RACE法在连翘花蕾全长cDNA文库构建中的应用
文章编号: 1007-6611(2009)10-0902-04
RACE法在连翘花蕾全长c D NA文库构建中的应用
刘 伟1,2, 孙海峰1,2, 郭小青2, 张丽增2, 秦雪梅1,23 (1山西大学化学化工学院, 太原 030006; 2山西大学中医药现代研究中心; 3通讯作者,Tel:0351********,E2mail:qinx m@https://www.wendangku.net/doc/b310881065.html,)
摘要: 目的 建立新的连翘花蕾全长c DNA文库构建方法。 方法 应用GeneRacer T M试剂盒,采用改良RNA连接酶介导的快速扩增c DNA末端(RNA ligase2mediated rap id a mp licati on of cDNA ends,RLM2RACE)技术构建连翘花蕾全长的c DNA文库,通过计算菌落数、蓝白斑数、酶切鉴定、序列分析等手段评价文库质量。 结果 通过增加模板用量的方法成功构建了连翘花蕾全长c DNA文库,该文库容量为3.47×105,重组率为81.6%,插入片段多集中在500-1000bp之间,所占比例为71%;随机测序的c DNA克隆中均含有完整开放阅读框的全长c DNA序列。 结论 应用RACE法成功构建了连翘花蕾全长c DNA文库。
关键词: 连翘; 全长c DNA文库; 构建; RACE
中图分类号: R284 文献标识码: A
Appli ca ti on of RACE m ethod on the con structi on of full2length c D NA li brary for flora l buds i n F orsyth ia suspense
L IU W ei1,2,S UN Hai2feng1,2,G UO Xiao2qing2,ZHANG L i2zeng2,Q I N Xue2mei1,23(1College of Che m istry and Che m ical Engineer2
ing,Shanxi U niversity,Taiyuan030006,China;2M odern R esearch Center for Traditional Chinese M edicine,Shanxi U niversity; 3Corresponding author,Tel:0351-*******,E2m ail:qinxm@https://www.wendangku.net/doc/b310881065.html,)
Abstract: O bjective To establish a ne w method f or the constructi on of full2length cDNA library of fl oral buds fr om Forsythia suspense (Thunb.)Vahl. M ethods The c DNA was p repared using GeneRacer T M kitwith s ome i m p r ove ment.Col ony for m ing unit(CF U),nu m2 bers of blue and white cl ones,enzy me digesti on,and sequence analysis were used t o evaluate the quality of constructed c DNA library. R esults The library capacity was3.47×105,the recombinati on rate was81.6%,and about71%of inserts was500bp t o1000bp in length.And all rando m ly sequenced inserts were full2length c DNA cl ones containing intact open reading fra mes. Conclusion The c D2 NA library is successfully constructed with GeneRacer T M kit,which is very useful for further study on the molecular mechanis m of fl oral devel opment and secondary metabolis m in Forsythia suspense(Thunb.)Vahl.And the new method can be used for the constructi on of full2length c DNA library in other s pecies.
Key words: Forsythia suspense; full2length c DNA library; constructi on; RACE
全长c DNA文库的构建是获得基因完整序列的重要途径之一,通过构建全长c DNA文库可以直接分离生命活动过程中的调控基因并了解这些基因所编码的蛋白质及其相互作用,是发现新基因和研究基因功能的手段,也是研究生物发育与次生代谢调控的基础。RACE技术是获得全长c DNA克隆的一种常用方法[1],是以PCR技术为基础,从部分已知的c DNA序列扩增出未知的5′端或3′端。目前, Cl ontech公司推出的基于S MART T M技术的试剂盒[2],利用mRNA帽子结构的特征,合成一段olig o 作为CapS witch,由oligo(dT)引导逆转录后作为PCR反应的5′引物,常用于全长c DNA文库的构建,但由于价格偏高,使其应用受到限制。而I nvitr ogen 公司的GeneRacer T M试剂盒采用RNA连接酶介导的快速扩增c DNA末端法(RLM2RACE),广泛用于不完整或非全长c DNA序列末端的克隆以获得全长的c DNA,与前者相比不仅价格便宜,而且鲜有文献报道直接使用该试剂盒在全长c DNA文库构建中的应用,因此本文通过优化实验条件利用GeneRacer T M试剂盒成功构建了连翘花蕾c DNA文库,大大拓展了其应用范围。
连翘[Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl]为木犀科连翘属落叶小灌木,属于大宗药材,山西产量居全国首位。目前连翘的研究多集中在化学成分及其药理作用,与发育及生殖生物学相关的研究报道相对较少[3-5],涉及连翘分子生物学的研究工作更少, Gen Bank中登录的连翘的基因序列仅有8条。构建连翘花蕾全长c DNA文库,并对文库中基因表达谱
基金项目: 山西省科技基础条件平台建设基金资助项目(2005091016-0502)
进行研究,是开展连翘花发育与次生代谢等分子生物学研究的基础,将有利于进一步从分子水平深入研究连翘及开发利用这一资源。本文通过提取连翘花蕾总RNA,采用GeneRacer T M试剂盒成功地构建了连翘花蕾全长c DNA文库,为研究连翘花蕾基因的表达谱以及克隆与花发育、次生代谢等相关基因奠定了基础,也为其他物种全长c DNA文库构建提供一种新的思路和方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 连翘花蕾采集于山西大学校园内,树龄10年以上,用液氮迅速冷冻后,-80℃保存备用。
1.1.2 酶和试剂 Eco RⅠ和Ex Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司,Poly ATtract R mRNA纯化系统购自Pr omega公司,GeneRacer试剂盒购自invitr ogen 公司,其他试剂购自上海生工。
1.1.3 菌株和质粒 感受态细胞 E.coli T op10和pCR 42T OP O T载体均来源于GeneRacer T M试剂盒。
1.1.4 仪器 S W2CJ22F双人双面净化工作台(苏净集团,苏州);TG L216高速台式冷冻离心机(湘仪公司,长沙);SPX2250B型生化培养箱(跃进器械厂,上海);恒温金属浴(博日科技,杭州);PT C21148 PCR扩增仪(B i o2rad公司,美国);Gene Snap凝胶成像系统(Gene公司,美国);Eppendorf光电比色计(Eppendorf,德国)。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取与mRNA纯化 参照文献报道的方法[6]提取连翘花蕾总RNA,具体操作如下:取1g材料,加液氮研磨成粉状,转移至50m l离心管中;待液氮挥发完后加入10m l2%CT AB缓冲液,65℃水浴10m in;等体积的氯仿∶异戊醇(V∶V, 24∶1)抽提2次后,12000×g离心10m in,转移上层水相至无RNase的离心管中,加入1/4体积的10 mmol/L L i Cl,-20℃放置2h以上。4℃12000×g 离心10m in以沉淀总RNA,将沉淀物溶于1m l TE 溶液中。4℃、12000×g离心5m in,去除溶于TE中的多糖等组分,转移上清至新的无RNase离心管中,分别用等体积的饱和酚、酚∶氯仿∶异戊醇(V∶V∶V, 25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(V∶V,24∶1)抽提离心,将最终获得的上层水相中加入1/4体积的10mmol/L L i Cl,-20℃过夜。4℃、12000×g离心10m in沉淀总RNA,弃上清,-20℃预冷的70%乙醇洗涤后,真空干燥,溶于100μl焦炭酸二乙酯(diethypy2 r ocarbonate,DEPC)处理水中。1.0%变性琼脂糖凝胶电泳分析其完整性;根据试剂盒推荐的方法,采用Poly ATtract R mRNA纯化系统mRNA,纯化后mRNA 经等体积异丙醇浓缩后溶于DEPC水中,分光光度法测定含量并分析纯度。
1.2.2 c DNA文库的构建 按照GeneRacer T M试剂盒推荐的方法并稍加改动。以2μg mRNA为模板,进行反转录反应。参照S MART T M c DNA PCR文库构建试剂盒(Cl ontech公司)推荐的PCR条件,取1μl反转录产物作为模板,进行PCR反应,反应体积为50μl。反应体系中含有2.5mmol/L d NTP4μl、10μmol/L GeneRacer5′和3′外侧引物2.5μl、反转录产物1μl、Ex Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.2μl。反应条件为:95℃预变性1m in,95℃15s、65℃30 s、68℃6m in循环15次,最后72℃延伸20m in。
1.2.3 c DNA文库质量分析 取2.0μl PCR产物与0.5μl T载体在22℃反应30m in,转化至大肠杆菌,涂布于含X2gal和I PTG的氨苄青霉素LB平皿中,37℃培养过夜。计数菌落总数及蓝白斑数量,用以计算重组率(白斑/总菌落数)和文库容量(每μl c DNA PCR产物的菌落数×c DNA PCR产物总体积)。
随机选取48个质粒、Eco RⅠ酶切鉴定插入子的大小,1.2%琼脂糖电泳分析插入子的大小,对构建好的文库质量进行初步评价。随机挑选其中11个表达序列标签(exp ressed sequence tigs,ESTs),委托上海生工测序以进一步检验文库质量。
1.2.4 序列分析 首先利用在线分析软件(www. ncbi.nl https://www.wendangku.net/doc/b310881065.html,/VecScreen/VecScreen.ht m l)去除载体序列,随后利用在线分析软件S MS中文版(www.bi o2s https://www.wendangku.net/doc/b310881065.html,/s m s/index.ht m l)分析其开放阅读框(open reading fra me,ORF)和非编码区大小(untranslated regi ons,UT R s),最后利用BLAST N和BLASTX程序(blast.ncbi.nl m.nih.g ov/blast.cgi)进行同源性检索,初步确定基因的功能。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取与mRNA纯化 总RNA电泳分析结果见图1。从图1可以看出,总RNA中28S r RNA、18S r RNA条带整齐,且28S r RNA含量大约是18S r RNA的2倍,说明所提取的总RNA完整性较好。分光光度法测定结果表明:纯化后mRNA含
量为0.62μg/
μl,OD 260/280为2.07,符合纯mRNA OD 260/280大于2.0的要求,可以用于c DNA 文库的构建
。
图1 连翘花蕾总RNA 电泳图谱
Fig 1 Electr ophoresis of t otal RNA extracted fr om fl ower
buds in Forsythia suspensa
2.2 c DNA 文库质量分析 利用试剂盒合成的c D 2NA 第一链体积为20μl 。取1μl c DNA 作为模板,
进行PCR 反应,反应体积为50μl 。取2μl PCR 产
物与0.5μl T 载体连接,进行转化试验。转化后共获得283个白斑、64个蓝斑,菌落数共计347个。
重组率为81.6%,文库容量为3.47×105
。
对于文库中获得的ESTs,提取了48个质粒,酶
切鉴定并电泳分析插入子的大小。结果表明:48个
重组子中ESTs 小于500bp 有6个、500-750bp 有23个、750-1000bp 有11个、1000-2000bp 有8个,即片段大小在500-1000bp 的最多,其次为1000-2000bp 的,500bp 以下的最少。其中长度在500-750bp 的c DNA 序列占47.9%,大约为重组子的一半。
随机测序的11个质粒酶切鉴定结果见图2。测序结果表明,测序的11个ESTs 中,成功测得8
个,且1#和8#
为同一基因的两个克隆。这8个ESTs 均包括完整的ORF,说明该文库克隆的ESTs 为全长的完整c DNA 序列,有关序列信息见表1。从表中还可以看出,这几个基因分别参与了蛋白质合成[7,8]、糖代谢[9]、能量代谢[10]和物质转运[11]等生命过程,进一步说明该文库具有一定的代表性
。
M.DNA marker;1-11.随机测序的11个ESTs
图2 待测序重组质粒插入子大小分布
Fig 2 Size distributi on of inserts being sequenced by elec 2
tr ophoresis
表1 测序后序列的详细信息
Tab 1 D et a iled i n for ma ti on of sequenced ESTs
ORF 长度/bp
5′-UTR 长度/bp
3′-UTR 长度/bp
氨基酸长度/aa
可能的基因
No .154946182159核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小亚基
No .23486322011560S 酸性核糖体蛋白No .32135725270F12ATPase ep sil on 亚基No .4456822915140S 核糖体蛋白S15No .54389222514540S 核糖体蛋白S17No .628212924293Ti m 10家族锌指蛋白
No .745391129150糖基水解酶家族蛋白
No .8
549
46
182
159
核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小亚基
3 讨论
GeneRacer T M
试剂盒在反转录合成c DNA 之前,
首先利用牛小肠碱性磷酸酶去除部分降解的不完整
mRNA ,再利用烟草酸性磷酸酶去除完整mRNA 5′
端的帽子结构,产生5′2Pi,在RNA 连接酶的作用下,该磷酸基团与人工合成的RNA oligo 结合作为
c DNA合成的模板,最后利用oligo(dT)引物反转录合成第一链c DNA[12]。在克隆获得c DNA末端反应中推荐的模板mRNA用量为1μg,但本研究中发现该模板用量下获得的c DNA存在RNA接头相互连接的问题。本文通过将GeneRacer试剂盒中模板mRNA的用量增加至2μg,获得的c DNA就不会出现接头相互连接的问题。
文库容量、重组率和插入片段的大小是评价c DNA文库质量的重要指标,本课题构建的c DNA 文库容量为3.47×105,重组率为81.6%,ESTs大小在500-1000bp的最多,其次为1000-2000bp, 500bp以下的最少。根据一般文库的评价指标,我们所构建的连翘花蕾c DNA文库在文库容量、重组率和插入片段大小等方面均符合高质量文库的标准,达到了实验的预期要求。相比较而言,本文库的重组率偏低,可能与c DNA插入时的连接效率、感受态细胞的转化率等因素有关。
文库的完整性与覆盖度是构建c DNA文库的关键,因此本研究在总RNA提取、mRNA纯化、c DNA 合成等过程中严格避免RNA酶的作用,并适时检测每一步的实验结果和片段组成,以保证构建的c D2 NA文库能够真实反映连翘花蕾的基因表达情况。随机测序结果表明获得的ESTs中均含有全长的c DNA克隆,包含着相对应mRNA分子的完整ORF 和UTR s,揭示着文库的完整性较好,可用于后续基因表达谱与功能基因在转录及翻译水平上的调控机制研究,为后期分子水平调控连翘的生长、发育和代谢奠定实验基础。
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作者简介: 刘伟,男,1985-09生,硕士,E2mail:200822905003@ https://www.wendangku.net/doc/b310881065.html,.
[收稿日期: 2009-08-14]