高效液相色谱_荧光法测定小鼠脑组织中单胺递质及其相关物质
学报
Journal of China Pharmaceutical University2010，41（4）：367－371
高效液相色谱-荧光法测定小鼠脑组织中单胺递质及其相关物质
张璐璐1，冯芳1，2*，叶小敏1，朱杰1，马冯飞1
（中国药科大学1药物分析教研室；2药物质量与安全预警教育部重点实验室，南京210009）
摘要建立高效液相色谱-荧光分析方法，研究小鼠脑皮层、海马、纹状体、丘脑等不同部位的单胺类神经递质及其相关物质。脑组织样本经高氯酸沉淀蛋白后进行色谱分析，采用Lichrospher C
18
柱（250mm?4.6mm，5μm），流动相为pH 3.06缓冲液（含1mmol/L庚烷磺酸钠；30mmol/L磷酸二氢钠-磷酸溶液）-甲醇（85?15）；流速：1.0mL/min；柱温：35?。荧光检测：激发波长为280nm，发射波长为315nm。采用建立的方法，鉴别出小鼠脑中存在去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）、酪氨酸、色氨酸、3，4-二羟苯乙酸和5-羟吲哚乙酸等物质；对NE、DA和5-HT进行定量研究，确定它们的线性范围分别为2.4 471.0ng/mL（r=0.9996），2.6 519.5ng/mL（r=0.9994），2.4 469.3ng/mL（r= 0.9991），日内、日间RSD均小于9.0%，准确度达到限度要求，提取回收率大于90%。本法专属性好，准确度高，可以反映不同鼠脑区域单胺类神经递质及相关物质含量上的差异。
关键词高效液相色谱-荧光分析；单胺类神经递质；相关物质；脑组织
中图分类号R917文献标识码A文章编号1000－5048（2010）04－0367－05
Determination of monoamine neurotransmitters and related substances in mouse brain tissue by HPLC-FLD
ZHANG Lu-lu1，FENG Fang1，2*，YE Xiao-min1，ZHU Jie1，MA Feng-fei1
1Department of Pharmaceutical Analysis;2Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance(Ministry of Education)，China Pharmaceutical University，Nanjing210009，China
Abstract To establish an HPLC-FLD method for the investigation of monoamine neurotransmitters and related substances in mouse frontal cortex，hippocampus，striatum，and hypothalamus.Mouse brain samples were depro-
teinized by perchloric acid and analyzed.The separation was carried out on a Lichrospher C
18
column(250mm?4.6mm，5μm).The mobile phase was composed of pH3.06buffer(including1mmol/L heptanesulfonic acid
sodium salt，30mmol/L NaH
2PO
4
-H
3
PO
4
solution)and methanol in the ratio of85?15;the flow rate was1.0
mL/min and the column temperature was35?C.Fluorescence detection:the excitation and emission wavelengths
were set atλ
ex =280nm，λ
em
=315nm.Under the optimized conditions，norepinephrine(NE)，dopamine(DA)，
5-hydroxytryptamine(5-HT)，3，4-dihydroxy-phenyl acetic acid(DOPAC)，5-hydroxyindoleacetic acid(5-HIAA)，tyrosine(Tyr)，and tryptophan(Trp)in mouse brain were detected.NE，DA，and5-HT were quantified.The line-arity ranges of NE，DA，and5-HT were2.4-471.0ng/mL(r=0.9996)，2.6-519.5ng/mL(r=0.9994)，and 2.4-469.3ng/mL(r=0.9991)，respectively.The intra-and inter-day precision was always lower than9.0%．The accuracy could attain the demands and the absolute recovery values were always higher than90%．The pro-posed method has good specificity and accuracy.It could be used to analyze the content differences of monoamine neurotransmitters and related substances in different mouse brain areas.
Key words HPLC-FLD;monoamine neurotransmitter;related substances;brain tissue
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30973858)
763
*收稿日期2010-03-12*通讯作者Tel：025－83271301E-mail：fengfang1@https://www.wendangku.net/doc/b010337114.html,
基金项目国家自然科学基金资助项目（No.30973858）
学报Journal of China Pharmaceutical University第41卷
单胺神经递质，如去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）是中枢神经系统中非常重要的生物活性物质，它们的前体是酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp），酸性代谢产物有3，4-二羟苯乙酸（DOPAC）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）等。这些物质在正常生物体内存在动态平衡，参与中枢神经系统中多种生理过程。分析单胺递质及其相关物质可为多种疾病的诊断和治疗以及疾病机制的研究提供重要依据［1－4］。
高效液相色谱结合电化学检测（ECD）、荧光检测（FLD）及质谱检测是常用的分析单胺递质及其相关物质的方法，这些方法常与许多预处理技术结合，如衍生化和预浓缩。衍生化［5－7］过程复杂，可能引入许多未知的副产物；预浓缩技术［7］对不同物质选择性不同，同时分析这类物质较为困难，且处理大量样品比较费时。ECD的电极容易被污化［8－9］，噪声变高，且仪器不稳定。另外，采用其他方法（如电分析化学法），测定时易被体内共存物质干扰，灵敏度、选择性变差［10］，改进后的方法也很难同时测定较多此类物质［11－12］。如果采用毛细管电泳法分析，由于这些物质结构相似，电泳行为相似，各物质的保留时间不稳定，也难以同时进行分析［13］。因此，发展一种专属、稳定、简单的方法同时分析单胺递质及其相关物质非常必要。
1材料
1.1试剂
NE、DA、5-HT（纯度≥98%，中国药品生物制品检定所）；DOPAC、5-HIAA（纯度≥98%，美国Sigma公司）；Tyr、Trp（纯度＞99%，上海惠兴生化试剂有限公司）；庚烷磺酸钠（纯度≥98%，美国Janssen Chimica公司）；甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。
1.2仪器
LC-10Avp高效液相色谱仪、手动进样器、柱温箱、RF-10A
XL
荧光检测器（日本岛津公司）；浙江智达N2000色谱工作站；TGL-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；AB135-S电子天平（美国梅特勒-托利多公司）。
1.3动物
雄性ICR小鼠，体重22 25g，由南京医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（苏）2008-0004。饲养条件：室温（25?2）?，保持12h 昼夜节律，自由饮水进食，适应环境7d。
2方法
2.1色谱条件
色谱柱：Lichrospher C
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柱（250mm?4.6mm，5μm）；流动相：pH3.06缓冲液（含1mmol/L庚烷磺酸钠；30mmol/L磷酸二氢钠-磷酸溶液）-甲醇（85?15）；流速：1.0mL/min；柱温：35?；进样量：20μL。荧光检测：激发波长为280nm，发射波长为315nm。
2.2溶液的配制
提取液为0.1mol/L高氯酸溶液，含0.3mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA），用于鼠脑样本的制备。
精密称取NE、DA、5-HT适量，以提取液溶解。配制成含NE、DA和5-HT质量浓度分别为201.9，173.2，195.5μg/mL的储备液。另取NE、DA、5-HT、DOPAC、5-HIAA、Tyr和Trp适量，分别用提取液溶解，制成标准溶液，用于色谱图中物质的定性。
2.3脑组织样本溶液的制备
小鼠断头处死，将血放尽后，迅速取脑，分离皮层、海马、纹状体和丘脑，称重，匀浆。每100毫克组织中加入提取液700μL用于沉淀蛋白并且提取脑组织内容物，0?超声20min后，离心（16000r/min，10min）取上清液得脑组织提取物，放入冰柜－20?保存。另混合小鼠脑组织样本，同法制备，放入冰柜－20?保存，作为方法学确证时的空白基质。
色谱分析前，将脑组织提取物自冰柜中取出，15?解冻后，纹状体样本按体积比1?2立即加入30mmol/L磷酸二氢钠溶液；其他样本按体积比2?1立即加入90mmol/L磷酸二氢钠溶液。涡旋混匀后，离心（16000r/min，10min），取上清液进行HPLC分析。
2.4单胺递质混合标准溶液的配制
精密吸取NE、DA和5-HT储备液，加入适量空白基质制成混标储备液，用空白基质稀释混标储备液至9个浓度点，NE质量浓度由低到高依次为：2.4，4.7，9.4，23.6，58.9，117.8，235.5，376.8，471.0ng/mL；DA为：2.6，5.2，10.4，26.0，64.9，129.9，259.8，415.6，519.5ng/mL；5-HT为：2.4，
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第4期张璐璐等：高效液相色谱-荧光法测定小鼠脑组织中单胺递质及其相关物质
4.7，9.4，23.5，58.7，117．3，234．7，375．5，469.3ng/mL。
精密吸取NE、DA和5-HT储备液，加入适量空白基质制成混标储备液，用空白基质稀释混标储备液，使NE、DA和5-HT的质量浓度分别为403.7、433.0和391.1ng/mL。此样品作为高浓度的质控样品；将其稀释10倍及100倍的样品分别为中低浓度的质控样品，用于方法学评价。
2.5数据分析
不同脑区鼠脑样本的测定结果以平均值?样本平均数的标准误（x?SEM）表示。
3结果
3.1专属性考察
图1是鼠脑皮层样本及提取液的色谱图。通过与定位标准溶液比对，鉴别出脑中的NE、DA、5-HT、DOPAC、5-HIAA、Tyr和Trp，峰位如图标注所示。显然，各峰分离良好，内源性物质没有干扰；提取液进样后，在上述各物质出峰位置处也没有干扰。鼠脑的海马、纹状体、丘脑等部位的色谱图与皮层部位相似
。
Figure1Typical chromatograms of different samples by HPLC-FLD A：Mixed standard solution of NE，DA，5-HT，Tyr，Trp，DOPAC and5-HIAA；B：Mouse frontal cortex sample；C：Extracting solution
3.2标准曲线及线性范围
依次进样空白基质以及浓度由低到高的混合标准品溶液，将各浓度的样品扣除空白基质的色谱响应值后与对应的添加浓度进行回归分析。NE、DA、5-HT的回归方程、相关系数、线性范围及检测限如表1所示。结果显示，3个单胺递质的线性良好。Table1Regression equations and linear ranges of three monoamine neurotransmitters
Analyte Regression equation
Linear range/
（ng/mL）
r
NE y=24065x－9575 2.4-471.00.9996
DA y=27185x+21715 2.6-519.50.9994
5-HT y=52940x+78379 2.4-469.30.9991 NE：Norepinephrine，DA：Dopamine，5-HT：5-Hydroxytryptamine
3.3定量下限
以空白基质配制含NE、DA、5-HT的质量浓度分别为2.4，2.6，2.4ng/mL的混合标准样品5份，进行HPLC分析，记录色谱图和峰面积。每一样品各单胺递质色谱响应值扣除空白基质响应值后，代入当日随行标准曲线，计算样品浓度。3个物质在定量下限（LLOQ）处的准确度以x?s和相对误差（RE）表示。RE为各样品测得浓度与实际浓度的百分误差。精密度以RSD表示，结果如表2所示，定量下限符合限度要求。
Table2LLOQ determination for three monoamine neurotransmitters
Analyte
c/
（ng/mL）
Accuracy
x?s/（ng/mL）RE a/%
RSD/%
NE 2.4 2.31?0.12－2.3 5.0
DA 2.6 2.67?0.12 2.6 4.4
5-HT 2.4 2.37?0.110.8 4.9
a Relative error
3.4稳定性试验
配制低、中、高3种浓度的质控样品5份，取其中1份室温避光放置（25?），分别于0，40，80，120min进行HPLC分析考察其放样稳定性。其余4份低、中、高浓度的质控样品，放入冰柜－20?储存，于第0，5，10，15天各取出1份放置室温后进行HPLC分析，考察其冰冻稳定性。结果表明NE、DA 和5-HT在室温条件下避光放置2h内稳定，在－20?贮存条件下15d内稳定。
3.5日内和日间精密度
配制低、中、高3种浓度的质控样品，每个浓度各5份，每天做1批，连续测定3批，记录色谱图和峰面积。各单胺递质色谱响应值扣除空白基质响应值后，代入当日随行标准曲线，计算质控样品浓度。精密度以实际测得量的相对标准偏差（RSD）表示，计算日内RSD和日间RSD。结果如表3所示，3个物质低、中、高浓度的日内RSD均小于5.0%，日间RSD均小于9.0%，符合限度要求。
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学报Journal of China Pharmaceutical University第41卷
Table3Intra-day and inter-day precision for the monoamine neuro-
transmitters at three different concentrations
Analyte c/（ng/mL）Intra-day RSD/
（%，n=5）
Inter-day RSD/
（%，n=15）
NE 4.0 4.18.8
40.4 2.6 5.1
403.7 3.3 5.9 DA 4.3 3.98.2
43.3 2.5 4.9
433.0 4.0 6.6 5-HT 3.9 4.28.9
39.1 2.7 5.3
391.1 4.47.23.6准确度和提取回收率
配制低中高3种浓度的质控样品，每种浓度各5份，进行HPLC分析，记录色谱图和峰面积。各单胺递质色谱响应值扣除空白基质响应值后，代入当日随行标准曲线，计算质控样品浓度。准确度以x?s和相对误差（RE）表示。另用提取液配制低中高3种浓度的标准溶液，同法测定。将质控样品的峰面积与未经提取处理的相应浓度的标准溶液的峰面积比较，计算提取回收率，即绝对回收率（absolute recovery）。准确度和提取回收率的结果如表4所示。
Table4Accuracy and absolute recovery for three monoamine neurotransmitters at three different concentrations（x?s，n=5）Analyte c/（ng/mL）Accuracy/（ng/mL）RE/%Absolute recovery/% NE 4.0 3.83?0.12－5.395.17?3.46
40.439.41?0.65－2.497.88?1.65
403.7386.71?12.70－4.296.22?3.17 DA 4.3 3.97?0.11－8.493.34?1.98
43.341.84?0.79－3.494.18?1.72
433.0416.46?12.20－3.895.78?2.80
5-HT 3.9 3.56?0.05－8.998.23?0.98
39.137.93?0.72－3.0100.51?1.84
391.1370.80?9.97－5.298.07?2.63
3.7样品含量测定
用本法测定10只小鼠脑皮层、海马、纹状体、丘脑部位NE、DA和5-HT含量。结果显示，不同部位单胺递质含量差异较大，尤其对于DA；海马样本未检出DA（表5）。本方法测定单胺递质在不同脑区的含量线性范围良好。
Table5Contents of three monoamine neurotransmitters in different mouse brain regions（x?SEM，n=10）
Brain area
Analyte content/（ng/g）
NE DA5-HT
Frontal cortex128.0?11.4282.4?40.1349.7?37.1 Hippocampus236.1?6.1－574.3?25.7 Hypothalamus330.7?24.0194.8?24.6644.5?37.0 Striatum135.5?14.55383.2?139.7754.5?55.6
4讨论
4.1检测方法的选择
实验初期，曾尝试分别用ECD和FLD分析单胺及相关物质以选择适合的检测器。结果显示，ECD背景较高且基线波动较大，原因可能是其电极在分析过程中参与氧化还原反应，反应产物累积在电极表面使得检测灵敏度降低，低浓度分析物难以检出。为解决这一问题，需要采取措施除去电极表面的累积产物和分析系统中的氧化性物质，操作比较复杂。相对而言，FLD受干扰因素较少，基线平稳，处理过程简单，检测灵敏度可达到实验对象的要求，因此最终选择FLD作为后续条件摸索的检测手段。
4.2色谱条件的选择
选择280nm为激发波长和315nm为发射波长是因为单胺递质及其相关物质在这对波长下有较强的荧光响应。
单胺递质含有支链氨基，极性较大，在C
18
柱上保留时间短，分离困难。因此，流动相中添加庚烷磺酸钠，在一定pH色谱体系中与单胺递质结合，增强保留，改善分离。磷酸二氢钠作为控制流动相
073
第4期张璐璐等：高效液相色谱-荧光法测定小鼠脑组织中单胺递质及其相关物质
pH的缓冲盐的基本组成，试验表明30mmol/L磷酸二氢钠溶液既具备足够的缓冲能力又不会由于太高的缓冲盐含量而对色谱系统造成污染。
流动相的pH是离子对色谱分离的关键因素。实验发现流动相pH在3左右时色谱分离较好，故选择在pH2.90 3.20间隔0.08研究流动相酸度对色谱分离的影响。结果显示NE、DA、DOPAC、5-HIAA和5-HT在这一pH范围内保留时间较为稳定，而Tyr和Trp的保留时间随着流动相酸度的增加而增加。这一现象可从这些物质的结构上解释：单胺递质，在此pH范围以结合的离子对形式存在；DOPAC和5-HIAA均含羧基，在此范围以分子原型存在；Tyr和Trp是两性化合物，在此范围容易随pH 的变化改变其存在形式。当pH小于2.98时，DOPAC与NE的分离度不佳；当pH为3.06时，绝大多数物质可达到基线分离；pH大于3.14时，NE 和DA不能完全分离，因此选择流动相pH为3.06。
4.3脑组织样本制备
脑组织采用0.1mol/L高氯酸溶液沉淀蛋白，溶液中加入0.3mmol/L EDTA对组织中的金属离子进行络合，防止其加速单胺递质氧化。由于脑组织提取物存在于强酸性环境中，若不处理进样，就可能由于其酸度与流动相不一致而导致色谱体系不稳定、峰位漂移。有两种方法可供选择用以稳定色谱系统，保证样本溶液和流动相的一致性：一是增加流动相中缓冲盐的量以增大缓冲能力，但是这样色谱体系容易受到污染；二是降低进样溶液的酸度。本研究曾尝试分别用氢氧化钠中和以及磷酸二氢钠缓冲以调节提取物的酸度，但是由于不同小鼠及不同脑区碱性物质含量不同，难以找到氢氧化钠加入量的规律性。经过试验，当选择30mmol/L磷酸二氢钠溶液以体积比2?1加于纹状体提取物、90mmol/L 磷酸二氢钠溶液以体积比1?2加于皮层、海马和丘脑提取物中时，可以保证进样稳定、重现和峰形对称，该方法简单且适用于各种脑组织样本。
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173
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
通则0512高效液相色谱法
高效液相色谱法： 系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测， 由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。 色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。 超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、 高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱： 以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱： 用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶 和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。 （2）检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器， 其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器， 其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关； 蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器， 对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一 定范围内呈线性关系， 但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。 紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外－可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求； 采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。 蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相
高效液相色谱分析原理及流程
高效液相色谱分析原理及流程 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。 高效液相色谱分析原理 (一)高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等
高效液相色谱法的分类及原理
高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。 对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。
高效液相色谱仪常用检测器的种类及分析
高效液相色谱仪常用检测器的种类及分析检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供 检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。 1.紫外可见吸收检测器(ultraviolet－visibledetector，UVD) 紫外可见吸收检测器(UVD)是HPLC中应用最广泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有流动地的紫外可见光度计。 (1)紫外吸收检测器 紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽 (190nm～800nm)。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。
局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。 (2)光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetector，PDAD) 也称快速扫描紫外可见分光检测器，是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(l)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。 单光束二极管阵列检测器，光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号学的方法快速扫描提取出来，每幅图象仅需要10ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。 2．荧光检测器(fluorescencedetector，FD) 荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0.1ng／ml，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测
小鼠灌注取脑
成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤 实验步骤： 1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。 2、将注射针头插入小鼠左心室，同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。灌注生理盐水，时间维持在1min（10~20ml）灌注液左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。 3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用4%PFA灌流固定，当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为5min。（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联） 4、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。 取脑及脱水：
1、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。 2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。 3、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。 4、将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。 5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片。
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC） 一、方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法
其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC） 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分
配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 （1）固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 （2）流动相（淋洗液） 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱 性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏 度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱 效）和适当低的沸点。
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式： 式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度；Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。 a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。
取小鼠脑组织
丁香园上面总结得方法,排版有点乱、 其实过程与大鼠近似,我得经验就是:?1。材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等;?2。步骤:处死小鼠,取头颅; 剪开皮肤,漏出颅骨;?用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线;?再 用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨; 当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜与血管;?然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。 3。注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部;?用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部;?去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑;?取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高;?若留病理,建议一定要取完整无损得大脑。 做免疫组化得话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定得好,就需要先灌注。?先麻醉小鼠?剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来得水清亮了?再改用固定液(一般就是４%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了,我做得25～3５g得小鼠一般用50mLNＳ+3０mL多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好得生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺与肝得颜色都变成灰白色即可、然后用多聚甲醛灌流,针孔最好就是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下:?实验操作步骤:?1) 小鼠称重,以每克小鼠０、00２5ｍl 4％戊巴比妥钠剂量得实施腹腔麻醉、也可以用10％得水合氯醛,3－5ｕl/g腹腔注射麻醉。?２) 将麻醉得小鼠仰放在操作台上,去毛、 3) 解剖小鼠,暴露心脏。 4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约 0.5cｍ(最好就是用小点得针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳、? ５) 将灌流器得导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出得液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器得用注射器或者吊瓶都可以。?6) 将灌流器得导管小心得移至4%多聚甲醛或２、5%戊二醛中,注意不要产生气泡,开始灌流。此时如果瞧到小鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。 7) 灌流大约5分钟,灌流液用量约150毫升左右结束、(小鼠得用量没这么多)?８) 取材、取实验所需得标本、 ９) 将取出得材料放到事先准备得多聚甲醛(戊二醛)中固定2—-4小时后移至3０%蔗糖中4度冰箱保存过夜。
高效液相色谱法基本原理
高效液相色谱法基本原理 一、实验目的 1. 了解高效液相色谱法分离的基本原理； 2. 了解高效液相色谱仪的基本构造； 3. 了解高效液相色谱仪的基本操作。 二、基本原理 高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。 高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。 高效液相色谱分析原理： （一）高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 （二）高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 开始样品加在柱头上，假设样品中含有３个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分Ｃ在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分Ｂ的分配系数介于Ａ，Ｃ之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。 三、系统构成 1.主机：Waters Allance 2695高效液相色谱仪,分为①分离单元Allance2695；②紫外－可见检测器2487；③荧光检测器2474；④示差折光检测器2414。 2.操作控制系统：DELL Dimmsen 4550微机；Waters Millunnium32 V4.0 色谱管理器软件。 3.打印机：HP LaserJet 1000激光打印机。 四、实验步骤 1. 系统开机准备 （1）接通电源。
取小鼠脑组织0001
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。 先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液(一般是4%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25?35g的小鼠一般用50mLNS+30m多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h 后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g 腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm （最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5）将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。 6）将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，注意不要产生气泡，开始灌流。此时如果看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，说明达到固定效果。 7）灌流大约5 分钟，灌流液用量约150毫升左右结束。（小鼠的用量没这么多） 8）取材。取实验所需的标本。 9）将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛（戊二醛）中固定2——4 小时后移至30%蔗糖中4 度冰箱保存过夜。
高效液相色谱仪常用检测器的种类及分析
高效液相色谱仪常用检测器的种类及分析检测器的作用就是将柱流出物中样品组成与含量的变化转化为可 供检测的信号,常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。 1、紫外可见吸收检测器(ultraviolet－ visibledetector,UVD) 紫外可见吸收检测器(UVD)就是HPLC中应用最广泛的检测器之一,几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点就是灵敏度较高,线性范围宽,噪声低,适用于梯度洗脱,对强吸收物质检测限可达1ng,检测后不破坏样品,可用于制备,并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似,实际上就就是装有流动地的紫外可见光度计。 (1)紫外吸收检测器 紫外吸收检测器常用氘灯作光源,氘灯则发射出紫外-可见区 范围的连续波长,并安装一个光栅型单色器,其波长选择范围宽 (190nm～800nm)。它有两个流通池,一个作参比,一个作测量用,光源发出的紫外光照射到流通池上,若两流通池都通过纯的均匀溶剂,则它们 在紫外波长下几乎无吸收,光电管上接受到的辐射强度相等,无信号输出。当组分进入测量池时,吸收一定的紫外光,使两光电管接受到的辐射强度不等,这时有信号输出,输出信号大小与组分浓度有关。
局限:流动相的选择受到一定限制,即具有一定紫外吸收的溶 剂不能做流动相,每种溶剂都有截止波长,当小于该截止波长的紫外光 通过溶剂时,溶剂的透光率降至10%以下,因此,紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。 (2)光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetector,PDAD) 也称快速扫描紫外可见分光检测器,就是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件,构成多通道并行工作,同时检测由光栅分光,再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号,然 后对二极管阵列快速扫描采集数据,得到吸收值(A)就是保留时间(tR) 与波长(l)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据,从而迅速决定具有最佳选择性与灵敏度的波长。 单光束二极管阵列检测器,光源发出的光先通过检测池,透射 光由全息光栅色散成多色光,射到阵列元件上,使所有波长的光在接收 器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号学的方法快速扫描提取出来,每幅图象仅需要10ms,远远超过色谱流出峰的速度,因此可随峰扫描。 2.荧光检测器(fluorescencedetector,FD) 荧光检测器就是 一种高灵敏度、有选择性的检测器,可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物,再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0、1ng／ml,适用于痕量分析;一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级,但其线性范围不如紫外检测
液相色谱原理
高效液相色谱分析原理 2009年05月12日星期二 17:46 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于１００ｕｍ的吸附剂（硅胶、氧化铝等）。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小（５ｕｍ-１０ｕｍ）、传质快、柱效高。 高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是２０世纪６０年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有８０％的有机化合物可以用ＨＰＬＣ来分析测定。高效液相色谱分析原理（一）高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度， 而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（二）高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 开始样品加在柱头上，假设样品中含有３个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分Ｃ在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分Ｂ的分配系数介于Ａ，Ｃ之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。高效液相色谱的类型（一）吸附色谱 在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位
石蜡包埋(小鼠脑组织)
石蜡包埋 放入4%的多聚甲醛中过夜（12h）； 12小时（注意水流不需要太大，不可将水流直接冲击组织） 60%酒精4h白天（或者60%酒精4℃过夜12h）→ 第三天：→70%酒精4h→80%酒精4h→90%酒精4h→95%酒精4℃过夜(不一定12小时) → 第四天：→100%酒精Ⅰ2h→100%酒精Ⅱ2h→100%酒精Ⅲ2h→ 5+3 min→二甲苯Ⅱ5+3 min→二甲苯Ⅲ 5+3 min→二甲苯Ⅳ 3+2 min→ （此处注意，在透明过程进行到此处时，应在浸完后拿出脑组织观察一下透明是否彻底，一般来说透明完全的脑组织是呈现为一个通体琥珀状，如果是发现脑组织内部仍呈现不通透的白色则继续酌情追加浸泡（透明）时间） 2h→软蜡Ⅱ2h→软蜡Ⅲ 2h→ 备注：1、软蜡是指熔点48-50℃的石蜡，中蜡是指熔点58—60℃的石蜡。在包埋前应该提前将各种蜡准备好，放在对应的蜡缸里融好，注意不要加热太长时间。待蜡完全融好后关
上煤气，冷却至烧杯上沿不是太烫手且蜡也未凝固是将蜡挪到６０℃温箱里备用。在融蜡时要注意通风橱使用规范。 2、包埋组织块时要注意动作熟练紧凑，时间过长就会导致蜡温不够，影响包蜡质量。放组织块时要注意切面一定要放正确，待切的面朝向包埋铁框面。包埋时勿将气泡带入。可以稍微倾斜一些放置塑料包埋框。 3、酒精串缸结束后，可以将组织拿出一部分出来观察一下是否切面平整，是否厚薄一致，以免影响透明的整齐度，导致组织透明的时间不一致。 ４、酒精串缸结束后，把包埋盒用滤纸尽量弄干，然后再往二甲苯中放。 5蜡块包埋完成后不要急于挪动，待蜡块凝固后再将蜡块放到－２０℃冰箱里冷藏10ｍｉｎ，以利于将铁框和包埋盒分离。
比较气相色谱法与高效液相色谱法分离原理、仪器构造及应用范围的不同点
比较气相色谱法与高效液相色谱法分离原理、仪器构造及应用范围的不同点。 一、分离原理： 1.气相：气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相间分配系数（溶解度）的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分离。 2.液相：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 二、应用范围： 1.气相：气相色谱法具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或裂解法。 2.液相：高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 三、仪器构造： 1.气相：由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。 1.1 柱箱：色谱柱是气相色谱仪的心脏，样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离，从而达到分析的目的，柱箱的作用就是安装色谱柱。 由于色谱柱的两端分别连接进样器和检测器，因此进样器和检测器的下端（接头）均插入柱箱。 柱箱能够安装各种填充柱和毛细管柱，并且操作方便。 色谱柱（样品）需要在一定的温度条件下工作，因此采用微机对柱箱进行温度控制。并且由于设计合理，柱箱内的梯度很小。 对于一些成份复杂、沸程较宽的样品，柱箱还可进行三阶程序升温控制。且程序设定后自动运行无需人工干预，降温时还能自动后开门排热。 1.2 进样器： 进样器的作用是将样品送入色谱柱。如果是液体样品，进样器还必须将其汽化，因此采用微机对进样器进行温度控制。 根据不同种类的色谱柱及不同的进样方式，共有五种进样器可供 选择： 1.填充柱进样器 2.毛细管不分流进样器附件 3.毛细管分流进样器附件 4.毛细管分流/不分流进样器 5.六通阀气体进样器 1.3检测器:
取小鼠脑组织完整版
取小鼠脑组织 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1.?材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2.?步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3.?注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。 先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1)??小鼠称重，以每克小鼠 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2)??将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3)??解剖小鼠，暴露心脏。 4)??找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。
神经实验5 小鼠脑片免疫组织化学
实验5 小鼠脑片免疫组织化学（SABC法） 实验 一、实验目的 了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验 操作步骤。 二、实验原理 免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。免疫组织化学的显著特点是特异性强，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体“一对一”的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
敏感性高：在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反应(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。 三、实验器材 略 四、实验步骤 1. 载玻片准备 将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的酒精中浸泡24h，擦干。盖玻片直接泡酸，其余处理步骤同载玻片。处理后的载玻片用稀释度为