩小模型。对关键操作参数进行单因素的范围研究，然后才有建立的缩小模型进行相互作用研究。为了能够成功进行工艺验证及确保工艺性能的一致性，我们将会确定合适的操作范围及某些关键参数的可接受标准。通过相互作用研究鉴别该工艺的最坏条件。

简介：

在实验室和中试规模完成一个生物制品生产的细胞培养工艺开发之后，将会开启商业化进程，包括工艺表征、放大、技术转移及生产现场的验证。工艺表征需要进行系统研究以详细商业规模细胞培养，主要包括关键操作参数和最终细胞培养性能间的关系，主要为细胞生长、产量以及终产品的质量属性，例如活性、翻译后修饰及杂质概况。工艺表征的目标包括鉴别关键操作和性能参数，建立关键参数的可接受范围，并阐明工艺耐用性。表征研究获得的技术信息近几年已成为监管期望，可以作为制造工艺验证先决条件以及为长期商业化生产提供支持。因为费用较为昂贵且可用的大规模生物反应器有限，所以在生产规模进行表征研究是几乎不可能的，常常在实验室规模采用能够代表生产规模工艺性能的缩小模型。为了计算一致性和准确性，需要在整个表征研究中采用合格的分析方法。细胞培养工艺表征的整体步骤如图1所示，详细步骤将会在底下的文字中进行介绍。

风险评估：在开始表征研究之前需要对整个细胞培养工艺潜在的失败风险进行评估，主要包括对培养基配制、种子培养和生产阶段等的进行评估，以对风险的程度进行区分。故障模式与影响分析可以欧威区分操作参数并评估其对过程的潜在影响的系统方法，FMEA是一个实用的分析工具，能够知道工艺评估并确定哪些操作参数需要进行更进一步的表征。FMEA基于以下三个方面进行权衡：操作参数发生漂移的影响严重程度，发生频率以及漂移的可检测性。在工艺开发工作的历史数据的基础上，工艺开发工程师将能够评价操作参数的严重性。操作人员对全规模生产设备操控的熟悉度需要提供发生和检测信息。因此，故障模式与影响分析通常需要各个团体的共同努力，包括工艺开发、工艺过程、生产制造以质量控制。通过风险评估，应该可以基本明确关键工艺参数及其控制和表征范围、关键性能参数。

缩小模型开发及证明：在缩小模型开发的过程中，需要说明实验室规模和商业规模的关键性能参数的等价性。理想情况下，商业规模的性能参数应该作为基线指导缩小模型的开发。如果没有全国模的数据，中试规模的性能可以提供初步的放大信息。在以上情况下，工艺表征具有一定的危险性，一旦获得商业规模的数据应对模型进行重新评价。

缩小模型开发及证明的典型过程如图2所示，实验室规模生物反应器通常作为生产阶段的主要缩小模型，其它的培养系统如摇瓶和转瓶常被用于种子培养阶段和筛选原料。一个好的缩小模型不仅需要与生产规模的性能相匹配，还要与关键操作参数改变的响应相匹配。因为在正常操作条件下对两种规模进行比较是不切实际的，因此需要采用一个适当的缩小比例以确保不同规模间比例的一致性。然后我们就可以在工艺表征研究中采用缩小模型去测试操作参数变化对工艺性能及产品质量属性的影响。细胞培养操作参数可以分为体积依赖参数(工作体积、补料不体积、搅拌、通气)和非体积依赖型参数(pH、溶氧、温度)。缩小模型开发的大致策略是适当缩小体积依赖型参数，保持与大规模工艺设置点一样的非体积依赖型参数。然而，反应器搅拌速度和通气速率等体积依赖型参数往往比较难进

行线性缩小，因为生物反应器的几何形状、液体表面积和体积比、通气状况和控制能力等。因此，在不显著影响最终工艺性能和产品质量的情况下，体积依赖型参数可能会采用不同操作条件。

建立了缩小模型后，需要证明缩小模型与大规模工艺的可比性。明确细胞培养工艺的关键性能参数如细胞生长情况、产品质量属性以及可接受范围，并作为缩小模型的资格标准。理想情况下规模比较研究应该在相同的条件下进行平行对比研究，包括原料、培养基、种子等，除体积依赖型参数外的参数都要在各参数的中性附近。

单因素范围研究：此步骤的主要目的是鉴别关键操作参数及其可接受范围。范围研究将会在保持其它参数保持不变的同时改变一个操作参数。一个操作参数的不同范围如图三所示。操作范围的中心点(OR)常作为工艺控制设置点除非该参数正在进行参数评估。将会采用操作范围的两倍到三倍范围去测试操作参数对最终工艺性能的影响。参数的可接受范围将会位于表征范围的内部或外部，主要取决于受表征的各种操作条件下的最终的细胞培养性能结果。基于个别参数导致的工艺失败风险通过FMEA分析确定每个潜在关键操作参数的表征范围。对涉及多个参数的工艺的关键参数的筛选可以采用试验设计(DOE)进行。然而，因为细胞培养工艺的潜在关键操作参数的数量相对较少，且操作参数对工艺性能的影响是高度非线性的，单因素范围研究更适合用于筛选关键因素和确定可接受范围。

实验设计相互作用研究和最糟糕案例研究：在单因素范围研究确定关键操作参数之后，接着进行参数间的相互作用影响。常常采用统计学设计实验，部分析因设计以两个不同的水平代表每个操作参数的上限和下限。然而，需要注意的是，部分析因设计不能解决所有的相互作用，因为关键参数间的相互作用可能会被非关键相互作用参数所影响。在DOE设计时，必须确保重要相互作用不被非重要相互作用所干扰。相互作用研究的结果将会被用于确认生产工艺的耐用性。DOE 实验也能帮助确认最糟糕案例条件，由每个参数的极组合而成，从而在生产时产生最糟糕的性能。关键性能参数常用于鉴别最糟糕案例条件，例如细胞活率、产品滴度、产品质量属性。需要对最糟糕案例条件生产的原料进行进一步纯化，从而评价是否会对下游操作及产品质量造成影响。表征研究可以基于不同的操作单元分解为多个部分。一个典型的细胞培养生产工艺包括种子复苏，种子扩增及生产阶段，通常需要分别进行表征。此外，还应进行培养基保存测试及细胞系稳定研究。细胞培养表征分析组强大的支持才能监控产品的质量。同时也需要下游收获和纯化组的合作。表征研究所使用的一些细胞培养材料可以作为下游操作的进料流，特别是最糟糕案例研究。

材料及方法

细胞系和培养基：

本研究采用的是表达重组糖蛋白的CHO细胞系，培养基为专利无血清培养基及补料溶液，培养方式为悬浮培养；剪切力保护剂的浓度为0.5g/L的PF-68。细胞培养操作：

细胞培养工艺为在固定时间点进行补料的补料批式培养，时长为13天。小规模细胞培养实验的反应器为2L Applikon生物反应器，开始培养的体积为1.4L，最终工作体积为2L。大规模细胞培养采用的是2000L的生物反应器，初始体积为1400L，最终的工作体积为2000L。共进行4次2000L培养，为缩小模型开发建立性能基线。

分析方法：

每天取样在Cedex cell counter进行计数，记录活细胞密度及活率。葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸和氨等细胞培养代谢物采用NOV A Bioprofile 400进行检测，离线pH和溶氧采用血气分析仪进行分析。蛋白产物浓度采用HPLC进行检测。糖型采用等电聚焦电泳进行分析。

结果及讨论

缩小模型开发及证明：

因为溶氧、温度、pH、接种密度、营养物质浓度、搅拌剪切力、气体鼓泡等参数能显著影响细胞声场和蛋白质产量，所以在细胞培养工艺缩小模型中将这些参数作为关键参数。缩小模型开发采用2L的Applikon生物反应器。大规模生物反应器和小规模生物反应器的为体积依赖型参数均设定在相同的设置点。在体积依赖型参数中，生物反应器工作体积和补料体积根据体积的差别进行线性缩小，而叶轮搅拌速度、通气速率需要进行调整，不完全取决于体积比。因为哺乳动物细胞对剪切力较为敏感，高搅拌速度会对细胞产生剪切力伤害，但是低搅拌速度又会引起传质效果不好且有时会引起细胞结团。每体积功率、叶轮尖端速度、能量消耗等准则都已经被作为搅拌速度放大的匹配目标。本文将研究基于等单位体积功率(P/V)和等叶轮尖端速度的放大策略。在2L生物反应器中，对150、250、350、450、550rpm等5个搅拌速度进行筛选，其中基于2000L商业化规模的搅拌速度设置，350rpm和550rpm分别代表了等P/V和叶轮尖端速度。图4显示了不同搅拌速度下的细胞生长特性及细胞活率。在150rpm、250rpm、和350rpm时，2L生物反应器的细胞生长情况和细胞活率与生产规模具有可比性。在450rpm和550rpm时，细胞密度和细胞活率均会降低。搅拌和气泡通气均能对细胞造成剪切力伤害。因为高转速的同时需要降低氧气通气速率以维持相同的氧气置换速率，实验中所观察到的细胞活率降低很可能是由于搅拌引起的剪切力损伤。这一结果表明，在2L生物反应器中，高搅拌速度产生的剪切力不利于细胞的生长。在350rpm时稍高的终细胞密度和2000L规模的细胞生长状况更加吻合，所以选择基于等P/V计算得到的350rpm作为缩小模型的搅拌速度，提供与大规模生物反应器具有可比性的混合和剪切力条件。

细胞培养过程中通气的主要目的是为细胞提供氧气并带走培养基中的二氧化碳。主要通过两种不同的模式为生物反应器供氧，一种是表面通气覆盖顶部空间，另一种是通过喷气装置喷射氧气。在培养过程中通过喷气装置改变通气速率，以使溶氧根据细胞生长的需要维持在恒定水平。气泡在小规模生物反应器的停留时间相比于大规模生物反应器更短，因为小规模的生物反应器的页面高度更低。因为两个规模的生物反应器的溶氧水平均控制在相同的设置点，为了达到培养的

溶氧要求，小规模生物反应器的空气通气速率将会比大规模生物反应更快，这导致溶解的二氧化碳浓度更低。另外，在小规模生物反应器中有相当一部分的二氧化碳被顶部通气从页面剥离。相比之下，大规模生物反应因为液体的表面体积比更低，顶部通气对二氧化碳的清除效率更低。为了避免2000L生物反应器出现高浓度二氧化碳累积，将会把氧气和空气混合通入以提高整体的喷气速率，从而更高效率的带走二氧化碳。在整个运行过程中会调整混合气体中空气和氧气的比例，通过DO控制改变氧气和空气的喷射速率。使用空气和氧气混合气体去除二氧化碳的方法不在2L生物反应器中使用，因为小规模培养具有很高的二氧化碳清楚效率。缩小模型整个运行过程中的pCO2大约为20mmHg，低于大规模培养。为了了解不同二氧化碳水平的潜在影响，我们进行了pCO2范围研究。通过喷气装置通入不同速率的二氧化碳，结果显示在一定范围内pCO2的差异不会影响最终细胞培养的性能(数据未显示)。因此，不将pCO2作为缩小模型证明的关键性能参数。在表一中总结了不同类型的操作参数及其缩小策略。根据定义的缩小模型条件进行了6批2L规模试验，并与4批2000L规模的实验进行对比。两个规模的细胞生长情况、活率、产品效价和产品的糖型等性能参数具有可比性。葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、氨等代谢属性也很相似，只有pCO2性质有显著差异。乳酸浓度随着细胞的生长而升高，在培养后期又会被细胞消耗。值得注意的是乳酸浓度在消耗阶段的差别较大。由于在大、小规模的实验中均观察到了较大差异，所以这些差异来自于工艺本身的变异性而不是规模不同造成的。

缩小模型工艺可比性的统计学分析

缩小模型证明的关键性能参数包括细胞密度峰值、完整的活细胞密度(IVC)、产品效价、糖型比例。为了说明实验室规模和生产规模的关键性能参数的等价性，我们采用统计学方法进行分析。

传统t检验只用于检验数据集是否有统计学差异，而不用于检验等价性。在t检验中，可能会拒绝零假设或接受零假设(假设在置信区间水平内数据集没有显著性差异)。拒绝零假设意味着具有统计学差异，而接受零假设只是意味着没有足够的可用的数据证明差异性，而不是意味着数据集的等价性。此外，传统t检验只能说明统计学差异，可能会与实际的差异不同。例如，统计学差异小于检测方法或设备的可靠性，并不能表明由于不同生产规模引起的实际差异。因此，t检验可能会推断出不用规模的工艺性能的非等价性，即使该统计学差异在实际看来微不足道。在这里，我们采用新的等价性检测方法，双单侧检验(TOST)用于确定缩小模型和大规模工艺性能的可比性。将规模可比性定义为-θ < μS - μL < θ，μS 和μL分别为小试和生产规模的性能参数的平均值。如果两个不同规模的性能参数的平均值均落在可接受范围内(-θ, θ)，那么我们就认为这两组性能参数间具有

可比性。可接受范围的设定应根据实际情况来看，并把工艺变异性及分析方法变异性考虑在内。例如，对生产规模的历史数据进行评估，衡量在相同工艺条件下工艺性能的变异性，并根据获得的信息设置可接受范围。基于历史数据的数量及质量，设置可接受标准是有一定难度的。较少的重复次数会导致可接受范围扩大。

本研究中，采用2000L的运行数据确定工艺性能的变异性，以及等价性的接受范围。平均值的正负三个标准偏差内的变异认为是可以接受的，可接受范围设置为[-3σ, 3σ]。使用JMP软件，对终细胞密度、综合细胞密度、产品效价、糖型等四个性能参数进行TOST分析。结果总结如表2，结构表明不同规模工艺的关键功能性能是等价的。因此，证明缩小模型可以用于工艺表征研究。

单因素范围研究

生产阶段的表征研究熊单因素研究开始。溶解氧、接种密度、培养pH、温度、溶解二氧化碳等五个潜在的关键操作参数均在FMEA过程中确定。每一个参数均进行3到6不同的条件进行测试，每个测试均进行两个反应器的重复实验。这些范围研究检验了每个参数在设置点对工艺性能的影响。

每一个操作参数的可接受范围均基于这些研究的结果进行确定。DO和pH的研究做为两个例子进行说明。

图7显示了溶氧对细胞生长和产品质量相关属性的影响。较高溶氧设置点的细胞生长和细胞活率低于中间设置点。而较高溶氧条件下低细胞生长产生了较低效价的产品，茶农的糖基化亚型水平似乎没受到溶氧的影响。较低溶氧不影响细胞培养性能。

图8显示了不同培养pH对工艺性能的影响。在检测的pH范围内，和对照相比，细胞生长和产品效价未受到显著影响。然而，最终产品的糖基化亚型水平在高pH条件下有所提高。以上结果提示某些细胞培养条件对某个性能参数产生影响，而其他的性能参数不受到影响。此外，单个操作参数对最终细胞培养性能的影响采用一个较宽的范围对于可接受范围的选择具有重要影响。

相互作用研究

在完成单因素范围研究之后，确定四个关键操作参数(接种密度、pH、温度、和溶解氧)进行进一步表征，以研究参数间的相互作用。采用可接受范围的上下限，通过两级半部分因子设计研究这四个参数间的相互作用。每个实验设计时所有的参数均在每一次运行中进行高低水平的调节。所有参数均保持在设定点的正点条件除外。这样设计时为了检验所有主要的影响或一些两因素相互作用。目的是为了说明工艺的耐用性及产品质量的一致性。

表三种列出了DOE设计模式及实验结果。以最低的产品效价和最低的亚型水平为基础确定了最糟糕条件，此时操作参数组合为高DO、低pH、低温度、和

高接种密度。以上条件代表了在每个操作参数可接受范围内最糟糕的案例。

图9显示了对于产品效价及异构体水平的主要影响及相互作用。结果显示溶氧对产品效价及异构体水平均有显著的负作用。而pH对异构体水平具有显著影响，对产品效价影响不明显。接种密度只对产品效价有影响，对异构体水平无影响；温度对产品效价及异构体水平均有显著的正影响。

除了在单因素范围研究中确定主要的影外，JMP分析软件还可以用于分析不同操作参数间的相互作用。研究发现有两种相互作用对产品效价有明显影响，DO和温度以及DO和接种密度，而对于异构体水平，只有DO和pH间有明显的相互作用。

结论

本研究介绍了一种用于表征生产规模细胞培养工艺的系统研究方法。采用统计学方法和双向单侧检验比较不同规模间的关键工艺性能参数，开发并验证了能代表大规模细胞培养工艺的缩小模型。在工艺表征中，利用缩小模型系统进行了单因素范围研究和DOE研究，评价了关键操作参数的主要影响及相互作用。通可接受范围内关键工艺参数的组合确定了最糟糕细胞培养条件，在这一条件下产生的中间产物需要进步一步评估，以确定是否会对后续的下游工艺产生影响。

细胞培养的方法与步骤

细胞培养的方法与步骤 1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射） 换液 2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。 3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。 4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。 5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。 6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。 传代 2．拿出细胞，开口，烧，倒液。 3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。 4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。 5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁） 6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次） 7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。 8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。 9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。80微升，100微升都可以。 冻存 8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。 9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。 10．放在4℃30分钟。 11．放在冰水混合物中10分钟。 12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时） 13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月） 14．放入液氮。 注意：传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56℃30分钟水浴。

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

细胞培养基本方法.docx

1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?

(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式

细胞培养方法

细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

常规细胞培养方法

常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法

1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液

4L模型分析法

4L模型 4L模型（英语名：4-layer Model）是指4层式管理分析模型，是一种管理分析工具，管理者可以用它来分析改善经营管理的方法。该模型收录了企业最常见的管理项目，展示了这些项目在企业管理中的相互作用关系，揭示了提高企业管理水平和运营绩效的具体方法。该模型由我国管理学家利志斌提出。 目录 1.企业管理的系统构成 （1）4L模型简介 （2）项目的分类 （3）隐性管理项目 2.各管理项目的基本规律和作用 （1）基本规律 （2）作用 3.提高管理水平和业绩的方法原则 （1）提升企业整体运营绩效的方法 （2）提高外层管理绩效的方法 （3）提高内层管理项目水平的方法 正文 1.企业管理的系统构成 4L模型图： （1）4L模型简介 4L模型以当前最新管理实践知识为依据，收录了企业文化、流程管理、人力资源管理、

学习型组织等十四个普通企业最常见的管理项目。根据管理项目之间相互作用力的大小，这些管理项目被划分为四层；作用力指的是一个管理项目在提升其他管理项目的管理绩效方面所发挥的作用。最里层是第一层，依次往外为第二层、第三层和第四层。各项目之间的相互作用力由里到外呈递减趋势，第一层管理项目作用力最强。 （2）项目的分类 企业的各个管理项目具体可以分为两大类：显性管理项目和隐性管理项目。显性管理项目是指在企业中设置了专门的职能部门进行管理工作的项目。显性管理项目包括人力资源管理、营销管理、质量管理、财务管理、研发管理、生产管理、采购管理、其他管理等。隐性管理项目则指的是在企业中没有设置相应职能部门的项目。隐性管理项目包括：企业文化、学习型组织管理、流程管理、职业素质、管理技能、战略管理等。虽然隐性管理项目在企业中没有设置专门的职能部门，但它对提高企业整体运营绩效和管理水平起到了决定性的作用。 （3）隐性管理项目 企业中的隐性管理项目具有两个特点：第一，跨部门。隐性管理工作涉及企业每一个部门，并且处理的都是重要事务。隐性管理项目一般不设置专门的职能部门开展、落实管理工作。如果设置专门的职能部门，由于工作涉及其他部门，而专职部门的人员对其他部门的工作不够了解，就不能提出有说服力的建议，并且专职部门没有足够的权威落实工作。第二个特点：除了开始阶段工作量大一些外，日常工作量不大，没必要设置专门职能部门。 在企业中，隐性管理项目可以运用新一代学习型组织的技术设置专门的学习小组来进行管理。设置学习环小组，不会改变原有的组织架构。小组成员是由企业领导、跨部门管理人员和专业技术人员组成，保证了学习环的权威性和专业性。小组成员通过定期的工作交流、总结的方式，提出解决问题的管理意见。小组成员可以兼职，在学习环小组下可以设置全职的机构负责执行落实。 2、管理项目的基本规律和作用 （1）基本规律 4L模型中，管理项目具有以下基本规律：内层（指第一、二、三层）的任意一个管理项目有以下作用：可以对该项目的所有外层管理项目都产生强作用；可以与同层管理项目产生作用；也可以对更里层管理项目产生作用。最外层（第四层）管理项目不仅对其他管理项目的作用力小，相互间的作用力也小。 （2）作用 4L模型中的每个项目都对其他管理项目有着重要影响，下面以几个主要的管理项目为例来进行说明： Ⅰ、企业文化 企业文化处于4L模型的最里层（核心层），可以看出它在企业管理中的重要性。企业文化属于意识的范畴，通过改变员工的思想和行为方式来改变其他管理项目。它包括有愿景、使命、宗旨、理念、重要的方法和原则、行为规范等丰富的内容。企业文化有好坏之分，好的企业文化能带动企业员工更积极、更有效率地工作，促进企业发展。反之，则不利于企业的发展。 Ⅱ、学习型组织管理 学习型组织管理通过持续的改良和创新来提升其他管理项目，它和企业文化一样都是改善企业经营管理的利器。学习型组织管理可以用来优化企业文化，使企业文化向好的方面发展；不良的企业文化却无法用来提升学习型组织管理。

系统建模方法1何谓系统模型系统模型有哪些主要特征2.doc

第四章系统建模方法 1、何谓系统模型？系统模型有哪些主要特征？ 2、何谓系统分析？系统分析包括有哪些要素？画简图说明这些要素间的关系。 3、为什么在系统分析中，广泛使用系统模型而不是真实系统进行分析？ 4、对系统模型有哪些基本要求？系统建模主要有哪些方法，请分别说明这些建模方法的适用对象和建模思路。 5、什么是投入产出分析？它在经济管理中有什么用处？ 6、试举例说明某种产品对另一种产品的直接消耗和间接消耗关系。 7、在编制投入产出表时，如何确定部门的划分？ 8、设某地区的经济分为工业、农业和其他生产部门，其投入产出表如下表1所示。（1）试求直接消耗系数表； （2）试求完全消耗系数表； （3）如果计划期农业的最终产品为350亿元，工业为2300亿元，其他部门为450 亿元，请计算出各部门在计划期的总产品分别为多少亿元？ 表1 某地区的投入产出表（亿元） 9、设某地区的投入产出表如下表2所示。 （1）试求直接消耗系数表； （2）试求完全消耗系数表； （3）如果计划期（翌年）各部门的最终产品量和构成如表3所示，请计算各部门计划期的总产品分别为多少亿元？各部门应提供多少中间产品？ （4）如果在计划期间，制造业产品出口量增加20亿元，问各部门的产量要相应增加多少？ （5）如果在计划期间，农业由于自然灾害减少4亿元的最终产品，问各部门的总

产品将如何调整？ 表2 某地区的投入产出表（亿元） 表3 计划期各部门的最终产品量和构成（亿元） 10、某钢筋车间制作一批直径相同的钢筋，需要长度为3米的90根，长度为4米的60根。已知所用的下料钢筋长度为10米，问怎样下料最省？请建立解决此问题的数学模型。 11、某卫星测控站每天至少需要下列数量的干部值班： 每班值班的干部在班次开始时上班，连续工作8小时。测控站首长需要确定每个班次应派多少干部值班，才能既满足需要又使每天上班的干部人数最少，请帮助建立解决此问题的数学模型。 11、举例说明系统结构、系统单元以及单元之间的关系，试用集合A、A上关系R、关系矩阵M、关系图G以及系统结构或层次结构进行描述。 12、用数学归纳法证明，对任何正整数n下列恒等式成立

细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换

由传递函数转换成状态空间模型(1)

由传递函数转换成状态空间模型——方法多!!! SISO 线性定常系统 高阶微分方程化为状态空间表达式 SISO ()()()()()()m n u b u b u b y a y a y a y m m m n n n n ≥+++=++++--- 1102211 )(2 211110n n n n m m m a s a s a s b s b s b s G +++++++=--- 假设1+=m n 外部描述 ←—实现问题：有了部结构—→模拟系统 部描述 SISO ? ??+=+=du cx y bu Ax x 实现问题解决有多种方法，方法不同时结果不同。 一、 直接分解法 因为 1 0111 11()()()()()()()() 1m m m m n n n n Y s Z s Z s Y s U s Z s U s Z s b s b s b s b s a s a s a ----?=? =?++++++++ ???++++=++++=----) ()()() ()()(11 11110s Z a s a s a s s U s Z b s b s b s b s Y n n n n m m m m 对上式取拉氏反变换，则 ? ??++++=++++=----z a z a z a z u z b z b z b z b y n n n n m m m m 1) 1(1)(1)1(1)(0 按下列规律选择状态变量，即设)1(21,,,-===n n z x z x z x ，于是有

?????? ?+----===-u x a x a x a x x x x x n n n n 12113 221 写成矩阵形式 式中，1-n I 为1-n 阶单位矩阵，把这种标准型中的A 系数阵称之为友阵。只要系统状态方程的系数阵A 和输入阵b 具有上式的形式，c 阵的形式可以任意，则称之为能控标准型。 则输出方程 121110x b x b x b x b y m m n n ++++=-- 写成矩阵形式 ??????? ? ????????=--n n m m x x x x b b b b y 12101 1][ 分析c b A ,,阵的构成与传递函数系数的关系。 在需要对实际系统进行数学模型转换时，不必进行计算就可以方便地写出状态空间模型的A 、b 、c 矩阵的所有元素。 例：已知SISO 系统的传递函数如下，试求系统的能控标准型状态空间模型。 4 2383)()(2 3++++=s s s s s U s Y 解：直接得到系统进行能控标准型的转换，即

主题模型的分析法

?文史研究中主题模型的分析法 王涛南京?大学历史学院 @TSINGHUA，2017年年5?月20?日

2017年年“数字?人?文：数字时代?人?文研究前沿与?方法 ” ?时间：7?月1?日-2?日 ?地点：南京?大学 ?欢迎观摩 ?数字?人?文“暑期学校”：时间7?月10-15?日

提纲 ?何为主题模型?实现的?工具?如何分析?案例例

如何分析 ?MALLET算法导出的?文件doc-topics topic-keys word-topic-counts

主题与?文档之间的关系

?6 recht herr gott hand lass gleich sagen kind geh leben freilich freund gut komm oh wort genug glueck vergessen sache（法律先?上帝朋友遗忘事物）?7 nichts weiss allein ganz liebe koemmt gut lassen lieber immer wahr wissen wenig einmal kommen gesagt welt erst besser glauben（知道爱永远世界信仰） ?17 gemacht weit einmal augen gleich keinen zeit leben ganzen finden macht wuerden muesste zweifel gluecklich gedanken waeren natur glaube hoeren（眼睛时间?活荣誉运?思考） ?27 lassen sehen vielleicht ehre halten wissen wenigstens sagen bitte wider reden kommen moechte himmel nehmen haetten wollten ende verlassen unglueck（看 知道请求读天空离开结束）

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度

模型转换的途径

PIM->PSM 模型转换的途径 mdaSky UML软件工程组织 由MDA 的PIM（平台独立模型）向PSM（平台特定模型）转换的方法目前尚未实现标准化。因此目前市售的工具不得不利用自主方法进行这部分的处理。由PIM 向PSM 的转换方法由于将在2004 年实现标准化，只有这个重要的步骤标准化了，才更加有利于MDA 这项技术的推广。 2004 年将是MDA 大发展的一年，为什么这样说，我们来看看业界一些重要的公司是如何应对MDA 这项技术的。最近，美国Compuware 的OptimalJ 等基于对象技术标准化团体美国OMG （Object Management Group ）倡导的模型驱动架构（MDA）的Java 开发工具业已亮相。那么Java 工具阵营的老大哥Borland 公司的JBuilder 是否会支持MDA 那？看看他们是怎么说：“我们也在关注MDA， 但是目前仍在观察其动向。比如说第一点，OptimalJ 等产品与JBuilder，包括价格在内，不属于同一类产品。要是支持MDA 的话，Together 更好一些。JBuilder X 在能够轻松构筑Web 应用的角度上，以比这些工具更低的成本实现了相同的功能。同样，即便1 行代码都不写，也能够自动生成可访问数据库的Web 应用架构，在开发过程中及开发完成后均可轻松变更Web 应用服务器等平台。由PIM 向PSM 的转换方法由于将在2004 年实现标准化，因此到时准备在Together 中配备基于MDA 的模型自动生成功能。”看来Borland 公司也不会轻视MDA 这项技术，准备在Together 产品中支持MDA。 MDA 技术是否会取得较大的成功，让我们拭目以待。 下面简单讲述一下从PIM 到PSM 转化的5 种途径： 1. Marking

H9c2细胞培养方法

大鼠心肌细胞H9C2 细胞描述： 大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。 大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 货号规格培养基运输保存 C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存 质量控制： 本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。 用途： 本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。 细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作） 收到复苏好的贴壁细胞的处理方法： 1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜； 2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉； 3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时； 4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基； 5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜； 6. 第二天传代。 收到冻存细胞的处理方法： 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；

由传递函数转换成状态空间模型(1)

X^^n X I a n ^x 2 -a 1 x n U 由传递函数转换成状态空间模型一一方法多！!! SISo 线性定常系统 高阶微分方程化为状态空间表达式 SISO y(n )+a 1y (2)+a2y (2)+…+a n y =b 0u(m )+b 1u (m ^1)+…+b m u (n ^m ) b °s m b,s m b m S n yS2 a 2 s n ^ ■ a n 外部描述 W 实现问题：有了内部结构一-模拟系统 内部描述 X = Ax +bu y =cx + du 实现冋题解决有多种方法，方法不同时结果不同 直接分解法 因为 Y(S) Z(S) _ Z(S) Y(S) U(S) Z(S) U(S) Z(S) n ~~1 ds m b 1s m ' ?… bmQ S S a I S 亠 亠 a n 」s a n :Y(s) =(b °s m +b 1s m '+…+b m^s + b m )Z(s) IU(S) = (s n +a 1 s n ' *八 +a n jS + a n )Z(s) 对上式取拉氏反变换，则 jy = b 0Z (m )+b 1 z (m4 ?) +…+b m'Z + b m Z < (n ) 丄 (n 4) IB ?■I U=Z +a 1 z + +a n 4z+a n z X 2 = X 3 G(S) = SlSo 按下列规律选择状态变量, 即设X 1 二乙X 2 =乙 ,X n Z) ,于是有

X i X； 式中，|心为n -1阶单位矩阵，把这种标准型中的A 系数阵称之为友阵。只 要系统状态方程的系数阵A和输入阵b具有上式的形式，C阵的形式可以任意, 则称之为能控标准型。 则输出方程 y =b°X n b i X n」b mi X2 b m X i 写成矩阵形式 S I X2 y = [ b m b m」b i b0 ]' X n」 -X n 一分析A,b,c阵的构成与传递函数系数的关系。 在需要对实际系统进行数学模型转换时，不必进行计算就可以方便地写出状态空间模型的A、b、C矩阵的所有元素。 例：已知SISo系统的传递函数如下，试求系统的能控标准型状态空间模型 Y(S) _ 3 8s 3 2 U (S) S 3s 2s 4 解：直接得到系统进行能控标准型的转换，即 写成矩阵形式 XnA .Xn J J- a n "x；l - 0 Ir X J「0] X2 —a1 一x3 一r」 "0 1— 4 Ir x J JJ ■xj-x j b0] X2 =[3 0] | n Λ |__a3 X2 X2

企业分析常用的几个模型和方法

企业分析常用的几个模型和方法 1.P EST模型 P EST分析法是一个常用的分析工具，它通过四个方面的因素分析从总体上把握宏观环境，并评价这些因素对企业营销策略目标和策略制定的影响。 P 即 Politics ，政治要素，是指对组织经营活动具有实际与潜在影响的政治力量和有关的法律、法规等因素。当政治制度与体制、政府对组织所经营业务的态度发生变化时，当政府发布了对企业经营具有约束力的法律、法规时，企业的营销策略必须随之做出调整。 E即Economic,经济要素，是指一个国家的经济制度、经济结构、产业布局、资 源状况、经济发展水平以及未来的经济走势等。构成经济环境的关键要素包括GDP的变化发展趋势、利率水平、通货膨胀程度及趋势、失业率、居民可支配收入水平、汇率水平等等 S即Society，社会要素，是指组织所在社会中成员的民族特征、文化传统、价值 观念、宗教信仰、教育水平以及风俗习惯等因素。构成社会环境的要素包括人口规模、年龄结构、种族结构、收入分布、消费结构和水平、人口流动性等。其中人口规模直接影响着一个国家或地区市场的容量,年龄结构则决定消费品的种类及推广方式。 T 即 Technology ,技术要素。技术要素不仅仅包括那些引起革命性变化的发明, 还包括与企业生产有关的新技术、新工艺、新材料的出现和发展趋势以及应用前景。 在过去的半个世纪里,最迅速的变化就发生在技术领域,像微软、惠普、通用电气等高技术公司的崛起改变着世界和人类的生活方式。同样,技术领先的医院、大学等非 盈利性组织,也比没有采用先进技术的同类组织具有更强的竞争力。 2. 波特五力模型 五力模型是由波特（ Porter ）提出的,它认为行业中存在着决定竞争规模和程度的五种力量,这五种力量综合起来影响着产业的吸引力。它是用来分析企业所在行业 竞争特征的一种有效的工具。在该模型中涉及的五种力量包括：新的竞争对手入侵, 替代品的威胁，买方议价能力，卖方议价能力以及现存竞争者之间的竞争。决定企业盈利能力首要的和根本的因素是产业的吸引力。 竞争战略从一定意义上讲是源于企业对决定产业吸引力的竞争规律的深刻理解。 任何产业，无论是国内的或国际的，无论生产产品的或提供服务的，竞争规律都将体现在这五种竞争的任用力上。因此，波特五力模型是企业制定竞争战略时经常利用的战略分析工具。 这五种竞争作用力综合起来，决定了某产业中的企业获取超出资本成本的平均投资收益率的能力。这五种作用力的综合作用力随产业的不同而不同。随产业的发展而变化。结果表现为

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

细胞培养方法

2007-10-03 | 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备 0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。 2007-10-03 | MTT检测细胞增殖及见解 细胞以每孔3000个接种至96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含有10％胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中加入一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24 h或48h。培养结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小时（应常在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入DMSO 100μl，充分振荡3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。 由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则不可以使用此种方法。

另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对细 胞ATP是否有影响。 所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数我 们感觉还是最好的方法。 细胞培养方法 哺乳动物细胞培养规则： 1，严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张，在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。 2，使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。 3，在自己培养细胞出现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。 4，实验所用细胞培养原则要求：A，细胞复苏之后两代开始使用；B，保证细胞每次传代前密度不超过90%；C，细胞使用最多12代（约2个月）。 5，最好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。 6，具体参照https://www.wendangku.net/doc/b59244237.html,中细胞培养要求。 细胞传代方法 1，将长至80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2，加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3，瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。根据不同细胞而异。 4，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 5，细胞培养液参照https://www.wendangku.net/doc/b59244237.html,，一般含有10%胎牛或小牛血清。