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荧光探针

荧光探针的种类、研究热点与研究进展

19920102203495 宋菊平

【摘要】：荧光探针在化学传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用，并成为实现上述功能的一种主要的技术手段。最近，无机发光量子点、荧光聚合物纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子等荧光纳米探针的相继出现，为生物分析提供了新的发展领域，成为了近年来研究的热点。而一些传统的探针，也得到了一下新的改进与发展。荧光探针在生物医学光子学领域正呈现一片欣欣向荣的场面。

【关键词】：荧光探针；量子点荧光探针；纳米荧光探针；小分子荧光探针；双光子金属离子荧光探针；硫醇类探针；

（一）荧光探针的种类

按照荧光探针制作方式，可分为化学荧光探针和基因荧光探针。其中化学荧光探针是由化学方法合成的，而基因荧光探针是由可遗传、由DNA编码、蛋白质组成的。按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等按照荧光探针功能来分，可分为细胞活性探针；细胞器探针；膜荧光探针；核酸探针；Ph值探针；免疫荧光探针；钙离子探针；活性氧探针。细胞活性探针是标记活细胞；酯酶底物探针、过氧化物酶底物探针和离子泵活性指示探针识别死细胞，死细胞探针有膜不透性DNA探针和丹磺酰赖氨酸。而其优点是灵敏，安全。细胞器探针是与细胞器选择性结合的荧光染料。主要用途：研究胞内的氧化作用、有丝分裂、底物降解作用、解毒反应、细胞间的转运和细胞分拣等。膜探针是非极性探针、两性探针、膜流动性探针、荧光标记的磷脂、脂肪酸和固醇探针。用途：测量膜的扩散、监测病毒－细胞的融合、观察膜流动性和研究膜表面的分子组成。核酸是细胞生长、分化、遗传的重要物质。用途：测定DNA和RNA的形态和含量；研究细胞周期和肿瘤的诊断、治疗和预防。

（二）一些荧光探针热点的实例

1：小分子荧光探针

小分子荧光探针一般由两部分组成：荧光团以及与受体专一性高亲和力结合的配体。受体与目标蛋白质融合，通过受体与配体的相互作用来标记蛋白质。总体说来，小分子荧光探针应该可以穿过细胞膜并且无毒；能够与受体专一性稳定结合，使得其在进行监测的较长时间（几个小时）内保持稳定性；背景噪音水平尽可能的低；探针尽可能地设计成一定的模式，使得多种荧光团能够方便地结合。选择合适的受体可以实现对蛋白质位点专一性结合。对于受体的选择有以下两个要求：（1）受体与目标蛋白质融合后必须能够被基因表达；（2）受体应该尽可能小，以致不干扰目标蛋白质的正常生理功能，因此较理想的受体是一段短序列的肽链并且能够插入目标蛋白质的许多位点。而选择适合的受体-配体对可以实现对蛋白质高灵敏度高亲和力结合。一般说来，受体与配体的结合应当尽可能地快，有利于监测时间敏感

性的生理过程。受体-配体的作用一般包括半抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、酶-底物、联砷荧光物质与富含半胱氨酸的肽链之间的作用等。

小分子荧光探针又有一下几种。

1.1 FLAsH型探针。

Tsien 等提出了一种将荧光素的衍生物在活体细胞内与蛋白质位点专一性共价结合的新方法。Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys 序列（Xaa 是非 Cys 的任意氨基酸）融合或插入到目标蛋白质中，具有细胞膜通透性的联砷-荧光素衍生物与序列专一性地识别，在每个砷原子与两个半胱氨酸的巯基共价结合后发出荧光。FLAsH 能够很方便地在钯催化的条件下，通过三氯化砷与荧光素的醋酸汞盐的转金属化作用一步得到，而且通过加入 1,2-乙二硫醇（EDT）很好地加以分离，得到没有荧光的产物FLAsH-EDT2。但是当与砷原子共价结合的 EDT 被Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys 序列中的巯基替代后，荧光强度增强约 50000 倍。FLAsH-EDT2的荧光淬灭可以用震动失活或光诱导的电子转移机理来解释，而结构较为固定且刚性较大的多肽链能阻止荧光的淬灭。此外，除了绿色的 FLAsH，红色的 ReAsH 和蓝色的 HoXAsH、CHoAsH 等多种衍生物已被成功合成。Vogel 等提出了一种新型的小分子探针，由两部分组成，一部分为荧光基团，另一部分为螯合物，由金属离子与含有三醋酸根的叔胺类化合物组成（NTA）(图式 2)。这种探针能够可逆、专一性地与目标蛋白质的寡聚组氨酸序列结合。Vogel 等用 Ni-NTA 标记在 N 端含有六聚组氨酸序列的 GFP（GFP-His6）。两者的结合在几秒钟之内即完成。Ni-NTA 作为理想的 FRET 受体几乎完全淬灭了 GFP的荧光。而且此反应的速度与 Ni-NTA 探针的浓度成正比关系，表明 Ni-NTA 与 GFP-His6结合的比例系数为 1：1。特别要指出的是，Ni-NTA 探针都是通过淬灭与目标蛋白质连接的受体的荧光间接使用的。这是由于对与 Ni-NTA 直接相连的荧光基团的荧光成像相当困难，因为 Ni2+会淬灭荧光并且 Ni-NTA 与寡聚组氨酸序列之间的亲和力并不是特别高。同样是以氨基酸序列作为受体，这种探针优于 FlAsH 的地方是它可以用于氧化环境中。

1.2 AGT型探针

Johnsson 等利用人类 DNA 修复蛋白的 6-О-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（hAGT）的特性，提出了一种新的蛋白质荧光标记方法。AGT 的氨基酸残基能识别 6-О-烷基鸟嘌呤，并且将烷基转移连接到自身的一个半胱氨酸的巯基上。AGT 的底物识别性很广，能够识别很多种类的烷基，包括苯甲基。Johnsson 等先将目标蛋白质与 hAGT 融合，鸟嘌呤衍生物与作为标签的荧光团结合作为探针，hAGT 半胱氨酸上的活性硫原子亲核进攻以苯甲基修饰的鸟嘌呤衍生物来完成两者间的结合（图式 3）。由于苯甲基鸟嘌呤与 hAGT 之间存在共价作用，结合比较稳定，可以在数小时内对 hAGT 融合蛋白进行观察。只有探针诱导的细胞内融合蛋白质降解对此过程有影响。由于 hAGT 与 GFP 相比，体积小 31 个氨基酸，因此对目标蛋白质的影响也大大减少。苯甲基鸟嘌呤的衍生物较多，到现在为止，已有 20 多种能够与AGT 进行专一性标记，这是使用 AGT 标记方法的一个优势。然而值得注意的是，在哺乳动物的细胞中，内源的野生型 AGT(wtAGT)也会被苯甲基鸟嘌呤的衍生物识别，从而出现较高的背景标记。为了解决这一缺陷，Johnsson 合成了一种 wtAGT 的抑制剂和一系列能抵抗此抑制剂的 AGT 变体。这样就能使得在这种抑制剂的存在下，wtAGT 失活，而 AGT 变体能够对目标蛋白质进行专一性标记。这种利用 AGT 变体和 wtAGT 抑制剂的方法有许多优势，例如组成 AGT 变体的氨基酸数为 182，与 hAGT（207）相比有所减少；另外 AGT 变体对于

烷基化的 DNA 的亲和力低于 hAGT, 从而专一性得到提高，背景值得到降低。总的说来，AGT 及其变体对蛋白质进行标记具有专一性和很广的底物识别性，但是它的体积仍然较大，这是这种方法的一种内在缺陷。

1.3 Halo Tag型探针

普洛麦格公司(Promega)的研究者利用脱卤素酶(Halo Tag)的特性提出了一种在思想上与AGT融合蛋白质相似的新的蛋白质标记方法。野生型Halo Tag能够与卤代的脂肪族化合物发生两步反应：Halo Tag先发生亲核取代反应，脂肪族底物与天门氨酸盐形成酯（图式4），接着酯水解生成醇作为最终产物。这种方法专一性较好，然而Halo Tag由293个氨基酸组成，体积比GFP大。根据类似的思想，利用一段短的肽链作为受体，可以设计出一些新型的小分子荧光探针。

1.4 PCP、ACP型探针

Yin和George提出了一种新的方法，这种方法是基于含有多肽链的蛋白质（PCP）或是含有酰基的蛋白质（ACP）在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPtase）的催化作用下对蛋白质进行专一性标记。PPtase将磷酸泛酰巯基乙胺基团从辅酶A（CoA）上转移至ACP或PCP的一个精氨酸侧链上，形成专一性的共价结合。这种方法已经被应用于在酵母菌和哺乳动物细胞中荧光标记α-凝集素受体（Aga2p）和人类Ｇ-蛋白结合的受体(NK1)。这种探针具有较多的优点：标记速度较快；体积小，约由80个左右的氨基酸组成；对于不同种类的CoA衍生物，PPtase缺乏分辨力，因此可以应用多种标记方式。

2：双光子金属离子荧光探针

在各种生物学过程中,少量的金属离子如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Pb2+等对于许多重要细胞的生长生存、功能调节及体内生物活性酶的催化等都起着非常重要的作用[1-5],因此对其识别和检测具有重要的意义。荧光探针法用于检测金属离子具有方便、快捷和灵敏度高的特点。

双光子金属离子荧光探针常用的有一下几种。

2. 1 钙离子双光子荧光探针

Kim等人[15]合成了荧光团是1-氰基-2, 5-双苯乙烯基苯的衍生物,受体是单氮杂15-冠醚-5的钙离子荧光探针1。该探针荧光量子产率为0. 47,激发波长740 nm下甲苯中双光子吸收截面和络合常数分别为320 GM和p K = 4. 26±0. 06,乙腈中要小得多。其作用机理是当氮杂15-冠醚-5螯合Ca2+时,氮杂氮原子上的孤对电子与Ca2+配位成键,使荧光团上的分子内电荷迁移减弱,导致单光子与双光子吸收及荧光特性上发生变化,吸收和发射强度均减弱,且发生相应的蓝移。然而,该探针对钙离子没有专属性,对Ba2+、Mg2+、Na+和K+也有不同程度的络合。到目前为止,以冠醚为受体的双光子荧光探针被大量报道,虽然其对碱金属离子和碱土金属离子敏感性很强,但其对金属离子的专属选择性不好,总是受其它离子的干扰。2002年,Marcotte等人[16]合成了D-A-D型的钙离子探针2,其非线性光学性质在光电子方面具有广泛的应用。激发波长为708 nm时,探针2在464 nm具有最大吸收,在562 nm 有最大发射,荧光量子产率为0. 14,与钙离子络合后,吸收峰蓝移至375 nm,最大发射峰红移至583 nm,荧光量子产率降低至0. 057。Kim等人[17]以萘的衍生物为荧光团合成了探针3~探针5。它们对钙离子具有高度的敏感性,激发波长为780 nm时,与钙离子络合后荧光强度增加23~50倍,络合常数在(0. 14±0. 02) ~(0. 25±0. 03)μM范围内,在大于100μm深度的血管中能检测到钙离子的信号,并且没有光漂白问题。

2. 2 锌离子双光子荧光探针

Ahn等人[18]以均二苯乙烯为荧光团,二-(2-吡啶)胺为受体合成了探针6,激发波长为780 nm时,探针6拥有很强的双光子荧光。与锌离子络合后,由于分子内电荷转移的影响使荧光强度降低。但是Pb2+,Co2+,Ba2+对探针6都有一定的络合性,尤其是铅离子,对锌离子的检测干扰更大。Bozio等人合成了探针7[19],此探针受体对过渡金属离子具有很强的选择性,尤其是对锌离子。在519 nm处有最大吸收,当探针和Zn2+络合后,吸收光谱发生红移,光谱峰变宽。当过量的Zn2+加入以后,在548 nm处荧光有最大发射, Zn2+加入前后荧光量子产率分别为0. 31和0. 35。虽然探针7对Zn2+络合能力不是很强,但是实验处理比较容易,因此也为锌离子探针的合成奠定了一定的基础。黄飞等人[20]合成了探针8,探针8是一个新型的交替共轭聚合物分子,由于其结构的特殊性,当与锌离子络合后,荧光强度及荧光发射峰表现出明显的变化,因此可以应用在双光子荧光显微镜中。探针8具有D-π-D结构,在四氢呋喃溶剂中双光子吸收截面高达1440 GM。在激发波长800 nm下,随着锌离子的加入,发射光谱发生红移,当锌离子浓度大于5. 1×10-6mol/L,物质与锌离子作用已经达到饱和,荧光光谱淬灭。但是此探针的专属性并不好,受到Mg2+和Ca2+的干扰。Chang等人[21]合成了探针9,激发波长为760 nm时,与锌离子络合前,在500 nm有最大吸收,摩尔消光系数为8. 1×104M-1cm-1,516 nm有最大发射,荧光量子产率为0. 03。与锌离子络合后,吸收和发射光谱都发生蓝移,荧光量子产率增加了11倍,为0. 35。此探针对锌离子的选择性优于对钙离子和镁离子的选择性,分离常数小于1 nM。2009年,陈晓云[22]等人合成了探针10,激发波长为800 nm时,在中性缓冲水溶液中,其对锌离子有高的敏感性和选择性,与锌离子络合后,荧光强度增加了14倍,当pH大于5时,探针10与饱和的锌离子络合后,荧光强度不再发生变化,因此在生理pH变化范围内可以检测细胞内锌离子浓度,生理系统中含有丰富的Ca2+,Mg2+和K+,然而在荧光发射中观察不到这些阳离子的影响,所以在生物细胞双光子成像中探针10具有广泛的发展前景。

2. 3 镁离子双光子荧光探针

由于D-A-D结构的荧光团拥有大的双光子吸收截面,而冠醚类受体对碱金属和碱土金属离子具有很强的敏感性和络合性,基于上述优点, Pond等人合成了探针11和探针12。双光子激发波长均为810 nm。冠醚中的氮原子与镁离子络合后,氮原子给电子的能力降低,由于分子内电荷转移,双光子吸收峰的位置和强度受到很大的影响。探针11和探针12的双光子吸收截面分别为1800 GM、2150GM,当与镁离子络合后,双光子吸收截面变小。探针11与镁离子络合常数为3500 M-1,比以往报道的以氮杂-15-冠醚-5为受体,其它化合物为荧光团的络合常数都大。由于探针12连接着两个冠醚受体,因此和镁离子结合有两种情况:探针12:Mg2+,探针12: 2Mg2+,由于第一个镁离子与受体氮原子络合后,分子另一端氮原子的电子云密度降低,与第二个镁离子作用就会减弱,所以络合常数k12比K11要小。但是此探针的水溶性很差,在水中不能络合镁离子,在选择性性上也有缺陷。2006年, Kim等人[24]合成了探针13。此探针具有很好的水溶性,在水中的溶解度为3. 0×10-6M。在880 nm波长激发下,与镁离子络合后,与fura-2与镁离子络合相比[24],荧光强度增加了20倍,吸收光谱和发射光谱均发生红移。探针13的荧光强度不受碱金属离子,过渡金属离子的影响。但此探针对pH比较敏感,只有在pH大于6. 5,荧光强度才不发生变化。钙离子和该探针也有结合作用,但镁离子结合后荧光强度比与钙离子结合后荧光强度增加了6. 5倍,因此,此探针可以在细

胞中检测镁离子而不受钙离子的干扰。

3：量子点荧光探针

量子点是由半导体材料(通常由元素周期表的II~VI, III~V或IV~VI族原子)制成的尺寸在1~12 nm的微粒·由于量子点的特殊结构导致了它具有表面效应、量子尺寸效应、介电限域效应和量子隧道效应,从而派生出许多不同于宏观块体材料的物理化学性质和独特的发光特性[9]。作为新型荧光探针的量子点具有发射量子产率高、光漂白性能不明显、荧光强度高及稳定性好等的荧光性质。同时量子点(图1)相比传统荧光染料分子激发光谱宽且连续;发射荧光光谱峰狭窄而对称。更有趣的是,量子点的发射谱线具有“调频”能力。其发射峰波长不但会随着量子点的核心材料变化而变化,还会随着量子点的尺寸大小而改变。以CdSe 量子点为例:当CdSe量子点的直径为2 nm时,能发射出550 nm的绿色光,当直径增大到4 nm 时,则变成了630 nm的红色光。这样就给荧光标记法带来了很大的便利:我们可以用多种不同量子点同时进行标记,而且以同一种光源进行激发,其发射的谱线不容易重叠,有利于我们进行多组分同时测定。但量子点的这种“调频”能力,也要求作为标记物的量子点必须有分布均一的粒径,这给我们制备量子点探针时带来很大的困难。

类似于传统荧光探针分析法,将小分子或离子被测物引入量子点表面,会增大量子点荧光强度或猝灭荧光。这是因为:量子点荧光受其表面结构影响巨大。由于引入的分析对象会与量子点发生物理、化学作用,从而改变量子点表面的电荷和组成,甚至会引起核心电子空穴的重组,影响荧光强度。其强度的改变量会随着被测物浓度变化,它们的关系可用荧光猝灭方程或荧光加强效应方程来描述。鉴于以上原理,可以将量子点用于分析当中·不同于传统的荧光探针分析法,量子点荧光探针分析的选择性与探针本身的关系不大,而与对量子点改性的表面物质有关。种镉基量子点经过不同的表面改性后可对不同的物质选择性的进行分析。

Rosenzweig]等发现:以1-巯基甘油为稳定剂的CdS量子点与Cu2+离子作用后会发生荧光猝灭；以L-半胱氨酸为稳定剂的量子点与Zn2+离子作用后会产生荧光增强。并且首次将量子点成功地应用于这两种金属离子的分析当中。Kerim[ 31]等则设计了一段5个氨基酸序列的五肽,并以此五肽为稳定剂合成了CdS量子点,根据荧光猝灭或荧光增强可分别用于Cu2+和Ag+离子的检测。Isa-rox[32]等以CdS量子点测定Cu2+离子。他认为:Cu2+离子处于CdS量子点表面时会被迅速地还原为一价Cu+离子。而一价Cu+离子会引起量子点内核导带中激发态电子与价带中空穴产生重组,导致量子点的荧光猝灭,同时还会使得量子点发射峰红移。Costa-Fernández等采用以2-巯基乙酸进行表面处理过的CdSe量子点测定Cu2+·结果显示共存离子Na+, K+, Ca2+,Mg2+, Zn2+, Mn2+和Co2+对测定不会产生干扰;Fe3+离子的干扰可加入NaF使其形成FeF3-6去除;而Ag+和Hg2+离子将会影响测定结果。但是由于Ag+和Hg2+离子产生的荧光猝灭信号远远小于Cu2+离子,只要它们的浓度不高于1 g/L,干扰可以忽略。就能实现高灵敏度、高选择性测量溶液中的Cu2+。Li等采用半胱胺酸包裹的CdTe 量子点分别与不同的金属离子作用·发现200μmol/L的Zn2+使荧光有4%的增强,而同样浓度的Mg2+、Mn2+、Ni2+、Co2+等离子分别有4%, 12%, 54%, 84%荧光减弱。Zn2+离子与CdTe 量子点之间的荧光增强作用附合Lang-muir吸附模式,Co2+离子对CdTe量子点荧光的猝灭作用附合Stern-Volmer方程模式。LiHaibin等发现以硫化杯芳烃包裹的CdSe/ZnS量子点荧光可以不受Mg2+, Ca2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+，Co2+, Ni2+等离子的干扰选择性的测量Hg2+·首次从方法上根本的消除了Cu2+对Hg2+测定的干扰。

4:硫醇类荧光探针

硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。小分子硫醇包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、硫辛酸和辅酶A；大分子硫醇包括含巯基的多肽、酶和生物膜。大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶A参与的反应等。谷胱甘肽(GSH)是细胞内含量最高的小分子硫醇(1—10 mmol／L)，它存在氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型GSH的氧化还原动态平衡。大量资料显示，谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原动态平衡、氧化应激和在细胞的生长、功能中起着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。目前已报道的用于检测硫醇的方法主要有：高效液相色谱法、电化学法、荧光法等。荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。

利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇的探针主要为氮取代的马来酰亚胺类衍生物。马来酰亚胺通常易与硫醇类化合物发生亲核加成反应，在室温下pH 5～8时几分钟即可完成。Kanaoka等发现氮取代的马来酰亚胺类的大多数化合物自身没有荧光或荧光很弱，当它与包含巯基的化合物反应后形成具有强荧光的加成产物，并于1970年开发了第一个比较实用的马来酰亚胺类荧光试剂1。试剂1是一个非常灵敏的检测巯基类化合物的荧光试剂，缺点是激发和发射均处于紫外区，且水溶性差。经过对荧光发射团系统的研究后，Machida等又进一步开发了波长较长水溶性较好的试剂2。试剂2的激发和发射波长分别为400和480 nm，该探针在设计时为了增加水溶性引入了极性的香豆素荧光团和二甲氨基基团。试剂1和2被称为Kanaoka试剂，通常被用作荧光探针来共价标记蛋白质中的巯基活性点。近年来，许多氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针被开发，用来检测动物血清、肝脏、尿液等生物样品中的GSH、Cys等具有重要生物学意义的小分子硫醇。

1995年Langmuir等设计合成了5个以苯并香豆素(naphthopyranone)为母体荧光团的氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针4—8，这些探针与一些小分子硫醇如GSH、Cys等在生理pH 条件下立即反应，脂肪族胺、氨基酸和非硫醇蛋白不干扰测定。他们将这5个探针与广泛使用的硫醇类荧光探针3比较，研究了其与硫醇反应前后荧光量子产率的变化，结果显示其与硫醇反应后荧光量子产率显著增大(其中试剂8荧光量子产率变化最大，0．012～0．66)，是比试剂3(0．021—0．13)更为灵敏的探针。

Liang等组设计合成探针5-maleimidyl-2-(in．methylphenyl)benzoxazole(MMPB)，与其它马来酰亚胺类探针相比，由于MMPB—GSH和MMPB—Cys荧光性质的不同，该探针可以实现对GSH和Cys的选择性响应。在激发和发射波长分别为299．2和355．8 nnl时，MMPB可以选择陛的检测GSH，在含有0．4倍的Cys的情况下对GSH的检出限可达3．23×10-10mol／L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于人的血液、猪肝和猪心中GSH含量的测定；

在激发和发射波长分别为305．6和425．6 nln时，MMPB还可选择性的检测Cys。在同时存在0．15倍的GSH的条件下对Cys的检出限可达6．2×10-10mol／L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于蛋白质水解液、胱氨酸电解液和人尿液中Cys的测定，回收率高、重现性好。该探针虽然可以实现对GSH和Cys的选择性响应，但激发和发射波长短，生物样品中背景荧光干扰比较大。该课题组2005年又设计合成了一个新的波长较长的荧光探针9啪J，激发和发射波长分别为401和496 nm。试剂9用于检测Cys线性范围1．0×10-8～6．0×10-7moL ／L，检出限5．7×10-9moL／L；检测GSH线性范围6．0×10-9～4．0×10-7 mol／L，检出限5．64×10-9moL／L。试剂9被成功应用于检测人血清和血浆中的GSH，人尿液中的Cys，回收率96．2％一103．0％。试剂9用于检测巯基类物质简单快速、可行性强，35℃时15 min 即可反应完全，且与前一个探针MMPB相比波长较长，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰。

5:纳米荧光探针

21 世纪是高新技术的世纪，信息、生物和新材料代表了高新技术的发展方向。在信息产业如火如荼的今天，新材料领域有一项技术引起了世界各国政府和科技界的的高度关注，这就是——纳米科技。处于新材料科技前沿的纳米技术最近几十年取得了前所未有的发展，将会掀起新一轮的技术浪潮，领导下一场工业革命，人类也将进入纳米科技时代。而纳米材料的研究，是一个高度交叉的综合性学科，包括物理、化学、生物学、材料科学和电子学。它不仅包含以观测、分析和研究为主线的基础学科，同时还有以纳米工程与。纳米材料和技术是纳米科技最富活力、研究内涵最丰富的学科分支。

荧光纳米粒子作为一种荧光探针已被广泛应用在生物标记及医疗诊断领域。近年来国外已涌现出多家研制和开发荧光纳米粒子生物荧光标记的公司，如NanoTech-Ocean等，我国在这方面的研究正逐步展开，也出现开发纳米荧光探针相关产品的一些公司，如武汉的珈源公司就提供各种可用于生物的量子点探针。基于目前国内外的研究现状，要实现荧光半导体纳米粒子在生物检测中的应用关键在于对荧光纳米粒子的表面结构和功能的准确控制，而且纳米粒子表面必需具有亲水性官能团。为了使TOPO 法合成的油溶性量子点转移到水相，主要采用表面包覆和表面置换两种方法。例如，在量子点表面包覆SiO2 壳层，Alivisatos 等利用巯基硅氧烷(MPS) 置换量子点表面的TOPO 分子，然后进一步将硅氧烷水解缩聚使微粒表面形成一种稳定的SiO2 壳层。通过水解有机硅氧烷还可以形成具有胺基、脲丙基和羧基等活性官能团的SiO2 壳层。自1998 年Alivisatos 和Nie 等提出用半导体纳米粒子作生物荧光标记的最初构想以来，基于荧光量子点的生物偶联得到蓬勃发展。荧光量子点用于生物偶联主要依靠纳米粒子表面的活性基团如羧基、胺基、醇基和巯基等。主要是利用纳米粒子表面活性基团与生物分子之间形成共价偶联、静电吸附、疏水作用和硅烷偶联等。归纳起来，荧光纳米粒子与生物分子偶联主要有两种方法：一种是通过化学反应，即通过表面修饰有羧基或氨基的水溶性纳米晶与生物分子中的氨基或羧基形成酰氨键,实现偶联。该方法

通常用于较复杂的研究体系，如抗源-抗体之间的识别、活体标记及特异性标记等。另一种是静电吸附方法，带电荷的纳米粒子可以与带相反电荷的生物分子通过静电相互作用吸附偶联，该方法适用于简单体系。纳米粒子与抗体偶联后，利用抗源-抗体间的特异性识别，可以将不同荧光纳米粒子修饰在底物上，并对底物进行跟踪。迄今为止，纳米粒子和生物分子的偶联物已经在DNA 杂化、免疫检测、受体诱导的细胞内吞作用和生物组织成像等方面得到应用，而且纳米粒子作为新一类的荧光标记材料已经逐步发展到活体细胞成像。

将纳米粒子直接用于生物检测主要优势是利用纳米粒子的高荧光稳定性，可以在几十分钟到数小时研究细胞的过程中进行实时跟踪检测；可以用多种颜色的纳米粒子同时对细胞内或细胞表面进行多个靶向目标研究；将纳米粒子表面包覆有惰性物质壳层，使纳米粒子对细胞的毒性低于有机染料带来的毒性。另外，人们还合成了近红外发光的纳米粒子(NIR-QDs)，如HgTe 纳米粒子有较高的发光效率和近红外发射波长，为活体基因表达和酶活动研究提供了新的机遇。

（三）荧光探针的研究发展及前景展望

蛋白质领域的不断探索推进了小分子荧光探针的快速发展，随着越来越多性质良好的小分子荧光探针的出现，人类对蛋白质的研究也将达到一个新的高度。通过最近几年的研究, 国外相关的研究小组已经在该类探针的设计和合成上积累了大量的理论与实验基础,为以后进一步的改进和创新铺平了道路。

双光子荧光显微镜的广泛应用给生物学家与广大医学工作者提供了极大的便利，借助双光子显微成像可以直观便捷地对生物活性化合物或生物功能客体成分进行实时动态三维观测与监控，为化合物的生理作用机制的正确推断及生物客体生命历程轨迹的真实反映与绘制奠定了坚实的实验基础。双光子荧光探针的开发与应用，特别是在生物检测与成像方面的应用，不仅为生命奥秘的揭示提供了锐利工具，而且势必带来一场生物研究技术领域的深刻革命，加快生命研究的进程，大大促进生命科学与医学的发展。双光子荧光显微成像为我们打开了一扇观察生物微观世界的窗口，在不久的将来，必将有更多生物检测对象的双光子荧光探针问世，生物检测与成像的双光子荧光探针的性能也必将越来越优良。

同时，近年来，随着无机发光量子点、荧光聚合物纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子等荧光纳米探针的相继出现，为生物分析提供了新的发展领域，纳米荧光探针技术得到较快的发展，在很大范围内的被应用。并随着量子点用于化学分析的潜能开始被更多的学者所认识,量子点作为光学探针的分析方法将会得到更加广泛的应用。

（四）结论

总之，在生物医学光子方面，荧光探针有一个很光明的应用前景。随着各种技术的更加完善，以及各种仪器的更加的高级、精确，荧光探针技术将会有一个很大的提高、完善。将不仅仅只是在科学研究上有一定的应用，而且会更深入的应用到我们的生活中。特别是在医学方面，将会有很大的突破，对于医学的发展也有一定的推动作用。

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荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２共价连接型荧光探针结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ）受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

2017肿瘤检测相关公司汇总

厦门艾德 K-ras ；BRAF ；PIK3CA ；NPM1；突变检测或多态性检测；荧光定量/毛细管电泳 EGFR ；EML4-ALK 有无医疗器械证江苏为真 EGFR ;KRAS ;EML4-ALK ;KRAS ;BRAF ;PI3K ;C-kit ;P DGFRA Taqman-ARMS qPCR-HRM ERCC1; BRAC1; TUBB3; BRAC1; STMN1; RRM1; RRM1; EGFR 荧光定量PCR CYP19A1；UGT1A1；CYP2D6；MTHFR ；DPD ；ERCC1；GSTP1； XRCC1 荧光定量PCR+高分辨率熔点曲线分析（HRM ） EML4-ALK 融合基因检测试剂盒通过RT-PCR 方法检测EML4-ALK 的多种融合突变武汉友芝友人类EGFR 基因29种突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法）采用ARMS-PCR 荧光定量技术人类KRAS 基因7种突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法）采用ARMS-PCR 荧光定量技术人类BRAF V600E 突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法）采用ARMS-PCR 荧光定量技术北京雅康博人EGFR 基因突变检测试剂盒（荧光PCR 法）采用荧光PCR 技术人KRAS 基因突变检测试剂盒（荧光PCR 法）采用荧光PCR 技术人PIK3CA 基因突变检测试剂盒（荧光PCR 法）人EML4-ALK 融合基因检测试剂盒（荧光PCR 法）人VEGF 基因表达量检测试剂盒（荧光PCR 法）人RRM1基因表达量检测试剂盒（荧光PCR 法）人ERCC1基因表达量检测试剂盒（荧光PCR 法）

荧光探针汇总

1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针）原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长506nm 发射波长526nm （绿色）备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针）原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色）备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针）原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长494nm 发射波长516nm （绿色）备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针）原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度激发波长485nm 发射波长520nm （绿色）备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针）原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度激发波长507nm 发射波长529nm （绿色）备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针）原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。生理意义标记线粒体膜电位激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色）生理意义检测线粒体膜电位

荧光探针汇总

精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针）原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长506nm 发射波长526nm （绿色）备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针）原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度激发波长507nm 发射波长529nm （绿色）备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针）原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。生理意义标记线粒体膜电位激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色）生理意义检测线粒体膜电位

备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针）原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强烈的蓝色荧光。生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色）备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。生理意义检测细胞膜完整性激发波长494nm发射波长517nm（绿色）备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。生理意义检测细胞内pH

SNP检测方法汇总

现在SNP的常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。 SNP检测方法汇总分析SNP的方法有许多种，本文收集目前还在用的方法，按通量从高到低排列：全基因组测序这是最贵的方法，但也是看SNP最全的方法大概一个人样本，花2万元外显子组测序外显子组测序，也可以得到较全面的SNP信息大概一个人样本，花1.5万元随着人全基因组测序的价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场全基因组SNP芯片原理，核酸杂交，荧光扫描

Illumina和Affymetrix都有很著名的全基因组SNP芯片，例如： Affymetrix: CytoScan，SNP 6.0， Illumina: 660，中华，450K等 SNP芯片，在2000~5000元每样本，还是比全基因组测序的2万元一个样本的价格要低质谱法原理，精确测量PCR产物的分子量，就可以知道SNP位点上是A/C/G/T中的哪一个Sequenome MassArray法测中等通量的SNP位点是十分准确的单个位点、单个样本的费用约2元人民币无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规的PCR引物就可以做实验了如果测几十个点，到上百个点，是很方便的方法 SNPseq法此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点原理：用Goldgate法做出针对某些位点的多重PCR片段

荧光定量pcr法原理汇总

我们前面比较详细地介绍了荧光染料法做定量PCR的有关技术和产品，显然，作为定量PCR的初期阶段的荧光染料法还是有局限性的，比如，由于染料不能区分特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探针，所以检测的特异性始终不如后来出现的探针法；需要在PCR后进行熔链曲线分析；也不能做多重PCR检测（Multiplex）。上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间。Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不断改进和简化。如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。实时荧光PCR中另一个很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。一：水解探针法 TaqMan技术

分子荧光的机理和荧光探针原理

1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA

荧光探针在蛋白质研究中的应用

第13卷　第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用 Ξ王守业　余华明　张祖德　刘清亮 (中国科技大学化学系　合肥230026) 大学化学摘要　荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。利用它可以测定蛋白质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。一、　引言荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ )等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。二、　荧光探针的某些光物理和光化学特征 1.　有机荧光探针的某些特征最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3 N θH θθSO -3N H θ H 3C θθS O O Cl N H 3C CH 3 1,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl 图1　1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极 Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。

荧光探针的发展和应用

Supplementary materials for: Perylene diimide based “turn-on” fluorescence sensor for detection of Pd2+ in mixed aqueous media Hai-xia Wang a, b,*, Yue-he Lang a, Hui-xuan Wang a, Jing-jing Lou a, Hai-ming Guo a, b, Xi-you Li c,* a School of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Green Chemical Media and Reactions of Ministry of Education, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China b School of Environmental Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China email: hxwang5270@https://www.wendangku.net/doc/b84794991.html, (H. Wang) c School of Chemistry an d Chemical Engineering, Shandong University, Jinan 250100, China email: xiyouli@https://www.wendangku.net/doc/b84794991.html, (X. Li) Contents Page S1: Title of the paper, authors along with the contents. Page S2-S4: Copy of the 1H and 13C NMR spectra of PDI-1, PDI-2 and PDI-3. Page S5:Photophysical properties of PDI-1, PDI-2and PDI-3derivatives in different solvents at room temperature; Fluorescence spectra change of PDI-2and PDI-3 upon addition of different metal(8.0 equiv) ions; UV-vis spectra of PDI-1 (6.0 μM) in the presence of different metal ions (8.0 equiv). Page S6: Job’s plots in DMF/H2O (v/v, 7/1) and acetonitrile; Fluorescence spectra changes of PDI-1 (5.0 μM) in the presence of Pd2+in acetonitrile and chloroform;ESI mass spectra of PDI-1 in the presence of 1.0 equiv PdCl2 in CH3CN. Page S7: Job’s plots of PDI-1 (5.0 μM)in the presence of Pd2+in chloroform; Influence of pH on fluorescence intensity of PDI-1 (5.0 μM) in the absence and presence of 1.0 eq Pd2+; Benesi-Hildebrand analysis results.

半胱氨酸荧光分子探针的研究进展要点

半胱氨酸荧光分子探针的研究进展 The research progress of fluorescent molecular probes for cysteine 摘要：近些年来，分子探针因其响应速度快、灵敏度高、使用方便、检测限低等优点应用于对多种分析物的检测。半胱氨酸在很多生理过程中有着重要的作用，因此科研者们制备了多种荧光分子探针来检测半胱氨酸。这篇综述分类总结了基于不同响应机理的半胱氨酸荧光分子探针的研究进展。 Abstract In recent years, while molecular probes have advantages of instantaneous response, high sensitivity, convenient operation and low detection limit, a large number of molecular probes have been developed for various analytes. Scientific researchers have developed a series of fluorescent molecular probes for cysteine homocysteine (Hcy)，because they play crucial roles in many physiological processes. This tutorial review will classify these probes based on different response mechanism. 引言氨基酸是构成蛋白质的基本物质，并且与生物的生命活动有着密切的联系[1,2]。半胱氨酸(Cysteine，Cys)和同型半胱氨酸(Homocysteine，Hey)是含有巯基（-SH）并且结构相差很小的两种氨基酸，在生理过程中有着重要的作用，医学研究表明他们与很多疾病有关，比如肾功能衰竭、老年痴呆症、帕金森疾病、心血管疾病、冠心病，它们在生物体内含量变化可以作为这些疾病诊断的依据[3-8]。因此，人们投注了很大的精力来研究快速灵敏并且有选择性的检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的技术，目前已经应用的技术包括高效液相色谱法[9]、毛细管电泳法[10]、电化学检测[11]、光学分析[12,13]和质谱鉴定[14]，这些方法可以在体外监测半胱氨酸和同型半胱氨酸，不能在活细胞中的监测。荧光分子探针不仅灵敏度高选择性好，而且能够在活细胞中检测分析物，所以研究者们开始关注将荧光分子探针的这项技术应用于对体外或者细胞内的半胱氨酸和同型半胱氨酸进行监测或者细胞荧光成像[15]。目前已经报导了多种基于化学反应的该类探针，例如Michael 加成、醛环化反应和裂解反应。在这些方法中，在荧光子内引入荧光淬灭剂2,4-二硝基-苯磺酸盐或2,4-二硝基苯磺酰胺基团，导致荧光猝灭，在半胱氨酸和同型半胱氨酸诱导下发生的裂解，荧光得以恢复，这是一种特别有效的方法。这篇

三代基因组测序技术简介及其原理整理.

三代基因组测序技术简介及其原理整理第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。 1977年，桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174，全长5375个碱基。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。 Sanger法原理： 1）在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP（N=A/G/T/ C）加到引物的3’- OH末端，合成出新的互补链。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上ddNTP，由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应，随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。 2）双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。化学裂解法原理：与Sanger法类似，将DNA模板分成4个反应。在每个反应中，先在模板5’端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。反应进行时，平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。接着，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。第二代测序技术第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不

基因组学总结

Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理 2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序的先河。2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。 GS FLX 测序原理：GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA 聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。测序实验流程： 1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）； 2、Emulsion PCR：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验； 3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获； 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。技术特点：? 速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对。比传统的Sanger测序的方法快100倍；? 读长长，单个序列的读长更长，平均可达到450个碱基左右；? 通量高，每个反应可以得到超过100万个序列读长，成本大大降低；? 准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%；? 一致性好，测序结果一致性超过99.99%；? 可以进行Pair－End测序研究；? 简便高效，不需要进行建库、克隆挑取、质粒提取等工作，一个人可以在一天内完成一个微生物物种的测序工作。 GS FLX系统的应用：自从2005年底GS 超高通量基因组测序系统问世以来，已经相继在世界上各大测序实验室成功落户。这项技术的第一个“试验品”就是来自有“DNA之父”之称的James D Waston，他向454公司提供了自己的血液样本。目前GS系统的用户在Nature，Science，PNAS等世界顶级的期刊杂志上已经发表了五十多篇的学术论文。（详细列表请查询https://https://www.wendangku.net/doc/b84794991.html,/sis/sequencing/genome/index.jsp）。与GS 20系统相比较，硬件配置和软件系统方面的革新改进，使得GS FLX系统具有了广泛的应用：全基因组测序；多达120 Mb的未知基因组的测序；－生成基因组结构概图；－研究DNA序列的组织，分布和信息；－基因筛查：寻找新基因，定位和功能；－和其他基因组进行比较研究；全基因组进行从头鸟枪法测序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆测序。比较基因组研究；－识别单碱基突变；－识别突变热点和保守区域；－识别插入或者缺失的基因；－断定基因型和表型之间的相关关系（比如，研究药物抗性的遗传基础）；－基于基因测序变化进行毒性预测；－进行流行病学分析；－了解工业生产菌株和它们的亲代菌株序列上的差异作为进行工业生产菌株开发的遗传基础；－进行宏基因组（metagenomics）研究；－古代化石DNA 测序研究；利用配对末端方法（Pair-End Tag）将Contigs拼接成Scaffolds。转录组和基因调节研究；基于短Tags，ESTs, ChIP，或者GIS-PET序

HPV检测技术及市场概况(完整资料).doc

【最新整理，下载后即可编辑】 HPV检测技术及市场概况一、杂交法（达安19种分型、凯普21种、亚能23种、透景 26种）；实时荧光PCR（达安8种、上海之江13种高危分型、港龙生物（可定量）；第二代杂交捕获法（HC2）等二、已获SFDA批准注册HPV试剂盒（详见附件）

2012年，国家临检中心以凯普21分型产品作为全国医院评估的标准产品，以凯普为标准检验医院检测水平，凯普成为国内HPV检测行业的标准。中国宫颈癌防治工程唯一指定使用HPV检测产品。扩增控制和杂交控制的双重质控技术。 2. 中山大学达安基因股份有限公司核酸诊断试剂是达安基因的主要产品，占营业收入的50%左右，市场份额在60%。达安基因具备荧光探针和核心酶体系自给的核心竞争优势。参股公司安必平主要提供以宫颈癌检查为主的病理诊断产品，提出“HPV DNA+液基细胞”一站式解决方案，在“两癌筛查”大背景下取得了快速增长，2010年贡献净利润约446万。 3. 凯杰生物工程(深圳)有限公司（QINGEN）目前唯一经美国食品和药品监督管理局（FDA）、欧洲CE 和中国食品药品监督管理局（SFDA）共同认证的检测技术，传统金标准。

4.港龙生物技术(深圳)有限公司采用基因芯片法，是市场中检测分型种类最多的试剂盒，26种，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、 59、68、6、11、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、 73。五、HPV临床应用情况三级医院一般均已开展人乳头瘤病毒（HPV）检测，主要在检验科、病理科、妇产科进行，以北京地区医院为例：中国医学科学院肿瘤医院，检验科北京军区总医院，病理科北京大学第一医院，妇产科宫颈病变诊治中心六、物价参考

化学生物学总结

第 1 章多肽和蛋白质【内容】 1. 蛋白质的定义:蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond) 相连形成的高分子含氮化合物。 2. 天然氨基酸的种类和构型: 存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。氨基酸的分类: 3. 多肽合成原理: 多肽的合成就是形成肽键的过程，即一个氨基酸（AA）氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的羧基部分，形成肽键。氨基酸的活性基团必须进行保护。 4. 化学合成多肽方法:肽键形成步骤:制备部分保护的氨基酸，形成只有单一活性位

点的氨基酸衍生物；将氨基保护的氨基酸羧基部分活化，形成活性中间体，再与自由氨基反应形成酰胺键；脱除氨基酸的保护基。 5. 固相多肽合成步骤:步骤： ①多肽的C端氨基酸通过linker键连到树脂上； ②脱除氨基上的临时保护基； ③与下一个氨基酸缩合； ④反复进行脱保护和缩合两个步骤； ⑤脱除半永久性保护基； 6. 表达蛋白连接及其优点: 利用蛋白质剪接技术。硫酯是NCL和EPL的活性关键基团,蛋白硫酯通过重组表达获得。利用蛋白剪接制备硫酯。优点：一、可在蛋白质中引入数量不限的非天然氨基酸；二、能实现大范围的蛋白修饰。第2章核酸【内容】 1.DNA复性和增色效应: DNA复性的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象 2.核小体的组成和核苷酸的组成核小体的组成:DNA：约200bp 组蛋白：H1 H2A H2B H3 H4 核苷酸的组成-------碱基、戊糖、磷酸 3.真核和原核生物rRNA的种类真核生物5S rRNA,28S rRNA,5.8S rRNA,18S rRNA 原核生物5S rRNA,23S rRNA,16S rRNA 4.tRNA的二级结构和三级结构 tRNA的二级结构——三叶草形氨基酸臂DHU环反密码环额外环TΨC环 tRNA的三级结构——倒L形 tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译 5.核酸体外的合成方法（1）核酸的PCR合成技术：一种在体外选择性的将DNA 某个特定区域快速扩增的技术。2）核酸的固相合成技术。单体:核苷亚磷酰胺原理：先将目标核酸链的3’端核苷固定在一个不溶性固相载体上，后沿3’-5’方向依次添加核苷酸至合成所需的长度，再将寡核苷酸链从固相载体上切下，并脱保护基。 6.核酸适体及其应用核酸适体:一类有三维空间结构的单链核酸小分子，与特异靶分子相结合,对靶标分子识别有高度专一性和强亲和力，调节靶标分子的功能。适体的应用:A.荧光修饰的适体用于药物分子的高通量筛选。B.本身可作为药物，

荧光探针

荧光探针的种类、研究热点与研究进展 19920102203495 宋菊平【摘要】：荧光探针在化学传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用，并成为实现上述功能的一种主要的技术手段。最近，无机发光量子点、荧光聚合物纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子等荧光纳米探针的相继出现，为生物分析提供了新的发展领域，成为了近年来研究的热点。而一些传统的探针，也得到了一下新的改进与发展。荧光探针在生物医学光子学领域正呈现一片欣欣向荣的场面。【关键词】：荧光探针；量子点荧光探针；纳米荧光探针；小分子荧光探针；双光子金属离子荧光探针；硫醇类探针；（一）荧光探针的种类按照荧光探针制作方式，可分为化学荧光探针和基因荧光探针。其中化学荧光探针是由化学方法合成的，而基因荧光探针是由可遗传、由DNA编码、蛋白质组成的。按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等按照荧光探针功能来分，可分为细胞活性探针；细胞器探针；膜荧光探针；核酸探针；Ph值探针；免疫荧光探针；钙离子探针；活性氧探针。细胞活性探针是标记活细胞；酯酶底物探针、过氧化物酶底物探针和离子泵活性指示探针识别死细胞，死细胞探针有膜不透性DNA探针和丹磺酰赖氨酸。而其优点是灵敏，安全。细胞器探针是与细胞器选择性结合的荧光染料。主要用途：研究胞内的氧化作用、有丝分裂、底物降解作用、解毒反应、细胞间的转运和细胞分拣等。膜探针是非极性探针、两性探针、膜流动性探针、荧光标记的磷脂、脂肪酸和固醇探针。用途：测量膜的扩散、监测病毒－细胞的融合、观察膜流动性和研究膜表面的分子组成。核酸是细胞生长、分化、遗传的重要物质。用途：测定DNA和RNA的形态和含量；研究细胞周期和肿瘤的诊断、治疗和预防。（二）一些荧光探针热点的实例 1：小分子荧光探针小分子荧光探针一般由两部分组成：荧光团以及与受体专一性高亲和力结合的配体。受体与目标蛋白质融合，通过受体与配体的相互作用来标记蛋白质。总体说来，小分子荧光探针应该可以穿过细胞膜并且无毒；能够与受体专一性稳定结合，使得其在进行监测的较长时间（几个小时）内保持稳定性；背景噪音水平尽可能的低；探针尽可能地设计成一定的模式，使得多种荧光团能够方便地结合。选择合适的受体可以实现对蛋白质位点专一性结合。对于受体的选择有以下两个要求：（1）受体与目标蛋白质融合后必须能够被基因表达；（2）受体应该尽可能小，以致不干扰目标蛋白质的正常生理功能，因此较理想的受体是一段短序列的肽链并且能够插入目标蛋白质的许多位点。而选择适合的受体-配体对可以实现对蛋白质高灵敏度高亲和力结合。一般说来，受体与配体的结合应当尽可能地快，有利于监测时间敏感

铅离子与牛血清蛋白相互作用光谱分析—大学课程设计方案

编号：本科毕业设计<论文）题目：铅离子与牛血清蛋白相互作用的光谱分析 Spectroscopic investigations on the interaction of Pb2+with bovine serum albuminn 学院学院专业班级学号姓名指导教师职称完成日期

牛血清蛋白和铅离子相互作用的光谱分析摘要：本文综合运用荧光光谱法、紫外光谱法、红外光谱法分析铅离子和牛血清蛋白相互作用的光谱特征。探究了不同的实验条件：pH、牛血清蛋白浓度、铅离子浓度、离子强度对铅离子-牛血清蛋白体系光谱的影响，以及最佳实验条件，利用紫外光谱中峰值变化或者位移初步判断铅离子与BSA发生了作用。荧光光谱测定出铅离子可以引起牛血清蛋白的荧光猝灭，利用红外光谱分析铅离子对蛋白质二级结构的影响，可知β-转角增加，α-螺旋减小，β-片层增加。关键词：铅离子；牛血清蛋白；荧光光谱；紫外可见光谱；红外光谱 Abstract: In this paper，The interaction ofPb2+and bovine serum albumin (BSA> was studied by fluorescence，UV Spectrum，and infrared spectroscopy.It is exploredthe impact of different experimental conditions:pH，the concentration of the bovine serum albumin，the concentration of the lead ion .UV Spectrum shows that Pb2+ froms a compound with BSA.The results revealedthatPb2+caused the fluorescencequenching of BSA.Infrared spectroscopy shows theinteractionbetweenPb2+andBSA couldresultinthechange ofconformation of BSA.Thushelix structure in BSA was decreased the β-sheet was increased. Keywords：lead ion；bovineserum albumin。fluorescencespectrometry；UV Spectrum；infrared spectroscopy 目录

荧光探针汇总

荧光探针汇总文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）