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EBV潜伏膜蛋白LMP2A的研究进展

EBV潜伏膜蛋白LMP2A的研究进展

朱伟综述罗兵审校

【摘要】EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBv)与多种人类恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌(nas0.pharyllgealcarcinoma,NPC)、何杰金氏病(H0dgkin’sdisease,HD)等的发生有关,肿瘤组织中EBV主要以潜伏感染的形式存在。在EBv潜伏感染细胞中,可表达的EBv基因有10多种,包括EBv核抗原(EBnuclearantigen,EBNA)1,2,3A,3B,3C和LP;潜伏膜蛋白(1atentmembraneprotein,LMP)1,2A和2B;EBV编码的小RNA(EBER)1和2;以及BamHI.A向右开放读码框(BARF0)的转录产物。NPC和其他EBv相关恶性肿瘤中可持续检测到LMP2A的转录物,提示LMP2A在体内病毒持续感染和EBV相关疾病中可能有重要作用。

1.LMP2A基因和蛋白结构

LMP2A由2.3KbmRNA编码,起始于EBV线性基因组的第166607位核苷酸,由U5区的1个外显子和U1区的8个外显子组成…。除5’端第1个外显子不同外,LMP2A和LMP2B共享位于3’端的其余8个外显子。LMP2A特异的exonl编码LMP2A胞浆内的N末端,LMP2B编码基因eXonl不翻译,因此LMP2B缺失胞浆内N末端。

LMP2A蛋白分子量为54kDa,由497个氨基酸组成,包括12个高度疏水的跨膜功能区,与N端119个氨基酸和C端28个氨基酸共同组成完整的LMP2A分子,其结构见图1。LMP2AN端和C端均在细胞质内,N一末端区包括8个酪氨酸残基,其中两个形成免疫受体酪氨酸基序旧’31。LMP2A与Src家族酪氨酸蛋白激酶(ProteinTyrosineKinases,PTKs)和Syk家族PTK结合使N一末端区酪氨酸磷酸化,磷酸化的酪氨酸为含有SH2结构域的细胞蛋白提供结合位点,含有SH2结构域的细胞蛋白通常属于信号转导蛋白。SH2结构域由约100个氨基酸组成,是非催化功能区,保存细胞质信号分子,SH2结构域可与磷酸化的酪氨酸基序结合,进而介导信号分子与含磷酸酪氨酸的蛋白分子相互作用,这种作用有赖于酪氨酸残基的磷酸化及其周围氨基酸残基所构成的基序。

2.LMP2A分子的功能序列

LMP2A是磷酸化膜蛋白,位于细胞浆内的N端有8个酪氨酸分别与其下游的氨基酸组成功能序列。其丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基均为磷酸化形

作者单位:272013山东济宁济宁医学院式,特别是74位和85位的酪氨酸形成一个具ITAM(免疫受体酪氨酸活化基序)功能的特征性序列[(YXxL/I)]2,能与含有SH2结构域的Syk、Lyn、Fyn酪氨酸激酶结合H]。单拷贝的[(YXxL/I)]2信号表达即可激活B细胞或T细胞信号传导途径,进而引发一系列细胞内的信号传导。位于LMP2A112位的酪氨酸能与Src家族酪氨酸激酶Lyn的SH2结构域结合,从而导致LMP2AN端的其他酪氨酸磷酸化,促进Src磷酸激酶与LMP2A的ITAM结合。

Sch01le等b3采用LMP2A缺失和点突变的方法分别删除LMP2A基因的21~36位,2164位,21~85位和80~112位的碱基,钙沉淀法转染293细胞。对上皮细胞内外LMP2A磷酸化状态以及LMP2A对上皮细胞信号传导途径的潜在影响进行了研究,结果显示缺失和点突变的LMP2A基因在293细胞中呈短暂的表达,LMP2A的磷酸化与体内一致。体外LMP2A磷酸化依赖于112位酪氨酸,尽管体内LMP2AITAM基序突变能减弱LMP2磷酸化作用,但是单一酪氨酸突变不足以消除LMP2A磷酸化。同时观察到,虽然被纤维结合素刺激的细胞提取物中LMP2A处于高水平磷酸化,但体外激酶测定刺激和未刺激的细胞LMP2A磷酸化水平没有差别,显示体外细胞外基质(extra.cellularmatrix,ECM)介导的LMP2A磷酸化作用调节丧失。在LMP2A存在时,分子量为70和80kDa的几种蛋白酪氨酸磷酸化,这种细胞蛋白磷酸化作用增强依赖于LMP2AITAM基序,揭示IT√址嗄可能参与上皮细胞的信号传导过程。

LMP2A可影响体外B细胞信号转导和抑制病毒再活化,在体内提供B细胞生存和增殖的信号;

LMP2A相关蛋白的识别对于阐明LMP2A调节B细胞信号传导和EBV潜伏有重要作用。LMP2A氨基末端一系列保守的脯氨酸富集基序能够潜在介导细胞蛋白的相互影响,可能在EBV的潜伏和/或转化中发挥重要作用哺】。LMP2A氨基末端区有5个脯氨酸富集区,其中3个具有与SH3结构域相互作用的PxxP核心共有序列,以及2个与I型WW功能区相互作用的PPxY核心共有序列(PY基序)。研究证明,AIP4、WwP2/AIP2和Nedd4等4种细胞蛋白可与LMP2A氨基末端功能区的两个PPPPY(PY)基序特异性结合,两种PY基序突变可导致LMP2A与以上蛋白结合活性丧失。此外在表达LMP2A的细胞中,还可观察到Lyn水平减少以及LMP2A和Lyn快速更新。这些发现提示,LMP2A募集Nedd4样泛素蛋白连接酶和B细胞信号转导分子,导致LMP2A和Lyn通过泛素依赖机制降解,为LMP2A调节B细胞信号转导提供了一个新的途径‘7】。

EBV阳性LCLs中LMP2A两个PY基序的缺失可影响AIP4与LMP2A的结合,导致Lyn表达增加、LMP2A高磷酸化以及一种未知的分子量为120一kDa蛋白表达增加;此外,Syk的磷酸化作用增强和60.kDa未知蛋白中度增加。LMP2A分子的PY基序在EBV阳性LCLS中可能通过Nedd4E3s泛素蛋白降解Lyn,调节Lyn磷酸化作用的活性;尽管PY基序突变的LCLs和野生性LcLs不同,但在诱导酪氨酸磷酸化作用和BZLFl表达时,PY基序突变仍可抑制BCR信号转导∞J。

LMP2A的PPPPY基序可与多种Nedd4家族E3蛋白泛素连接酶(E3s)的wW功能区结合,在体内可增强Lyn和Syk泛素化依赖Nedd4家族成员的活性,并与Lyn酪氨酸激酶的不稳定相关。上述结果提示LMP2A作为一个分子支架募集B细胞酪氨酸激酶和C2/Ww/Hect功能区E3s,从而可能促进Lyn和Syk迅速泛素化,阻止B细胞信号转导。

圈1LMP2A氨基末靖结构组成

3.LMP2A与肿瘤的关系

EBv潜伏感染的外周血B细胞中可检测到LMP2A表达,U订P2A是静止B细胞中唯一可检测

到的EBv潜伏期基因表达产物。EBV阳性鼻咽癌、咖及外周血T细胞淋巴瘤等恶性肿瘤细胞中也可检测到LMP2A表达,提示LMP2A参与EBV在淋巴细胞中的长期潜伏,并且可能在恶性肿瘤的发生发展中起一定作用。LMP2A并无体外转化B细胞的作用,但能抑制细胞分化旧】。Frank等n们报道。LMP2A转染人角质化细胞株HaCaT后,能使细胞增殖及转化,并可在裸鼠中形成肿瘤。

Portis等uu对来自LMP2A转基因鼠的初级B细胞、表达LMP2A的人B细胞系、LMP2A阳性和阴性EBV感染的淋巴母细胞系(LCLS)基因转录物进行分析,证明LMP2A可增强细胞周期诱导和凋亡抑制等相关基因的表达,改变DNA和RNA新陈代谢相关基因表达,减少B细胞特异性因子和免疫相关基因的表达。另外,LMP2A诱导的许多基因表达的改变与霍奇金淋巴瘤的HRS(Hodgki吖Reed.Stemberg)细胞以及活化的增生细胞生发中心细胞相似,表明LMP2A表达可诱导并保持EBV感染B细胞活化的增生状态,最终导致霍奇金淋巴瘤的发生。

EBV潜伏膜蛋白LMP2A的研究进展

EBV相关恶性肿瘤表现出不同形式的病毒潜

伏基因表达,反映了病毒与宿主细胞之间复杂的相互关系。Stewart等n21采用野生型重组EBV(rE.BV)或LMP2A删除的突变型EBV(rEBV.2A)体外感染人胃癌细胞系AGS和EBV阳性NPC细胞系C666.1,在rEBV感染的癌细胞中持续观察到LMP2A表达而LMPl阴性。然而,rEBV一2A感染的癌细胞表达高水平的LMPl,LMPl的表达由信号传导和转录活化因子(thesignaltransducerandactivatoroftranscription,STAT)调节的L1.TR启动子调控。与这个结果一致,STAT活性在rEBV感染的癌细胞下降,这种抑制在LMP2A缺失时缓解,S仉盯活性的调节与LMP2A抑制癌细胞系IL一6的自分泌能力相关。通过激活rEBV感染的癌细胞系和EBV阳性NPC细胞系C666.1中的STAT,外源IL,6能够诱导LMPl表达。LMP2A介导的IL.6抑制是NF.kapp出抑制的结果,提示LMP2A通过调节癌细胞中Sn气T和NF.kappaB两个关键转录因子途径,在EBV相关肿瘤的发病机制中发挥重要作用。

4.LMP2A与免疫治疗

采用免疫学方法治疗EBV相关肿瘤近年来倍受关注,LMP2A本身不是转化基因,但在EBV潜伏感染及转化细胞过程中发挥重要作用。在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中都能够检测出LMP2A,并且是鼻咽癌、淋巴癌等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一,具有潜在的T细胞激活表位,能介导杀伤性T细胞发挥作用。因此越来越多的研究表明,LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原。

DCs是诱导特异性T细胞免疫最强大的抗原递呈细胞,在机体抗肿瘤反应中发挥重要作用。用携带LMP2ARNA的质粒pGEM7转染DC,可诱导特异性cTL,对eTL组分进行研究发现主要由CD4+T细胞组成(占59.2±15.8%)及小部分CD8+T细胞组成,而不同于LCL诱导的CTL【”]。CD4+和CD8+T细胞都能产生杀伤作用,说明该法诱导CTL同时存在MHCI及MHCII类分子限制性抗原递呈途径,且CD4+和CD8+T细胞相互影响,有助于长时间维持对LMP2A抗原的免疫记忆性。Gahn【143和Ranier[1鲥等将携带LMP2A基因和LMP2B基因的腺病毒转染DC,结果显示转染后对DC表型以及DC多种功能没有任何影响,但都能诱导特异性CTL,该方法可作为临床治疗EBV相关肿瘤治疗的一种策略。

采用阳离子脂质体将LMP2ARNA转染自体同源的抗原递呈细胞,可在体外诱导产生LMP2A特异性CTL【16]。脂质体可增强DC转染效率,保护LMP2ARNA不被细胞内RNA酶降解:转染的DCs具有更强的刺激自身同源性T细胞增殖的能力。LMP2A+DCs作为LMP2A特异性效应细胞,刺激产生的主要是CTL和辅助性CD4+T细胞。研究CD4+T细胞为何能够溶解表达LMP2A的靶目标的分子机制发现,虽然表达的Fas配体位于细胞表面,但是LMP2A特异性CD4+效应细胞可利用Ca2+依赖的穿孔素/颗粒酶途径杀伤靶目标,与CD8+CTLs的效应机制相同。用rILl2或rILl5刺激体外培养的LMP2A+DC细胞,可迅速促进LMP2A特异性CTL产生,LMP2A特异性CTL量明显增多,因此可应用这种方法治疗EBV相关疾病‘17|。

LMP2A表达可改变Src家族Syk蛋白酪氨酸激酶、Btk蛋白酪氨酸激酶以及P13激酶活性,研究表明只有Syk蛋白酪氨酸激酶的抑制剂能特异性影响LMP2A阳性细胞而不影响正常宿主细胞,这对以LMP2A为靶点,治疗和根除EBV潜伏感染以及EBv相关增生疾病的新型治疗方法提供了理论依据㈨。

Su等H州为在体外诱导LMP2A特异性CTL的产生,利用阳离子脂质体DOn垤将LMP2ARNA转染在无血清培养基中生长的自体成熟DC细胞。这种转染方法不影响DC免疫表型,并能表达高水平HLA.I和Ⅱ以及关键性的协同刺激分子。与无关RNA转染的DC相比,这些LMP2A+DC在自体混合的淋巴细胞反应中显示高度地免疫刺激性,能够刺激产生LMP2A特异性CD8+和CD4+CTL。利用这种DC系统也可以恢复EBV血清反应阳性的患者LMP2A特异性的记忆,达到免疫治疗的目的。

5.结语

随着对LMP2A研究的深入,LMP2A与EBV潜伏感染、信号转导以及肿瘤的发生等相关性有了进一步阐明,LMP2A是EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原。尽管EBV相关肿瘤病因学中EBV的确切作用并不十分清楚,但肿瘤细胞中EB病毒的存在,为开展EBV相关肿瘤的免疫治疗提供了靶点。

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一些病毒感染对宿主肥胖的影响

朱海鹏高志良

(收藕日期:2006—08-02)

【摘要l近年来,人类社会中肥胖者在不断增多。导致肥胖的病因很多,感染因素是一个易被忽

视的病因,其中一些病毒感染对宿主肥胖具有明显的影响。本文就一些病毒对宿主肥胖的影响作一

个概述。

【关■词】病毒;肥胖

当今世界,人类肥胖者的出现率越来越高,而且与肥胖相关疾病的发病率也越来越高,肥胖已经成为影响人们健康的一个常见的因素了。导致肥胖的原因很多,其中影响肥胖的基因和行为因素在研究中最受重视,但感染因素作为肥胖的一个发病因子却一直以来都被忽视。而微生物感染在自然界无处不在,人体是很多微生物的宿主,其中各种病毒的急性慢性感染尤为多见。本文就一些病毒感染导致宿主肥胖的研究进展作一个概述。

1.腺病毒36型

1.1腺病毒36型对动物肥胖的影响

腺病毒是一种裸DNA病毒,20面体结构,直径作者单位:510630广州中山大学附属第三医院为65~80m。在人类中,腺病毒经常导致急性上呼吸道感染,它们也可以导致肠炎和结膜炎。腺病

毒36型(adenovirus-36,Ad.36)不与其它型的人类腺病毒相互作用,具有抗原独特性。Dhurandhar等人将Ad.36接种到小鸡和小鼠上,结果显示:饲养一段时间后,接种Ad.36的动物出现显著的脂肪组织增加、低血清胆固醇和甘油三酯u。。随后,他们还发现,将接种Ad.36小鸡的血清注射到正常小鸡上,能够导致正常小鸡出现内脏脂肪量增高、血清胆固醇的显著减少。这些资料证实了通过输血传播Ad.36可以导致宿主肥胖【21Kapila等人将32只金黄色叙利亚鼠分成体重相匹配的两组,一组在围产期内接种Ad一36,一组接种没有Ad.36的细胞培养液作为对照组,接种后5周处死动物。结果显示:使用巢式PCR技术,在感染动物的肺、肝脏、脂肪组织和骨骼