CLIACAP 二代测序临床检测标准操作指南

2015-04-23自由度

本临床二代测序操作指南来自于Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988/College of American Pathologists (CAP) laboratory。

释义：Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988：美国临

床实验室改进修正法规’88 。这个法规里面有关于医学检验项目的一些质量规范，中国的临床行业很多项目的指标都参考过CLIA’88 中的内容。

College of American Pathologists (CAP) laboratory：美国病理学家协会。

相较于Sanger测序，二代测序技术（新一代测序技术，NGS）拥有高通量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。过去的数年间，相当数量的NGS服务商迅速成长，而美国病理学家协会却没有及时依照美国临床实验室改进修正法规（CLIA）编制指南来规范这个检测。

基于NGS平台的临床检测是一种新的检测方式，相较于原有检测方法，其复杂程度大大提高，因此迫切需要一个规范标准来指导各实验室进行检测。

CAP于2011年成立了NGS工作部门，商讨NGS临床检测实验检查表的内容。本次CAP列出共计18条实验室要求的检查表，包含检测的二代测序实验过程和生物信息学分析过程。

二代测序技术（NGS）包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生物信息分析部分（dry bench）。实验操作部分包括以下部分或所有的流程：病例样本的采集处理、核酸提取、片段化、生物分子标签（barcode）、目标区段/基因捕获富集、连接、扩增、文库构建、上机测序、数据产出。生物信息分析部分主要依赖于高性能的计算机和不同的生物信息分析方法，主要流程包括：参考序列比对、组装、变异检测、注释、临床解释（依赖于是否运用诊断工具）。

CAP依据NGS实验操作部分和生物信息分析部分分别建立了独立执行标

准和检测事项：实验操作部分检测条目包括标准操作流程文件的建立、流程验证、质量管理体系、数据可靠性验证、异常情况记录及维护更新；生物信息分析部分检测条目包括：变异结果描述、附带结果的报道、数据储存、版本可追溯性及数据传输安全性。

实验操作部分

实验操作标准操作流程文件

NGS实验室需要建立一个标准操作流程文件用来指导产生NGS实验数据对于临床实验室来说，一个详细的NGS实验标准操作流程文件是实验室质量评估的一个重要指标。标准操作流程文件中需要包括DNA/RNA样本准备、片段化、建库、样本分子标签（barcode）、样品混合、上机测序相关的所有标准操作流程指导。在此基础上，所有独立的实验步骤和后续的操作才能够一一被追溯。

标准操作流程文件需要包括NGS实验过程中所有相关的方法、试剂、仪器、软件、软件版本等，此外，还应对质控标准进行详细描述，包括详细的质控参数、接受域和否定域。

例如目标区段捕获测序实验，需要描述捕获区段的基因组信息（包括目标区域基因组位置、所包括的基因等）、捕获富集的具体方法及流程、包含不同类型临床样本（血液、FFPE）处理方法的SOP等。

NGS实验操作流程验证

实验室必须对实验操作流程进行验证，并且当流程有修订的时候，必须要对整个实验操作过程进行重新确认，以检验修订后的流程是否能够符合要求。重新验证的程度和范围视修订的程度和范围而定。

所有实验室自己研发的分子诊断或临床检测项目，在进行临床应用前必须对NGS每个操作流程的性能表现进行一个内部的验证。NGS实验是一个复杂的工作流程，它由很多独立步骤组合而成。每步流程都需要分别优化到一个最佳经验值，以此来综合决定最佳的实验操作条件及各参数的设置。

在内部验证中需要考虑的必要因素包括：实验的敏感性和特异性、准确性、精确性以及检测能力的上限和下限（动态范围）。对于任何一个分子实验，对于不同的样本类型（血液、唾液、组织等）都需要独立的进行一个验证。

考虑到NGS技术并不能够完全的检测到所有理论上的变异情况，因此我们需要结合“其它检测方法（Sanger、芯片）”和“特定分析物（positive controls）”的手段来验证NGS实验的检验性能。

必须要考虑的一些性能参数：

1、分析灵敏度：可参考一个金标准的方法来观测NGS技术能检测出的最多的变异位点的数目。需要注意的是，在验证分析灵敏度“基准线”的时候，要尽可能的考虑全基因组上不同的区域。此外，也需要对基因组上不同的变异类型分别进行独立的检测（SNP、CNV、SV、homopolymers）。验证过程中，阳

参也是必需的。可以选择一些包括相关变异（例如p.F508del in CFTR）的病例样本作为阳参进行验证。

2、注意一个统计方法所涉及的假阳性和假阴性问题。考虑到不同方法对特殊样本（肿瘤样本，ctDNA，嵌合体）检测局限性，有时sanger测序并不是所有变异检测的金标准。所以在这种情况下，可通过稀释样本混合实验（dilution of samples with known allele frequencies）来测试NGS技术检验变异能力的动态范围。另外，数据的精确性可通过生物学重复（至少三个样本）和技术重复（相同样本不同barcode）来评估。

3、注意同源序列的干扰，如果实验对象有这样的情况存在，需提前进行同源序列比对分析。实验室必须提供一个方法来确认检测出的变异已排除了假基因同源序列的干扰，并且呈现此方法准确合理的证明文件。

4、如果样本通过标签（barcode）进行混样，必须证明每个样本在实验操作过程中保持样本各自的特异性。

NGS实验操作流程——质量管理体系

实验室必须遵循质量管理体系来进行NGS实验操作

CAP认证的实验室必须建立一个质量管理体系，实验室规模、临床市场、专业知识以及实验室主管在质量保证程序中的决策权共同决定了质量管理体系的内容。质量管理体系必须是文字记录的，且与设计文件内容相符一致。对于一个进行NGS实验的实验室来说，一个高质量的质量管理体系应包含以下属性：

1、质量管理体系有明确的技术路线（工作流程），包括有评估实验前期的操作步骤、测序过程、实验后期分析工作的报告。

2、NGS质量管理体系需要纳入到所在机构总的质量体系中。如果实验室只是医院或医疗中心的一部分，其NGS质量管理体系必须适从整个机构的质量保证程序内容。

3、管理体系中应当标注在实验过程中存在的常见问题。标明这些问题对结果的影响或对临床应用的影响以及是否违背实验室的一些政策和相关程序。体系文件中需要包含每次矫正的记录、效果以及操作准则和流程的修订内容。

4、质量管理体系的宗旨是保证所进行的检测是临床目的相关的。尤其对于NGS，在没有其它检测能力相当的检验方法存在的情况下，这个宗旨尤为重要。检验分析的合理适当性必须以医学科学为基准。

5、管理体系应当鼓励实验人员对整个检测程序内容提出意见与建议，员工的意见与建议调查必须包括在质量保证系统里。

NGS结果验证

实验室需要一个相关政策方案用来进行NGS检测变异结果的验证考虑NGS技术的不断发展，人们也意识到基于NGS实验所涉及的假阳性和假阴性的问题。CAP根据不同实验室的性能评价灵活的决定该实验室什么时候进行结果验证实验、实验怎样进行以及是否推荐利用NGS以外的技术在其它家系成员中进行结果验证。

每个进行NGS实验的实验室必须有个政策，明确指示验证实验需要进行，或者有个证明文件说明相关的验证为何不需要。

CAP给予实验室足够的灵活性去选择适当的结果验证的方法（并不完全依赖于Sanger，可以是碱基特异性的聚合酶链反应，溶解曲线分析）。

实验记录

在实验过程记录中，处理样本的方法、仪器、试剂必须是可识别且可追溯的在临床NGS实验过程中，一个全面完整的实验记录是必需的，包括整个实验过程中的实验条件、步骤、计算软件等。相应的，完整的存档记录必须明确表明整个实验过程中每个临床样本的试剂、引物、测序化学反应、平台都是可追踪的。此外，记录中还应包括对检测的目标区段的描述（基因组、外显子、特定基因、特定panel、转录本或甲基化区段），分析中引用的细节（文献，网站）。

建议实验室最好建立一个文档记录系统，详细的记录上述细节，并可随时调档查阅。

特殊案例记录

实验室需要建立一个特殊案例记录文档，用来记录偏离NGS标准实验操作流程的特殊病例样本情况

当检测对象及操作过程偏离实验SOP时，实验室需要对此案例进行记录，并做详细的解释说明。偏离的情况比如收到一例非常规样本后改变实验操作流程、文库构建及上机测序步骤。

当接受一个样本时，就需要对样本是否满足实验要求作出判断。如果存在犹豫及疑问，需要在工作记录中标注出，并及时与导师或实验室主任进行交流讨论。同时，需要与样本收集人沟通此问题，并将交流讨论的内容记录在工作文档中或做电子文档记录。特殊案例记录需要包括跟问题样本相关的所有方面，包括发现的问题、解决方案、相关的交流（涉及的人员，通知人与被通知人，时间）。相关记录必须列入每月质量控制报告中。

有时，实验室的SOP也需要进行更改，促使实验操作步骤更加细致明确，并剔除一些偏差误差。这种情况下，所提议的修改的内容需要实验室导师或其它与实验技术直接相关的技术人员在内的2位以上成员同意，并且修改的内容必须是经过实验室主任签字认可的。

更新维护

实验室必须具有相关政策用来对NGS实验过程中相关仪器、化学溶剂、试剂的升级更新进行监测、更新实施和记录

为防止实验使用过时的、被淘汰的方法，实验室需要及时升级更新。因此，NGS实验室必须出具相关政策方案，用来定期检测和更新在实验过程中的仪器、化学溶剂、试剂。NGS实验中所用到的最新的文库构建、扩增、测序的方法是被实验室所验证过的，能够有效的提升数据质量的重复性和实验的准确性的。此外，方案中还需注明检测升级更新的方法，更新的实施时间（每次更新的间隔时间）以及在临床实际应用前的进一步验证方案。

生物信息分析部分

NGS数据相关生物信息分析可分成三个主要步骤：首先是产生记录碱基序列信息、碱基质量的FASTQ格式文件。FASTQ文件中，每4行显示一条read 信息，包括碱基类型、标识符及碱基质量信息，FASTQ类型文件也是目前NGS 领域中应用最广泛的信息储存类型；第二步是将检测获得的序列与参考基因组进行序列比对，以此检测病人序列与参考基因组序列之间的差异，之后将这些差异与基因、蛋白功能关联，进行注释；最后一步是将检测出的变异与病例表型信息相关联，筛选结果（标注与疾病相关的稀有变异；基于家系做筛选）并形成临床报告。

结合NGS的临床诊断需要依赖于各种生物信息计算方法及软件，临床实验室在针对不同诊断应用时需要能够合理有效的选择相应的数据计算方法及生物信息分析软件。同时，对于这些算法和软件，实验室需要利用大量的样本来验证所用算法、软件在分析不同变异类型时的灵敏度、特异度以及重复性，以此来确认所用的生物信息学分析工具及参数是否符合标准，符合实验室要求及临床报告标准。

一旦方法工具确认后，实验室也需要对运用于临床诊断的生物信息分析各步骤进行记录描述，并对这些步骤实施一个质量管理方案。

NGS生物信息分析标准操作流程文件

实验室需要准备一份标准操作流程文件用来规范NGS生物信息分析中的数据分析、描述、及结果报告流程。

实验室必须详细记录描述分析过程、结果报告中涉及到的所有算法、软件、数据库信息。分析流程中的这些软件、算法、数据库的版本必须是可查询且可追溯的。实验室必须明确详细的记录与默认参数不一致的自定义参数设置。在序列比对中，所用到的参考基因组序列版本号及组装的细节也需要详细记录在文件中。

SOP文件中需要详细的描述NGS数据的整个生物信息分析流程，包括输入文件、输出文件及每步分析内容，并且描述每步过程中的质控条件及参数（每条read的质控、碱基质量、测序深度、覆盖度）。在后期数据筛选的流程及依据也需要体现在SOP文件中。

NGS生物信息分析流程验证

实验室必须对数据分析流程进行验证，并且当流程有修订的时候，必须要对整个分析过程进行重新验证，以检验修订后的流程其性能是否能够符合要求。重新验证的程度和范围依赖于修订的程度及范围。

与NGS实验操作流程一致，实验室也需要利用一些包含已知变异的序列样本来验证整个数据分析流程的精确性、特异性、重复性。验证的样本数量依据不同平台决定，验证样本的选择可参考一些权威的样本数据，比如HapMap样本、已知遗传变异的细胞系或是之前分析过的临床诊断样本。注意一些高同源性序列的分析问题，如果需要分析这种类型的样本数据，实验室需要重新开发一个独立的测试方法。

虽然NGS并不严格的要求确定变异分析中的假阳性率和假阴性率，但实验室需要针对不同变异类型，选取一些经典的样本数据来评估分析中假阳性和假阴性概率。假阳性可以通过利用不同种分析方法评估出来，而假阴性的评估则会更加的复杂一些，假阴性可能由很多不同的因素产生，包括目标区段reads覆盖度不够、碱基检出的阈值设置太严苛、链特异性造成reads分布不均匀而未达到质控条件等。分析中加入一些目标区域外的对照区域，可能是一个很好的对照措施。

在NGS实验建库过程中加入样本标签（barcode）是目前比较常做的事。但实验室需要确认标签序列在混池中的特异性，并且确认在分析的过程中，能够准确的识别区分出标签序列。在分析混池样本测序数据时，设置一个保留或过滤标签序列的标准是必需的。例如在分析过程中，只保留标签序列与建库时所添加的标

签序列完全一致的reads。因此，可以通过检测标签序列是否完整来判断在混池过程中样本之间是否污染。

整个分析流程也需要对肿瘤样本体细胞变异的检测灵敏度动态范围进行评估。这可通过对目标变异进行等浓度稀释的手段来进行评估。

当整个分析流程有改动时，对流程的再次验证也是必需的。一个实用的再次验证方法则是利用前期已验证过的数据，在设置新参数后，重新分析来检测分析的性能。

NGS数据分析流程的验证及再验证的有效性依赖于完整的验证及再验证记录及临床应用的批准文件。

NGS生物信息分析流程——质量管理体系

实验室必须遵循质量管理体系来进行NGS生物信息分析

临床实验室必需依据对应的质控标准来监测NGS数据常规分析工作，在分析过程中，任何与质控标准有偏离的地方都需要进行检查并制定对应的解决方案。偏差的情况如符合质控要求的reads数目太少；检测出的变异数目明显偏离预期；样本标签（barcode）序列被污染，导致检出的reads数显著增多。这些偏差都指示着实验过程中的误差或分析中的失误。因此，一个合适的质量管理体系必须包括一个清晰的流程用以调查记录这些偏差，寻找原因，并建立合适的修正策略，以及调查原因的方法步骤和实施的修正方案。

生物信息分析流程——更新

实验室需要有相关政策用以监测、记录及实施整个生物信息分析流程中相关软件算法的补丁修补、更新工作

NGS生物信息分析中通常会运用多种有附加脚本和数据库的开放源代码软件包。考虑到这个领域不断的在更新进步，实验室必须有相关政策方案用以监测、记录及实施整个生物信息分析流程中相关软件包、数据库的补丁修补、更新工作，方案中还应该体现更新频率（更新频率即体现更新的间隔时间），并进行详细记录。

数据存储

实验室需要在生物信息分析过程中对原始数据、中间数据及最后的结果数据的存储工作准备相应的方案

NGS数据整个分析中会产生大量的数据文件，包括原始的芯片扫描文件，序列信息碱基质量的FASTQ文件，分析流程中产生的中间数据文件及进行变异检出的VCF文件。本检查表并不要求所有的文件都要长期存储保留，实验室有

决定权来决定在最后结果报告出来后什么类型的数据文件需要储存，以及储存的时间。NGS Work Group建议存储FASTQ文件或者是整理过的BAM/SAM文件，以便后期需要时对数据进行重新分析。需要注意的是，实验室在制定数据存储的方案时，需要符合当地政府对数据存储的政策要求。

版本可追溯性

每份病例数据分析报告中，生物信息数据分析流程所涉及软件、算法、数据库的版本都是可追溯的

NGS生物信息分析流程中通常会涉及多种开放源代码软件包、脚本及数据库。每个软件或脚本的性能会直接显著的影响整个生物信息分析的效果。因此，对于每一份病例报告，实验室需要能够准确追溯其数据分析流程。对于自己开发的软件或脚本，如果有任何修改，实验室需要对其修改做好记录，但此记录不必体现在病例结果报告中。非常推荐实验室为每一套分析流程编制一个特定的、唯一的版本名称（如：NGS数据分析流程v1.0.1）。如果整套分析流程中有软件包、脚本或数据库发生变动，或者是软件的配置参数发生变化，相应的版本号就需要重新编辑设定，并且整个流程需要平台重新验证。

异常记录

实验室需要建立一个异常记录文档，用来记录偏离NGS生物信息分析标准分析流程的具体情况

整个分析流程中，如果有任何偏离数据标准分析流程的地方都需要被详细的记录下来，包括软件程序包、脚本、版本号、数据库、命令行或参数的任何变动。分析流程中出现的一些漏洞或纰漏也需要详细的记录在异常记录文档中，包括问题的描述、问题发生原因的调查、修正措施、相关的交流及直接负责人的批示。异常记录文档需要与相关的病例分析报告对应起来，而实验室主管也需要将这些与临床NGS数据分析SOP差异的地方与对应的临床医师进行交流。相关

记录列入每月质量控制报告中。

当分析一些特殊病例或基因组区间的时候，相对于SOP而言，整个分析流程中所涉及到的任何修改变动，对应的解释说明都需要体现在最终的结果报告中。

NGS数据传输保密性政策

实验室需要制定相关的规章制度用以确认病人测序数据在内部及外部存储及传

递过程中的安全性和机密性

临床NGS实验中，除了会产生大量的特定基因/区域的序列数据外，还会包括很多病人的个人信息（性别、出生年月、医疗记录、健康状态等），实验室必须建立一个严格的规章流程来确保这些个人信息的安全及隐秘，包括这些信息在不同实验室与第三方公司之间传递的安全性。

政策中需要体现的内容比如：数据的加密、数据传输的安全性、对访问用户进行权限设置、访问记录及内容统计。实验室需要遵循Health Insurance Portability and Accountability 法规（健康保险可移植性及责任与义务法规），例如与外部的供应商签订商业合同，阐明其充分的权责用以确保临床样本基因组数据在传递和接受时的机密性。

序列变异——结果解释及报告

实验平台对测序分析变异结果的描述及报告需要遵循专业组织的建议与指导基于NGS技术，实验室可以进行各项不同的检测，小到单个基因检测，大到基因panel、外显子组或整个基因组。通过NGS技术，我们通常会检测到大量的之前未报道过的新变异位点或致病位点。

目前，大多实验室在进行变异结果报道描述时会遵循人类基因组变异协会命名指南(https://www.wendangku.net/doc/b410648364.html,; accessed January 6, 2014)和美国医学遗传学学院（ACMG）的遗传疾病变异分类指导。推荐在参考这些指导时，利用他们在网站发布的最新版本。ACMG的变异分类指导手册目前正在修订，新的版本里将会包括变异的解释指南。在整理遗传疾病相关变异时，推荐参考ACMG的遗传疾病变异分类指导。而其它临床基因组检测（肿瘤、病原体诊断），实验平台需要依据自己专业的判断来对变异进行分类或当相应的指导文件出现时，遵循其分类原则。

注意变异位点对应的转录本ID，一些变异位点会作用于特定的转录本，影响该转录本的翻译及功能。因此在进行如此变异位点描述时，需要指明这些位点影响的具体转录本ID。为避免结果的混淆，在撰写临床结果报告时，需要详细列出每个变异位点对应的转录本登录号和版本号及对应的蛋白质编号。

对于遗传疾病，常见的变异分类可分为5大类：1）致病的；2）可能致病的；3）临床意义未明；4）可能良性的；5）良性。而对于其他肿瘤或病原体诊断中，目前还没有一个标准的可参考的分类指导文件，以往的结果描述中，所用到的专业术语也是各式各样，大致的描述形式为标明序列变化的结果，包括致病的、有毒的、疾病相关的，并加上一些修饰描述，如可能的、临床意义未明或未确认（possible, probably, and likely, or VUS and VOUS）。

在描述序列变异造成的临床影响时，实验平台需要充分考虑到疾病发生原因，不同人群发病率、外显率及功能学实验。推荐充分利用一些公共数据库（Exome Variant Server，1000G）与自己的数据做一些关联比较。对于一些大型的外显子组或基因组测试来说，评估一个基因对疾病的影响程度，了解不同变异类型对疾病的贡献度及这些变异的遗传模式是非常关键和重要的。

推荐参考的数据库如下表：

额外的遗传结果报告

实验室需要制定相关政策方案用来报道在检测过程中出现的与临床症状关联不

大的额外的遗传发现

在分析单个基因、panel、外显子组或基因组中，会发现一些与检测表型无关的具有重要临床意义的遗传结果。这种现象同样也会出现在对某种特定疾病进行特定分析的情况中（目标区域捕获、特定的生物信息分析）。因此，在利用NGS技术进行临床检测时，实验室需要意识到这种额外的具有临床意义的结果出现，并需要制定相关的方案来决定这些额外的结果是否或什么时候应该被报告。最近发布的ACMG关于报道医学上可行的偶然发现结果建议书中列出了一个最少量的基因列表，指明如果一个已知的变异位点被发现，这个结果就应当被报告。实验室也需要根据自身的权益制定对额外结果报告的方案政策，如果一个实验室

决定不报道这些发现或只报道一小部分变异结果，那这些决定政策需要在实验平台结果报告中进行声明。

实验平台需要基于道德伦理之上去决定是否告之病人某些确定的遗传信息。透露这些额外结果的风险等级取决于疾病的严重程度、临床可干预性和其它一些风险-利益指标（例如二型糖尿病，心血管疾病相对于癌症、孟德尔遗传疾病而言，风险等级较低）。

实施大规模临床样本NGS检测的实验室需要意识到一些医学和伦理知识

学习的重要性，在整理NGS数据报告和制定结果报告方案时要充分考虑这些因素。

NGS检测转接（外包）政策

实验室需要制定相关政策用以选择NGS检测转接（外包）的实验室或其它服务商。转接（外包）的内容可以包括整个NGS检测步骤，也可以是单纯的实验操作部分或数据分析部分

NGS临床检测相对于传统实验室检测模式而言更具复杂性和挑战性，因此越来越多的实验室开始将检测的部分工作外包到一些其他实验室或服务商。随着这种外包趋势越来越明显，NGS Work Group在NGS checklist 2014版本中增加了对检测外包政策的要求。检查表强调实验室主任或负责人对外包实验室或服务商的选择具有直接的责任。因此也希望实验室主任或负责人能够保证这些承接NGS临床实验操作和数据分析外包公司/机构的质量及性能。一些特别需要注意的地方包括：1）实验或分析的周期是能够符合临床检测要求的；2）承接NGS 实验操作的实验室是被CLIA所认证的或其实验室能达到CAP要求的每一项标准；3）承接NGS数据分析工作的公司/机构所提供的结果其准确性及质量是得到验证的。承接实验操作部分的实验室需要出具CLIA认证证明复印文件；承接生物信息分析工作的机构需要出具其内部验证证明的复印文件。

备注

随着利用NGS技术进行临床诊断的实验室越来越多，CAP认识到采用NGS 技术的临床实验室需要对其NGS技术进行一个资格认证。这篇文档主要展示了CAP NGS工作部门对临床NGS检测资格认证的内容及要求，并清晰的表达了CAP NGS工作部门在制定相关要求时的出发点和视角，力求在制定资格认证要求时能够保证病人个人信息安全和指导临床实验室合理的使用NGS技术。考虑到科技的快速发展和NGS技术的不断变化，此文档中只制定了用于NGS临床检测认证的常规要求及管理标准。实验室依据自身情况拥有一定的灵活性和自主

权进行变通，以满足这些常规的要求。文档中涉及的一些专业术语、结果解释及附带结果报道的要求主要适用于利用NGS技术进行遗传疾病的检测。对于其他一些特殊样本（肿瘤、FFPE样本）的NGS检测分析要求，会增加一些其它相关的认证要求，而NGS工作部分认为现在制定这些特殊要求还未达到成熟的阶段。

NGS工作部门声明文档中的这些认证要求随着NGS临床检测的不断发展和成熟也会不断的进行修订。随着认证方案的实施，CAP NGS工作部门会接收到不同实验室的问题反馈，此外，NGS部门也意识到，目前的这些认证要求并不能覆盖所有利用NGS技术进行的临床应用。因此，NGS部门会定期的进行讨论用以改进和明确化这些认证要求。信息反馈及平台经验会融合到部门当前和今后的商议中，关于NGS技术相关的认证要求也会不断的被修改和更新。

小编后记：本文整理自College of american pathologists' laboratory standards for next-generation sequencing clinical tests。这是一篇临床标准的文献，因此难免冗长枯燥。但小编还是认为非常有必要原汁原味的编译这篇文字，以指导临床二代测序的检测工作。受限于能力，整理中难免有各式各样的纰漏，敬请各位专家包涵并拨冗指正。谢谢！

特别致谢，自由度同学在整理编译此文过程中的巨大贡献，谢谢亲：）

一代测序与二代测序的区别与联系

一代测序与二代测序的区别与联系 Sanger 法测序（一代测序） Sanger 法测序利用一种DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T 或 C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs 和ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 高通量测序（二代测序） 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger 测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 第一代和第二代测序技术 第 X 代公司 平台 名称 测序方 法 检测 方法 大约 读长 (碱基 数) 优点相对局限性 第一代ABI/ 生命 技术 公司 3130 xL-37 30xL 桑格- 毛细管 电泳测 序法 荧光/ 光学 600-1 000 高读长，准确度一 次性达标率高，能 很好处理重复序 列和多聚序列 通量低；样品制备 成本高，使之难以 做大量的平行测 序 第 一代贝克 曼 GeXP 遗传 分析 系统 桑格- 毛细管 电泳测 序法 荧光/ 光学 600-1 000 高读长，准确度一 次性达标率高，能 很好处理重复序 列和多聚序列；易 通量低；单个样品 的制备成本相对 较高

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用复习过程

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用

随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不

DNA第一代-第二代-第三代测序的介绍

双脱氧链终止法又称为Sanger法 原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5h内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长3.5cM，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列

NGS在临床中的应用

高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望 对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1 测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（single molecule realtime，SMRT）DNA测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBio RS II每次运行能够产生60 000×16条序列，每条序列的平均长度达8 500 bp。 一般来说，以上每种测序仪在序列读段长度、准确性、测序通量、价格等多个方面存在一定的差异。焦磷酸测序平台测序读段较长，测序通量较低，成本相对较高；Illumina系列平台产生的读段相对较短，测序费用相对较低，应用比较广泛；SOLiD测序平台在通量和准确性方面相对以上2种类型的测序平台有明显改善，但是测序长度更短；半导体测序平台以及SMRT测序平台相比其他测序平台运行时间较短，另外单分子测序平台减少了测序前的扩增准备工作，测序读段较长，但是测序成本和错误率都相对较高[8-10]。一些常用的测序仪的测序原理和性能见表1。

一代、二代、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 (2014-01-22 10:42:13) 转载 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开

三代测序原理技术比较

导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序 技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1：测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用 发布时间:2014-07-19 来源:毕业论文网 随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005 年，以Illumina 公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和Walter Gibert 发明了Sanger 测序法，并在此后的10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当DNA 链加入分子ddNTP，延伸便终止。每一次DNA 测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA 片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如，临床上采用Sanger 直接测序FGFR 2 基因证实单基因Apert 综合征和直接测序TCOF1 基因可以检出多达90% 的与Treacher Collins 综合征相关的突变。值得注意的是，Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 直接扩增测序。

DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍

原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自 的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时 不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。 杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa高通量测序原理 --采用大规模并行合成测序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（ReversibleTerminatorChemistry） --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究 ----将接头连接到片段上，经PCR扩增后制成Library。 ----随后在含有接头（单链引物）的芯片（flowcell）上将已加入接头的DNA片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上，另一端和附近的另外一个引物互补也被固定，形成“桥” ----经30伦扩增反应，形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理，加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的基团，使得每个循环只能掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段= 一个磁珠= 一条读长（One fragment =One bead = One read）”

二代测序

第二代测序技术 --以Illumina/Solexa Genome Analyzer为例 1.概述 DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger 测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、 Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。 2.基本原理 Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成变测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 3.操作流程 1）测序文库的构建（Library Construction） 首先准备基因组DNA（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需

二代测序(NGS)实验方案计划和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。 随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用： ?全基因组从头测序或者重测序 ?目标序列重测序 ?转录组分析 ?微生物组研究 ?基因调控研究 NGS 序列 二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。 从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。 台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。目前，这些仪器的通量在10 Mb到7.5 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。 高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。 因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。 有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。 DNA测序 二代DNA测序的工作流程如下： ?DNA样本制备 ?文库构建和验证 ?文库分子大规模平行克隆扩增 ?测序 二代测序DNA样本的质量控制 首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。 凝胶电泳法

《二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版)》要点

《二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识 （2020版）》要点 1 引言 肺癌是目前全球最常见、致死率最高的恶性肿瘤。2018年全球肺癌新发病例近209.4万例，占所有恶性肿瘤的11.6%，死亡病例176.1万例，占所有恶性肿瘤的18.4%。全国肿瘤登记中心数据显示，2014年我国新发肺癌患者数为78.1万，死亡数达到62.6万，居所有恶性肿瘤发病和死亡人数首位。 随着对疾病认识的不断加深，肿瘤的治疗模式也在发生变革，个体化精准治疗模式逐渐成为主流。在非小细胞肺癌（NSCLC）领域，随着基因检测技术的进步和一系列新药临床研究的突破，近10年间新发现的肿瘤驱动基因不断增多，推动了NSCLC靶向治疗药物的研发和临床应用。近年来兴起的免疫治疗是肿瘤治疗领域的革命性突破。NSCLC的免疫治疗研发和应用速度进步显著，目前已有多个针对NSCLC患者的免疫治疗方案获批。但如何筛选出可从免疫治疗中获益的人群，仍是该疗法在临床应用中的一大挑战。研究表明，全面的分子生物学检测信息可为肺癌患者免疫治疗的方案选择、预后判断，以及为临床试验入组提供依据。 二代基因测序（NGS）又称为高通量测序，该技术能够同时对上百万

甚至数十亿 个DNA进行分析，实现了高通量测序的目标。 2 NGS检测的适用人群 2.1 常规推荐进行NGS检测的NSCLC患者 【共识1】：推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分的肺癌以及不能分型的晚期新发或术后复发的NSCLC患者常规进行基因检测。[级推荐] 对经小标本活检诊断为含有腺癌成分或具有腺癌分化的混合型鳞癌，以及年轻或不吸烟/少吸烟肺鳞癌患者，也推荐进行基因检测。[级推荐] 2.2 NGS和传统检测方法的比较 【共识2】：针对敏感型突变发生率高的NSCLC患者（见“共识1”），常规基因检测结果为阴性时，建议使用中国国家药品监督管理局（NMPA）或美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NGS产品进行复检。[级推荐] 3 晚期新发或术后复发NSCLC患者首次进行基因检测的

基因测序的前世今生(一代测序,二代测序,三代测序最详原理)

测序技术的前世今生 测序技术的发展历程 第一代测序技术（Sanger测序） 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。 原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

第二代测序技术(NGS) 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。 1.illumina Illumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：

NGS在临床中的应用

N G S在临床中的应用集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specificpolymerasechainreaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（singlemoleculerealtime，SMRT）DNA 测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键 3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBioRSII每次运行能够产生60000×16条序列，每条序列的平均长度达8500bp。

二代测序NGS实验方案和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程与应用。 随着人类基因组工程的完成,对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序,具有广泛的应用: ?全基因组从头测序或者重测序 ?目标序列重测序 ?转录组分析 ?微生物组研究 ?基因调控研究 NGS 序列 二代测序仪器有很多种组合,在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格与技术方面存在存在差异。 从规格与初始成本的角度而言,二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围,也就就是所谓的“台式测序仪”与高通量仪器。 台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样,自己进行测序。这些仪器可以与一些靶标序列富集技术相结合,用在一些临床的应用中,其中:选定的靶标基因用于深度分析,以检测稀有的突变,或者检测多样样本中(比如癌症样本)中的突变。目前,这些仪器的通量在10 Mb到7、5 Gb之间,但就是随着硬件,软件与试剂的持续改善,通量也在稳步增加。 高通量测序仪非常适合于大量的,基因组范围的研究,每次测序能测定600 Gb的序列。一些这样的高通量与高精度的平台,能测定的片段长度相对较短,这对于高重复性的序列与未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反,也有一些仪器能测序的片段较长(达到2500 bp),但就是其精度与测序能力(90 Mb)要低很多。还有一些测序能力位于两者之间的仪器(~800 bp,700 Mb)。 因此,应用决定了哪一种仪器就是最合适的。 有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中,根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变,可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体,而不需要生成新的DNA链。 DNA测序 二代DNA测序的工作流程如下: ?DNA样本制备 ?文库构建与验证 ?文库分子大规模平行克隆扩增 ?测序 二代测序DNA样本的质量控制 首先,评价基因组DNA的质量就是非常必要的(完整性与纯度)。 凝胶电泳法

2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识(完整版)

2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应 用专家共识（完整版） 病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而宏基因组学第二代测序(metagenomics next generation sequencing,以下简称二代测序)技术检测能覆盖更广范围的病原体。本专家共识就二代测序的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等方面进行证据总结和意见推荐。 一、证据强度和证据质量的分级定义 证据强度：A为强烈推荐；B为推荐，但其他替代方案也可接受；C为推荐强度低，寻求替代方案；D为从不推荐。证据质量：Ⅰ为证据来自随机对照试验，Ⅱ为证据来自非随机对照试验，Ⅲ为证据仅来自专家意见。 二、二代测序的临床需求与应用范围 (一)背景及概述 推荐意见1：若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测(A，Ⅱ)。 推荐意见2：对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序(B，Ⅱ)。

二代测序检测能覆盖较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测，不论临床样本培养成功与否，只要含有可检测到的DNA 或RNA即可[1,2,3,4,5,6]。从接收样本至完成数据分析，二代测序的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，已有报道为6 h至7 d不等(平均48 h)[7,8]。 二代测序在感染性疾病诊断领域中的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体。因此，二代测序可能在应用于临床疑难杂症或免疫抑制患者时有更大意义。另外，二代测序也被报道可用于"排除"检测，即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断，但前提条件是测序覆盖度足够高，能确保样本中存在的病原微生物被检测出来[1]。二代测序的其他潜在应用还包括病原体的耐药基因检测、医院感染控制的监测，以及社区传染性疾病暴发的监测，但这些应用通常需要极高的覆盖深度[9]。 从传统培养转向分子生物学诊断需要临床医师及临床微生物学家的思维转变。传统的微生物学是建立在体外分离培养的基础上，而实际上许多环境中或人体的致病微生物难以被培养，或许只能通过二代测序才能被发现[4]。所以临床医师及临床微生物学家很有必要熟悉这个新工具，知晓其优势和局限性。 目前，尚鲜见针对二代测序结果解读的规范，包括序列数阈值，以及灵敏性、特异性评估的统一临床标准等。就像所有其他新技术，在解释数据和报告数据方面仍有很大的困难与挑战[10]。如能进一步规范二代测序在临床感染性疾病中的应用，就可给予临床实践非常重要的线索和信息，协助临床诊断。

一代测序、高通量测序等各种测序相关概念介绍

什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行 细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。