耐药胞株构建

稳定/耐药细胞株构建

一、服务介绍

稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。本公司可提供普通脂质体转染后单克隆法筛选,以及病毒感染后筛选稳定株和耐药株

二、技术原理

稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。在阳性混合克隆的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）

三、操作流程

1、载体构建：将外源基因构建到合适的载体上，如需病毒转染，则包装病毒。

2、筛选浓度测定：以14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。

3、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和

细胞形状而定

4、细胞转染：用构建好的载体（或包装好的病毒）转染目的细胞。

5、抗生素筛选。

6、鉴定筛选结果

四、客户提供

1.外源基因及相关基础数据；

2.生长状态良好的靶细胞系,特殊细胞需提供培养基

3.与该技术相关其它信息

五、实验结果提供形式

1、构建完成的稳定/耐药细胞株以及对照细胞株

2、稳转/耐药细胞株标准实验报告及相关的外源基因表达分析结果

3、实验流程及报告电子版本一份

六、实验服务周期

约5-8周左右，具体时间根据细胞生长,药物诱导情况而定。

七、质量承诺及舜百优势

a.稳定：舜百生物保证20代以内稳定转染细胞稳定表达。

b.迅速：一般控制在1.5个月以内完成构建。

c.经济：价格实惠，性价比高。

d.质量保证：对外源基因进行严格鉴定。

实验十一 紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 Ⅰ、紫外诱变技术 一实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例,学习微生物诱变育种的基本技术。了解紫外线对细菌细胞的作用。 二实验材料与用具 菌株:大肠杆菌(Escherichia coli) 培养基:营养肉汤(nutrient broth)固体与液体培养基 生理盐水等 器皿:10ml及1ml的移液管,无菌试管,无菌培养皿,无菌三角瓶(内有无菌的玻璃珠20~40粒),无菌漏斗(内有两层擦镜纸),无菌离心管,离心机,紫外诱变箱等。 三实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小,一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率,可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效就是UV,UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯,其光谱比较集中在253、7nm处,这与DNA的吸收波长一致,可引起DNA分子结构发生变化,特别就是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产与科研中可利用此法获得突变株。 四实验内容 1、对出发菌株进行处理,制备单细胞悬液; 2、紫外线进行处理; 3、用平板菌落计数法测定致死率;

五 操作步骤 (一)出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基,37℃培养16~24h; 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基,37℃ 110rpm 振荡培养过夜(约16h),第二天,以 20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基,继续培养2~4h; 3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中,10000rpm 离心3~5min,弃去上清液,加4ml 无菌生理 盐水,重新悬浮菌体,再离心,弃去上清,重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液; 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内,振荡20~30min,以打散细胞; 5. 取诱变前的0、5ml 菌悬液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度倾注肉汤平板, 每一梯度倾注两皿,每皿加1ml 菌液,37℃倒置培养24~36h,进行平板菌落计数。 (二)UV 诱变 1. 将紫外灯打开,预热30min; 2. 取直径6cm 的无菌培养皿(含转子),加入菌悬液5ml,控制细胞密度为107~108个/ml; 3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上,静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋 纽进行搅拌,然后打开皿盖,分别处理5s 、10s 、15s 、30s 、45s,照射完毕后先盖上皿盖,再关闭搅拌与紫外灯; 4. 取0、5ml 处理后的菌液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度倾注肉汤平板进 行计数(避光培养)。 六 实验结果 对平板菌落进行计数,并计算死亡率。 %100///?-=ml ml ml 照射前活菌数照射后活菌数照射前活菌数死亡率

HBV耐药基因突变检测

HBV耐药基因突变检测 项目简介：HBV是一种经血液传播的嗜肝DNA病毒，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要因素。抗病毒治疗是最常见的乙肝治疗方式。国内外公认的抗病毒药物主要有干扰素和核苷（酸）类药物两类。核苷（酸）类药物因口服方便、毒副作用少、病毒载量下降较快而受到广泛关注。 长期服用核苷（酸）类药物易产生耐药。在用药过程中，患者体内HBV DNA及谷丙转氨酶（ALT）逐渐下降，继而达到一个平稳期，患者病情减轻。此时，HBV很难被完全清除，而是处于一个低复制非活动时期。随着用药时间的延长，对药物敏感的野生株数量下降，具有耐药突变的变异株因对药物不敏感，而得以不断复制、增加，从而导致HBV DNA及ALT重新上升，使得肝炎复发。耐药发生的直接后果即为药物疗效的降低和丧失，具体表现为肝炎复发、肝病急性加重、肝硬化，甚至出现肝衰竭。 乙型肝炎病毒耐药是指在核苷酸类似物作用下，药物靶乙型肝炎病毒 P 基因中的某些位点发生改变，导致这种药物对乙型肝炎病毒的抑制作用下降或消失。自拉米夫定上市以来，目前经美国FDA 批准先后上市的核苷酸类似物有阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。这些药物作用下出现的病毒耐药均与乙型肝炎病毒 P 基因变异有关。如拉米夫定耐药相关突变位点为D 区M204V/ I、B 区L180M，阿德福韦相关突变位点为D 区N236T、B 区A181V，替比夫定为M204I，L180M，病毒只需要1 个上述位点突变就可发生对这些药物耐药。而对恩替卡韦耐药必须建立在拉米夫定耐药基础上(L180M +M204I/V)，同时出现Al84G 或S202I 或M250V 突变。随着用药时间推移，各类核苷酸类似物发生耐药的几率是不尽相同的。其中拉米夫定几率最高，而恩替卡韦由于具有较高耐药基因屏障，所以产生耐药的几率最低，在用药后的4 年内都维持在1.1%。 因此通过检测HBV耐药基因突变点有助于判断治疗的效果、制定个体化抗病毒治疗方案。使用核苷酸药物导致耐药基因突变原理如下图所示。

耐药细胞株耐药特性一般研究方案

耐药细胞株耐药特性一般研究方案 1 耐药谱 MTT法测定亲本株和耐药株对于不同抗肿瘤药物的IC50 计算耐药株的耐药指数，以检测耐药株的多药耐药性与了解耐药谱。 凯基现可免费提供的抗肿瘤药物：紫杉醇、阿霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、顺铂、长春新碱 2 增殖能力 ◆绘制生长曲线，计算倍增时间 MTT法检测亲本株和耐药株7天的数量（每天测一次），绘制细胞的生长曲线，计算细胞倍增时间，一般耐药株的倍增时间较亲本株变长。 ◆流式细胞仪检测细胞周期 PI染色法检测亲本株和耐药株的细胞周期，比较G1期、S期、G2期的细胞比率。不同耐药细胞株各个时期的细胞比率无共同特征。 3 耐药能力 流式细胞仪检测罗丹明蓄积能力 测定亲本株与耐药株的P-gp糖泵对罗丹明的外排能力 4 耐药机制 测定亲本株与耐药株耐药基因与蛋白表达的变化 基因检测可采用RT-PCR、Real time-PCR等，蛋白检测可采用WB、IF、IHC等，基因和蛋白各采用一种方法检测，基因检测推荐采用Real time-PCR，蛋白检测推荐采用WB 常见耐药基因与蛋白： ◆MDR-1/P-gp（P糖蛋白）：分子量约为170 kD的磷酸糖蛋白，具有ATP依赖 性的药物外排泵功能。现已证实，P-gp高表达为产生MDR的主要机制，P-gp 可以和抗肿瘤药物及疏水亲脂性化合物结合，通过ATP水解供能，逆浓度梯

度将药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度降低而产生耐药。 ◆MRP1（多药耐药相关蛋白1）：分子量约190kDa，结构和功能与P—gP的类 似 ◆LRP（肺耐性蛋白）：分子量约ll0 kD胞质穹隆蛋白，LRP介导的MDR与细胞 核、细胞质运输有关，正常组织外，很多不同来源的肿瘤如直肠癌、白血病、卵巢癌等均发现有LRP的过度表达 ◆BCRP（乳腺癌耐药蛋白）：是一种分子量约95 kD的磷酸糖蛋白药物转运体以上四种蛋白，一般检测P糖蛋白、多药耐药相关蛋白1

塞来昔布对乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7ADM的增殖抑制作用

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０５５９－ ０４［收稿日期］　２０１１－１１－ ３０［基金项目］　吉林省科技厅白求恩医学专项基金资助课题（２００７０５２９０ ）［作者简介］　哈森高娃（１９８２－） ，女，内蒙古自治区呼伦贝尔市人，医师，医学硕士，主要从事血液系统疾病及恶性肿瘤诊治的研究。 ［通信作者］　王　杨（Ｔｅｌ：０４３１－８９８７６８５５，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｙａｎｇ＠ｃｓｃｏ．ｏｒｙ．ｃｎ）塞来昔布对乳腺癌阿霉素耐药细胞株ＭＣＦ－ ７／ＡＤＭ的增殖抑制作用哈森高娃１，王　杨２，楚小慧２ （１．内蒙古林业总医院血液肿瘤科，内蒙古牙克石０２２１５０；２．吉林大学中日联谊医院特需病房，吉林长春１３００３３）［摘　要］　目的：通过研究选择性环氯化酶２（ＣＯＸ－２）抑制剂塞来昔布联合阿霉素（ＡＤＭ）对乳腺癌ＭＣＦ－ ７／ＡＤＭ细胞株生长的作用，探讨塞来昔布的抗肿瘤作用。方法：ＭＣＦ－ ７／ＡＤＭ细胞加入不同浓度等倍稀释的ＡＤＭ（０．０５、０．１０、０．２０、０．４０、０．８０和１．６０ｍｇ ·Ｌ－１）为对照组，ＭＣＦ－７／ＡＤＭ细胞加入无细胞的完全培养基为阴性对照组，在对照组的基础上联合应用１０、２０μｍｏｌ·Ｌ－１塞来昔布为实验组，各组细胞于２４、４８、７２ｈ后采用 ＣＣＫ－８检测细胞生长抑制率。ＭＣＦ－７／ＡＤＭ细胞单加０．０５ｍｇ·Ｌ－１　 ＡＤＭ及联合塞来昔布（１０、２０μｍｏｌ·Ｌ－１）处理后３ｈ收集细胞，采用流式细胞术检测细胞内ＡＤＭ水平。结果：不同浓度ＡＤＭ单药及联合塞来昔 布（１０和２０μｍｏｌ·Ｌ－１）作用于ＭＣＦ－７／ＡＤＭ　 ２４、４８和７２ｈ后细胞生长受到抑制，实验组不同时间细胞生长抑制率均高于对照组（Ｐ＜０．０５），且２０μｍｏｌ·Ｌ－１塞来昔布实验组细胞生长抑制率高于１０μｍｏｌ ·Ｌ－１塞来昔布实验组，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。对照组２４、４８和７２ｈ的细胞未见明显变化，但实验组细胞作用４８和 ７２ｈ后出现细胞改变及死亡，呈塞来昔布剂量依赖性。与对照组比较，塞来昔布实验组（１０和２０μｍｏｌ ·Ｌ－１）细胞内ＡＤＭ浓度升高（Ｐ＜０．０５）；２０μｍｏｌ·Ｌ－１塞来昔布实验组细胞内ＡＤＭ浓度高于１０μｍｏｌ ·Ｌ－１塞来昔布实验组（Ｐ＜０．０５）。结论：选择性ＣＯＸ－ ２抑制剂塞来昔布联合ＡＤＭ可有效逆转乳腺癌ＡＤＭ细胞株耐药。［关键词］　塞来昔布；乳腺肿瘤；乳腺癌细胞；ＭＣＦ－ ７／ＡＤＭ；阿霉素［中图分类号］　Ｒ７３７．９ ［文献标志码］　Ａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　 ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｉｒａｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ＭＣＦ－ ７／ＡＤＭＨＡＳＥＮ　Ｇａｏ－ｗａ１，ＷＡＮＧ　Ｙａｎｇ２， ＣＨＵ　Ｘｉａｏ－ｈｕｉ　２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　 Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｙａｋｅｓｈｉ　０２２１５０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＶＩＰ，Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ　Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ ｃｈｕｎ　１３００３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　 ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｉｒａｍｙｃｉｎ（ＡＤＭ）－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ＭＣＦ－７／ＡＤＭ　ａｎｄ　ｔｏ　ｄｉｓｃｕｓｓ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ＭＣＦ－ ７／ＡＤＭｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＤＭ（０．０５，０．１０，０．２０，０．４０，０．８０，１．６０ｍｇ ·Ｌ－１）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ；ｔｈｅ　ＭＣＦ－７／ＡＤＭ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡＤＭ　ａｎｄ　１０，２０μｍｏｌ·Ｌ－１　ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　 ＣＣＫ－８ａｆｔｅｒ　２４，４８ａｎｄ　７２ｈ．Ｔｈｅ　ＭＣＦ－７／ＡＤＭ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ０．０５ｍｇ ·Ｌ－１　ＡＤＭ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（１０ａｎｄ　２０μｍｏｌ·Ｌ－１）ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　３ｈａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＤＭ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　 ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　２４，４８ａｎｄ　７２ｈａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＤＭ　ａｌｏｎｅ　ｏｒ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　 ｗｉｔｈｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（１０ａｎｄ　２０μｍｏｌ·Ｌ－１）．Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　 ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎｃｏｎｔｒｏｎｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）；ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｉｎ　２０μｍｏｌ·Ｌ－１　ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　 ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ９ ５５第３８卷　第３期 ２０１２年５月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３　Ｍａｙ　２０１２

抗药性突变株的获取和突变率测定

实验名称：抗药性突变株的获取 和突变率测定 姓名： 学号： 系别： 实验日期： 同组同学名单:

本实验利用紫外线诱变，获得大肠杆菌的链霉素抗性突变株，学习了解微生物诱变育种的基本技术。试验后，通过计算紫外照射造成的死亡率以及自发突变频率和诱导条件下突变频率，进一步加深对紫外诱导的认识。 【实验目的】 1.掌握获取细菌自发和经诱变产生的突变株的基本方法。 2.了解突变株频率和突变率的计算。 3.了解微生物诱变育种的基本技术。 4. 【实验材料】 1.菌种大肠杆菌（E. coli） 2.培养基及试剂牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、蒸馏水、链霉 素（母液10 mg/mL；终浓度10 μg/mL）。 3.仪器及用具三角瓶（300 mL）、9 cm培养皿、6 cm培养皿、离心管（1.5 mL）、恒 温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、大头针、涂布器、酒精灯 【实验方法及步骤】 （一）出发菌株培养液的制备 1. 取斜面或冻存菌种划平板，获得单克隆一个。 2. 取单克隆，37°C条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基培养8~24h；稀释培养液， 取102 ~103 个细菌个体转移到新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，过夜培养。 （二）培养基的制备 倒牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（非选择性培养基），以及含有链霉素的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（选择性培养基平板；链霉素终浓度10 μg/mL，在倒平 板前加入到培养基中） （三）自发突变的测定 取过夜培养液，稀释106倍（用1.5mL离心管装0.99mL 无菌蒸馏水，将10 μL 培养液加入到0.99 mL蒸馏水，震荡或吹打混匀，连续三次），取100μL 涂布在非

一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法

一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法 2016-11-21 13:33来源：内江洛伯尔材料科技有限公司作者：研发部 一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法原发性肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中排名第六，死亡率则居第三，且大多数肝癌患者诊断时已是中晚期，术后频频复发转移，导致肝癌患者的预后较差。化疗是治疗肝癌的重要手段之一，但化疗中常出现且难以解决的是肿瘤多药耐药性（multidrugresistance,MDR)，即肿瘤同时对多种结构和作用机制不同的化学药物产生交叉耐药，它是化疗失败的主要原因。因此克服肿瘤多药耐药性以及防止或逆转肿瘤多药耐药的发生对于提高化疗效果十分重要。而建立肿瘤耐药细胞株对于研究肿瘤耐药机制、肿瘤细胞耐药性逆转、开发及评价新药等具有重要的应用价值。 顺铂（cis-diaminedichloroplatinum，Q)DP)属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用，为临床治疗肝癌常用药物。 本发明提供一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、取人肝癌细胞LM3细胞复苏后用DMEM培养液，于培养箱中培养；步骤二、取对数生长期LM3细胞种于24孔板中，分别加入0.1μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L顺铂，适时传代或换夜。以顺铂加入后细胞可以保持长期生长的最大浓度为最佳浓度。步骤三、寻找到最佳浓度为0.5μmol/L，后用最佳浓度长期刺激细胞4个月，得到肝细胞癌顺铂耐药细胞株。本发明得到的肝细胞癌顺铂耐药细胞株可用于发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等。

耐药胞株构建

稳定/耐药细胞株构建 一、服务介绍 稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。本公司可提供普通脂质体转染后单克隆法筛选,以及病毒感染后筛选稳定株和耐药株 二、技术原理 稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。在阳性混合克隆的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin） 三、操作流程 1、载体构建：将外源基因构建到合适的载体上，如需病毒转染，则包装病毒。 2、筛选浓度测定：以14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。 3、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和 细胞形状而定 4、细胞转染：用构建好的载体（或包装好的病毒）转染目的细胞。 5、抗生素筛选。 6、鉴定筛选结果 四、客户提供 1.外源基因及相关基础数据； 2.生长状态良好的靶细胞系,特殊细胞需提供培养基 3.与该技术相关其它信息 五、实验结果提供形式 1、构建完成的稳定/耐药细胞株以及对照细胞株 2、稳转/耐药细胞株标准实验报告及相关的外源基因表达分析结果 3、实验流程及报告电子版本一份 六、实验服务周期 约5-8周左右，具体时间根据细胞生长,药物诱导情况而定。 七、质量承诺及舜百优势 a.稳定：舜百生物保证20代以内稳定转染细胞稳定表达。 b.迅速：一般控制在1.5个月以内完成构建。 c.经济：价格实惠，性价比高。 d.质量保证：对外源基因进行严格鉴定。

耐药机制及模式

乙型肝炎病毒核苷（酸）类似物耐药的机制 发表者：阮连国 (访问人次：290) 过去十年，国内批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物已从一种普通干扰素增加到包括聚乙二醇干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定在内的6种药物，国外还有替诺福韦酯以及恩曲他滨。尽管核苷（酸）类药物与干扰素相比服用方便，副作用少，但在48周疗程结束停药后，往往不能获得病毒持续抑制而延长疗程，甚至可能是无限期的。长期应用该类药物可伴有病毒耐药风险的增加，病毒耐药及患者依从性差是导致慢性乙型肝炎抗病毒治疗失败的两个最重要原因。 核苷(酸)类药物治疗失败分为原发性治疗失败（初始治疗无应答）和继发性治疗失败，所谓原发性治疗失败，是指在开始抗病毒治疗后三个月内，血清乙型肝炎病毒（HBV） DNA浓度下降小于1× log 10 IU/ml；而继发性治疗失败则被定义为初始抗病毒治疗有效（三个月内，血清HBV DNA浓度下降大于或等于1×log10 IU/ml），但一段时间后病毒反跳，血清HBV DNA浓度比治疗中最低值升高大于或等于1×log10 IU/ml。病毒变异及耐药是继发性治疗失败的最重要的原因。 一、乙型肝炎病毒复制特点及其变异的产生 在HBV DNA的复制过程中，需要经过一个逆转录的过程，由于病毒逆转录酶缺乏3’-5’核酸外切酶活性，所以无法对错配的核苷(酸)酸进行校读,导致HBV DNA的天然复制错误率比其他DNA病毒高10倍左右。HBV基因在复制过程中不断产生天然变异，从而在未经治疗的HBV感染者体内常常形成一群基因序列十分相似、但不完全等同的病毒株组成的准种（quasispecies）。由于HBV DNA的重叠读框特点，大部分的HBV DNA准种会导致其复制能力的下降，在特定环境下的优势株就是在特定选择压力下复制能力最强的准种。内源性（宿主免疫应答）和外源性（抗病毒药物或病毒传播过程）选择压力下的HBV变异株（准种）池的存在为HBV提供了生存优势，使得其在免疫应答（前C区或e抗原逃逸）、预防性疫苗（疫苗逃逸）和抗病毒药物（病毒耐药）前就存在变异逃逸株。 HBV对抗病毒药物的耐药反映了病毒对于药物抑制敏感性的下降，缘于药物选择性压力下病毒的适应性变异。已经确定了两种类型的耐药变异：主要耐药变异和代偿性耐药，前者直接降低病毒对药物的敏感性，而后者则可能增强病毒的复制能力，因为主要耐药变异往往伴随着病毒复制适应性的降低。代偿性耐药变异的重要性在于它能在准种记忆的基因库里弥补耐药变异株的缺陷。耐药变异株出现的标志包括病毒载量的上升，一般从最低点升高大于1logIU/ml，和（或）病毒多聚酶区出现已知的基因耐药标志，血清谷丙转氨酶的升高以及最终临床症状的恶化。 二、乙型肝炎病毒耐药产生的相关因素 HBV耐药的发展至少取决于以下六个因素：（1）病毒复制的数量和速率；（2）病毒聚合酶的保真性；（3）药物的选择压力；（4）肝脏复制空间总量；（5）耐药病毒株的复制适应性；（6）药物的基因屏障。

人肺腺癌细胞HCC4006对厄洛替尼耐药细胞株的建立及其耐药机制鉴定

人肺腺癌细胞HCC4006对厄洛替尼耐药细胞株的建立及其耐药机制鉴定 梁继珍，李理，易基群△ 广州市红十字会医院肿瘤科（广东广州510220） 【摘要】目的建立人肺腺癌EGFＲ敏感突变细胞HCC4006对厄洛替尼耐药细胞株，并初步鉴定其耐药机制。方法厄洛替尼采用梯度递增的方式处理HCC4006细胞，直至HCC4006在厄洛替尼8μmol/L浓度下，生长速度接近HCC4006细胞，视为HCC4006厄洛替尼耐药细胞株即HCC4006EＲ；使用MTT法分别检测厄洛替尼、阿伐替尼对HCC4006、HCC4006EＲ细胞的增殖抑制作用；计算HCC4006、HCC4006EＲ对厄洛替尼、阿伐替尼的IC 50 值及耐药指数；显微镜下观察HCC4006EＲ细胞形态变化，并使用免疫印迹法检测常见上皮间质转化标志在HCC4006及HCC4006EＲ中的蛋白表达水平。结果HCC4006EＲ细胞对厄洛替尼耐药，其 IC 50 值为（11393.33?18.95）μmol/L，是HCC4006的260.84倍；HCC4006EＲ细胞对第2代EGFＲ－TKI阿伐替尼具有交叉耐药（耐药指数为258.78）；HCC4006EＲ较HCC4006细胞呈现上皮间质转化形态改变，其间质标志ZEB1、N－cadherin、vimentin升高而上皮标志E－cadherin、ESＲP1/2蛋白下降。结论成功建立对厄洛替尼耐药的HCC4006EＲ细胞株，且其对阿伐替尼具有交叉耐药；HCC4006EＲ针对EGFＲ－TKI的耐药可能与上皮间质转化有关。 【关键词】非小细胞肺癌；肿瘤抗药性；表皮生长因子受体－酪氨酸激酶抑制剂 肺癌是目前全球死亡人数最高的恶性肿瘤，其中85%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC），大约2/3的NSCLC患者存在致癌驱动基因，其中一半的患者具有治疗价值的靶点，而最为常见的驱动基因事件为表皮生长因子受体（EGFＲ）突变［1－2］。目前靶向EGFＲ的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物已发展为3代药物：包括第1代药物吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼等，第2药物阿伐替尼，第3代药物奥希替尼等。EGFＲ－TKI的临床应用将EGFＲ突变型晚期NSCLC中位生存时间由8 10个月延长为3年以上［3］。但是部分靶向治疗患者在治疗的过程中不可避免地出现耐药。建立EGFＲ－TKI耐药细胞株并进一步研究其耐药机制具有重要的现实意义。本研究于2017年2—8月选择存在EGFＲ19外显子缺失突变的人肺腺癌细胞株HCC4006，使用第1代EGFＲ－TKI厄洛替尼处理，建立对厄洛替尼耐药的细胞株并初步评估其耐药机制，为后续相关研究提供基础。 1材料与方法 1．1实验材料人肺腺癌细胞株HCC4006由南方医科大学惠赠；HCC4006于含10%FBS、1%青霉素链霉素的ＲPMI1640培养基中，置于37?、5%CO 2培养箱内培养，4d左右传代1次。厄洛替尼、阿伐替尼分别由瑞士罗氏公司、德国勃林格殷格翰公司赠予；分别使用DMSO溶解成8mmol/L、20mmol/L 浓度备用。使用抗体如下：鼠抗人N－cadherin（sc－8426，Santa Cruz）、鼠抗人ESＲP1/2（210－301－c31，Ｒockland）、兔抗人ZEB1（3396，Cell Signaling）、鼠抗人N－cadherin（sc－8424，Santa Cruz）、vimentin （ab137321，Abcam）；辣根过氧化酶标记鼠抗（31420）及兔抗（A18903）IgG二抗，ECL显色试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。 1．2耐药细胞株的构建梯度递增使用2nmol/L、20nmol/L、200nmol/L、2μmol/L、8μmol/L浓度的厄洛替尼处理HCC4006细胞，药物处理72h后更换为不含药物培养基，待细胞生长至80%满盘时再次使用药物处理，当细胞在该浓度药物作用下生长速度接近HCC4006母代细胞时升级为下一浓度梯度；耐受8μmol/L厄洛替尼浓度的HCC4006细胞，持续维持在含8μmol/L厄洛替尼的培养基培养并传代10代以上，视为HCC4006厄洛替尼耐药细胞株，即HCC4006EＲ。 1．3MTT法检测药物对细胞的增殖抑制参考文献报道厄洛替尼、阿伐替尼用药浓度梯度分别为5、15、45、135、405、1215nmol/L和3、9、27、81、243、729 nmol/L［4］。MTT实验方法如下：收集对数期细胞， · 33 · 广东医学2018年5月第39卷（增刊）Guangdong Medical Journal May2018，Vol．39，Suppl．DOI:10.13820/https://www.wendangku.net/doc/b010213400.html,ki.gdyx.2018.s1.010 △通信作者。E－mail：yijiqun@139．com

CQ11逆转多药耐药人胃癌细胞株对多柔比星的耐药

CQ11逆转多药耐药人胃癌细胞株对多柔比 星的耐药 作者：吴达龙睢凤英张成文吕焕章 【摘要】目的: 探讨氯喹衍生物CQ11对耐长春新碱(vincristine, VCR)人胃癌多药耐药(multidrug resistance, MDR) 细胞株SGC7901/VCR的耐药逆转作用。方法：将SGC7901和SGC7901/VCR细胞分别与各种浓度的多柔比星(doxorubicin, DOX)和/或CQ11在体外共同培养，采用MTT法检测其细胞毒作用；采用荧光分光光度计测定细胞内DOX蓄积量。结果：SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药程度是SGC7901细胞的37.5倍。1.0、2.5 和 5.0 mol/L的CQ11分别使DOX对SGC7901/VCR细胞的敏感性分别增加到 2.2倍(P<0.01)、5.5倍(P<0.01) 和14倍(P< 0.01)。DOX蓄积实验表明，CQ11能显著增加SGC7901/VCR细胞内DOX蓄积，而对SGC7901细胞内DOX蓄积无明显影响。结论：通过增加细胞内DOX蓄积量，CQ11在体外能有效逆转SGC7901/VCR细胞对DOX的耐药性 【关键词】多药耐药; 氯喹; 胃癌; 逆转剂 肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性，同时对其它结构上无关、作用机理各异的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性［1］。MDR是一种独特的广谱耐药现象，

是导致化疗失败的重要原因，许多天然来源的抗肿瘤药物如长春新碱(vincristine, VCR)、紫杉醇等及蒽环类抗癌抗生素如多柔比星(doxorubicin, DOX)、柔红霉素都极易发生MDR［1~3］。MDR主要的耐药机理为多药耐药基因mdr1扩增及其蛋白产物P-糖蛋白(permeability glycoprotein, Pgp)过表达。作为一个ATP依赖性的药物转运泵，Pgp能主动将疏水性抗肿瘤药物泵出胞外, 从而减少细胞内药物蓄积, 增加药物外排［3］。MDR逆转剂，如维拉帕米和环孢菌素A，能与Pgp结合，抑制Pgp的药物外排功能，增加耐药细胞内抗肿瘤药蓄积，从而恢复细胞对抗肿瘤药的敏感性。然而，大量的临床研究结果表明，上述肿瘤MDR逆转剂由于体内毒性大，体内难以达到有效逆转浓度［3］。因此积极寻找高效低毒的新型MDR逆转剂，已成为肿瘤MDR研究的热点。 氯喹 CQ11 图1 氯喹和氯喹衍生物CQ11的化学结构 CQ11是以抗疟药氯喹的结构母核为基础, 经侧链改造而获得的新化合物(化学结构见图1)，由本课题组合成。本研究以耐VCR人胃癌MDR细胞株SGC7901/VCR为体外模型，研究CQ11对SGC7901/VCR 细胞的体外MDR逆转效应。

阿霉素耐药逆转研究

?研究进展? ２００６年１２月第３卷第３５期 ＣＨＩＮＡＭＥＤＩＣＡＬＨＥＲＡＬＤ 中国医药导报［参考文献］ ［１］ＫＩＭＡｎｔｏｎｏｖ，ＤＧＬＬｓａｃｓｏｎ．ＰｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｎｏｎｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎａｌｇｅｓｉｃｕｓｅｉｎＳｗｅｄｅｎ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，３２：４８５－９４．［２］ＲＡＭｏｏｒｅ，ＤＣａｒｒｏｌｌ，ＰＪＷｉｆｆｅｎ，ｅｔａｌ．ＭｃＱｕａｙ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗｏｆｔｏｐｉｃａｌｌｙａｐｐｌｉｅｄｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇｓ［Ｊ］．ＢｒｉＭｅｄＪ，１９９８，３１６：３３３－３３８． ［３］洪瑞乔，王逸茹，林赛娥，等．数字疼痛分级法在癌症疼痛治疗中的应用［Ｊ］．实用护理杂志，２００３，１９（７）：４８－４９． ［４］司凯英，刘福清，田波，等．我院麻醉性镇痛药应用情况分析［Ｊ］．中国现代应用药学，２００５，２２（４）：３４６． ［５］佘守章，许学兵．术后ＰＣＡ新进展［Ｊ］．广东医学，２００１，２２（１０）：８８１－８８２．［６］佘守章，许学兵，刘继云，等．罗哌卡因不同速率硬膜外持续输注对 吗啡ＰＣＡ消耗量的影响［Ｊ］．中华麻醉学杂志，２０００，２０（９）：５７０－５７１． ［７］朱永满，江伟，徐惠芳．曲马多的药效和药动力学［Ｊ］．国外医学?麻醉学 与复苏分册，２００１，２２（１）：５６－５９． ［８］丁丽华，于元生．实验性三叉神经痛慢性窄缩环术动物模型建立［Ｊ］．中 国疼痛医学杂志，２００４，１０（１）：１５－１８． ［９］张智君，唐日新．慢性疲劳综合征的心理特征、 认知特征及研究展望［Ｊ］．中华流行病学杂志，２００３，２４（９）：７８３－７８６． ［１０］孙瑞卿，王韵．神经源性疼痛的机制研究进展［Ｊ］．中国疼痛医学杂志， ２００３，９（２）；１０５－１１０． ［１１］易建莉．癌症疼痛的规范化治疗［Ｊ］．现代肿瘤医学，２００５，１３（２）：２８３－ ２８５． ［１２］王家双．肿瘤疼痛的现代治疗和展望［Ｊ］．现代医院，２００４，４（３）：１６－１８．［１３］ＳｈｖａｒｔｚｍａｎＰ，ＦｒｉｇｅｒＭ，ＳｈａｎｉＡ，ｅｔａｌ．Ｐａｉｎｃｏｎｔｒｏｌｉｎａｍｂｕｌａｔｏｒｙｃａｎ ｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ—ｃａｎｗｅｄｏｂｅｔｔｅｒ［Ｊ］．ＪＰａｉｎＳｙｍｐｔｏｍＭａｎａｇｅｒ，２００３，２６（２）：７１６－７２２． ［１４］刘华，王蔚，郑重志，等．癌症三阶梯止痛５６３例分析［Ｊ］．中国肿瘤临 床，２００４，３１（２３）：１３４７－１３４９． ［１５］周伟华，杨俏玲，吴建文，等．肝癌疼痛的三阶梯药物治疗的临床观 察［Ｊ］．中国肿瘤临床与康复，１９９８，５（１）：７１－７３． （收稿日期：２００６－１０－３０） 抗肿瘤药物产生多药耐药（ＭＤＲ）是导致肿瘤化疗达不到预期效果的主要原因之一。在众多抗癌药中，阿霉素是最具有代表性的药物，如何克服阿霉素的耐药行为是解决抗癌药ＭＤＲ的首要难题。目前有关抗癌药耐药逆转的报道甚多，笔者仅对阿霉素的耐药逆转情况作如下综述。 １抗癌药多药耐药机理 ＭＤＲ是指肿瘤细胞在反复多次应用某种药物后，不仅对 初次应用的药物产生耐药，还会对作用机制不同、功能迥异、结构相差较大的其他抗癌药产生耐药。其耐药机理大致有：谷胱甘肽及其酶类的改变；Ｔｏｐｏａｓｅ－ＩＩ的降低和ＤＮＡ损伤修复能力的增强；ＭＲＰ表达的增加；ｍｄｒ－１基因及其产物Ｐ－ｇｐ（Ｐ糖蛋白）的过度表达［１，２］等均可导致细胞的ＭＤＲ出现。 ２抗癌药耐药逆转途径 抗癌耐药表现为多药耐药，这种多药耐药临床体现为细胞内抗癌药的蓄积量降低，其逆转主要是通过增加细胞内药物蓄积，减少药物外排而实现。 ３阿霉素耐药逆转的研究 ＭＤＲ逆转方式很多，目前已用于临床的有ＭＤＲ逆转剂 如环孢霉素及类似物ＳＤＺＰＳＣ８３３、 三氟拉嗪、三苯氧胺及抗癌药新剂型等［３］；联合用药；降低ｍｄｒ－１基因及其产物Ｐ－ｇｐ的表达；增强ＭＤＲ细胞对抗肿瘤药物的敏感性等；其中下调ｍｄｒ－１基因及其产物Ｐ－ｇｐ的表达是最为成熟的方式。３．１下调细胞ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ和Ｐ－ｇｐ的表达或抑制Ｐ－ｇｐ的 功能 杨晓葵等［４］在检测卵巢癌细胞株Ａ２７８０及阿霉素耐药株Ａ２７８０／ＡＤＭ多药耐药基因（ｍｄｒ－１）及其编码的Ｐ糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）的表达时，发现ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ和Ｐ－ｇｐ表达明显下降的Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞对阿霉素（ＡＤＭ）的耐药性是Ａ２７８０细胞的８．４３倍，从而实现了在分子水平上逆转卵巢癌的多药耐药；魏虎来等［５］以多药耐药基因Ｐ－ｇｐ超表达的ｋ５６２／ＡＤＭ细胞为靶细胞，发现ｋ５６２／ＡＤＭ细胞对阿霉素呈高度耐药性，并与柔红霉素和鬼臼乙叉甙交叉耐药，但与ＣｓＡ无交叉耐药。ＣｓＡ和α－ＩＦＮ单独或联合应用均对Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞的耐药性有较强的抑制效应。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析发现α－ＩＦＮ和ＣｓＡ单独或联合均不能下调细胞 ｍｄｒｌ／Ｐ－ｇｐ的表达，反而应激性地刺激耐药细胞Ｐ－ｇｐ的合成增加，但可抑制Ｐ－ｇｐ的功能，增加Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞内阿霉素的积聚。因而可确定α－ＩＦＮ和ＣｓＡ联合可协同逆转耐药白血病细胞的耐药性，其作用机制为抑制Ｐ－ｇｐ的功能而非下调ｍｄｒｌ／Ｐ－ｇｐ的表达水平；姬汴生等［６］研究发现ＣＪＸ１能剂量相关性地增加Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞内罗丹明１２３（Ｒｈ１２３）的累计，明显抑制Ｐ－ｇｐ介导的Ｒｈ１２３外排，显著增强阿霉素对Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞的细胞毒作用，增加Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞内阿霉素水平，从而达到逆转阿霉素对Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞的多药耐 药性。 ３．２阿霉素新剂型的应用 刘晓波等［７］将人肝癌特异性阿霉素白蛋白免疫毫微粒通过抗体介导而特异性内化进入人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞 阿霉素耐药逆转研究 赵可新，王伟刚，沈国华，单靖珊，胡建平，高小曼（中国石油天然气集团公司中心医院，河北廊坊 ０６５０００） ［关键词］耐药逆转；阿霉素 ７

紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 姓名：张鑫淼班级：生工1301 一．实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。 了解细菌抗药性突变株的筛选方法 二．实验材料 菌株：大肠杆菌（Escherichia coli） 培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基 试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。 仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等 营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4 营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL 三．实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。 链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。 四．实验内容与操作步骤 （一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h； 3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。 （二）UV诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min； 2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；

淋巴瘤B细胞多药耐药细胞系的建立和耐药机制研究

淋巴瘤Ｂ细胞多药耐药细胞系的建立及耐药机制的研究 研究生：南开大学医学院９７级苏改秀 指导教师：杨纯正教授 摘要 目的：本研究针对人Ｂｕｒｋｉｔｔ淋巴瘤细胞Ｒａｊｉ细胞，建立对抗癌药物阿霉素（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，Ｄｏｘ）耐药的细胞株，分析其对于其它化疗药物是否存在交叉耐药，研究耐药的主要分子机制，并初步探讨抗ＣＤ２０单克隆抗体对耐药细胞的作用是否通过ｂｃｌ．２途径。 方法：Ｒａｊｉ细胞长期生长在阿霉素环境中，药物浓度随培养时间缓慢递增，逐步诱导细胞耐药；应用ＭＴｒ法检测其耐药倍数及耐药谱；血细胞计数法计算细胞倍增时间；流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡；ＲＴ－ＰＣＲ方法探讨产生耐药性的分子机制及抗ＣＢ２０单克隆抗体的逆转作用。 结果：建立了Ｒａｊｉ多药耐药细胞株，耐阿霉素倍数约为１０倍，对其它几种化疗药物存在交叉耐药，耐药倍数分别为：耐ＨＨＴ１１．５倍、耐ＶＰｌ６５６倍、耐ＶＣＲ６７．６倍、耐ＤＤＰ２．３倍；耐药细胞一般形态与敏感细胞无明显差异；细胞倍增时间与敏感细胞相比也未见明显差异，分别为耐药细胞１４．７１１，敏感细胞１４．４ｈ；细胞周期分布有所不同，耐药细胞ｓ期增高，提示其ＤＮＡ合成活跃；耐药细胞中编码多药耐药蛋白ＰｇＰ的多药耐药基因（Ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ１，ｍｄｒｌ）表达未见升高，雨编码多药耐药相关蛋白ＭＲＰ的多药耐药相关基因（Ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅ，ｍｒｐ）和抗凋亡基因ｂｃｌ－２的表达均升高，给予抗Ｃ０２０单克隆抗体Ｆ（ａｂ’）２片段处理４８小时后，ｂｃｌ－２表达未见明显下降。 结论：通过阿霉素诱导建立了一株多药耐药的人淋巴瘤细胞株，其耐药机制包括ｍｒｐ及ｂｃｌ一２的表达升高；扰ＣＤ２０单克隆抗体Ｖ（ａｂ’）２片段对于耐药细胞ｂｃｌ－２表达水平无明显影响，提示抗体作用可能通过ｂｅｌ．２以外的其它途径。 关键词：淋巴瘤多药耐药多药耐药相关基因ｂｃｌ一２ＣＤ２０

细菌耐药突变选择窗理论的研究与应用

?综　述? 细菌耐药突变选择窗理论的研究与应用 刘同华1,邢　茂13,宋光伟1,王　涵2 (1.第三军医大学新桥医院药剂科,重庆400037;2.重庆医科大学药学院药理学教研室,重庆400016) [摘　要]　突变选择窗理论是抗菌药物防耐药变异领域的一个新概念。本文围绕细菌耐药突变选择窗的理论,对其基本概 念、原理、与最低抑菌浓度(MIC )理论的区别,以及在抗菌药物治疗和新药研发中的应用作全面综述,并讨论其局限性。为临床上力求在控制感染的同时降低耐药突变菌株的选择性扩增提供了新的思路。 [关键词]　抗药性,细菌;突变选择窗;防突变浓度;诱变力试验 [中图分类号]　R 978.1 [文献标识码]　A [文章编号]　167122838(2009)0120009204 Study and application of the mutant selection window theory of bacterial resistance to antimicrobials L IU Tong 2hua 1,XIN G Mao 13,SON G Guang 2wei 1,WAN G Han 2(1.Department of Pharmacy ,Xinqiao Hospital ,Third Mili 2tary Medical University ,Chongqing 400037,China ;2.Department of Pharmacology ,School of Pharmacy ,Chongqing Medical University ,Chongqing 400016,China ) [ABSTRACT ]　Mutant selection window (MSW )hypothesis is a new concept in the domain of antibiotic 2resistant mutant pre 2vention.In this review ,the basic concepts ,principles of MSW ,difference f rom minimal inhibitory concentration (MIC )theory and application in antimicrobial treatment and the new medicine research are summarized.The limitation of MSW hypothesis is also discussed.This new theory offers opportunities for antimicrobial treatment and infection control while also restricting the emergence of antimicrobial resistance. [KE Y WOR DS]　drug 2resistance ,bacterial ;mutant selection window ;mutant prevention concentration ;mutagenicity test [Pharm Care &Res ,2009,9(1):9212] [基金项目]　重庆市自然科学基金计划项目(No.CSTC 2006BB5069) [作者简介]　刘同华(19662),男(汉族),副主任药师.E 2mail :yddxcq @https://www.wendangku.net/doc/b010213400.html, 3 通讯作者,E 2mail :xingmao1997@https://www.wendangku.net/doc/b010213400.html, 病原体在抗菌药物的选择压力下会不断发生耐 药性突变,以求“适者生存”。不合理应用或滥用抗菌药物会使细菌中的耐药突变亚群逐渐发展成为优势菌群,并迅速在细菌间传播。虽然人们从抗菌药物开发及治疗方面做了大量工作,但细菌耐药仍变得越来越严重。为了解细菌耐药产生的机制,Zhao 等[1]在大量实验基础上首先提出了防突变浓度(mutant p revention co ncent ration ,M PC )和突变选择窗(mutant selection window ,MSW )的概念,为在控制感染的同时降低耐药突变菌株的选择性扩增的可能,提供了新的思路。1　细菌耐药MSW 理论 1.1　定义　M PC 是指防止耐药突变株被选择性富 集所需的最低抗菌药物浓度,M PC 代表一个严格限 制耐药突变株选择的抗菌药物浓度阈值[2,3]。M PC 愈低,提示药物限制细菌耐药突变能力愈强。M PC 与最小抑菌浓度(minimal inhibitory concent ration ,M IC )之间的浓度范围定义为MSW ,如果抗菌药物浓度位于MSW 范围内,耐药突变菌株可被选择性富集扩增。MSW 越宽,越易出现细菌耐药,因此关闭或缩小MSW 将有助于防止耐药产生。M PC 和MSW 是对特定抗菌药物2病原体组合而言,因此同 一种抗菌药物对不同的病原体其M PC 和MSW 值 不同,不同抗菌药物对同一病原体的M PC 和MSW 值也不同[4]。M PC 与M IC 之比称为选择性指数(selection index ,SI ),SI 越小,MSW 越窄,抗菌药物抑制耐药突变菌株选择的能力越强。1.2　原理　M PC 和MSW 的概念源于对氟喹诺酮类药物(FQ )的实验研究[5,6]。实验表明,随着FQ 药物浓度逐渐增加,琼脂平板中细菌恢复生长的菌落数出现两次明显下降。第一次下降发生在M IC 99时,此时抗菌药抑制或杀死了野生型敏感菌的生长。随着药物浓度增加,在敏感菌株被抑制或杀死的同时,耐药突变菌株也被选择性富集,菌落数出现一个平台期;随着药物浓度进一步增加,菌落数出现第二次明显下降,直至药物浓度增高到某一限度时琼脂平板中没有菌落生长,表明这一浓度阻断了最不敏感的、单步耐药突变菌株的生长,该浓度即为M PC [7]。细菌发生耐药突变并在菌群中获得选 ? 9?刘同华,等1细菌耐药突变选择窗理论的研究与应用