SD 大鼠脓毒血症

大鼠脓毒血症建立方法

SD 大鼠, 体重190～270 g ,雌雄均有, 禁食24 h 后进行实验。用2.5 %戊巴比妥钠按1 ml/ kg 体重, 腹腔注射麻醉大鼠, 随机分为实验组和对照组(假手术组) 。常规消毒腹部, 在下腹部正中央切口, 长约2 cm , 打开腹腔寻找盲肠, 小心分离其远端与大肠的系膜, 盲肠内如有粪便, 则把粪便小心挤向相连的大肠, 实验组在盲肠远端1/ 2 处用无菌4 号丝线紧紧结扎, 并用无菌7 号针头在已结扎盲肠远段中央处贯通穿刺。然后把盲肠推回腹腔, 关闭腹腔, 逐层缝合。对照组仅做开腹分离盲肠远端与大肠的系膜及关腹手术。术后按50 ml/ kg 体重皮下注射生理盐水, 补充手术中丢失的体液, 连续观察24h , 整个实验过程中在室温22～25 ℃环境进行并让大鼠自由饮水。在盲肠结扎前、结扎后8 h、16h、和24h 在无菌条件下取大鼠尾血1 滴进行细胞培养, 实验组还在无菌条件下取腹腔渗出液少许进行细菌培养。

用结扎整个盲肠加穿刺的方法可复制出动物的理想败血症模型, 因为动物模型血液细菌培养阳性, 培养出来的细菌与感染灶细菌完全或部分相同, 动物表现与临床败血症类似, 重复性好, 模型复制后有一定的存活时间供研究之用。有人把结扎整个盲肠改为结扎盲肠1/ 2 , 把穿刺盲肠2 次改为贯通穿刺盲肠, 操作更为简便, 效果也令人满意。

造成盲肠缺血坏死, 自身肠道的细菌进入腹腔造成感染。血液培养显示, 在CL P 后16 h , 血液已有大肠杆菌及绿脓杆菌生成, 与腹腔渗出液细菌培养结果相同; 培养出的菌种与报道略有不同, 这可能是由于大鼠来源及实验室的条件不同造成的。

实验组动物术后24 h 活杀, 见盲肠结扎的远端已发生坏死, 穿刺的针孔明显, 腹腔感染, 有臭味的渗出液,但腹腔未见粪便, 这与人类阑尾穿刺并发腹膜炎等疾病过程相似。大鼠盲肠结扎加穿刺引起的败血症存活情况与结扎盲肠部分的多少, 穿刺针孔的多少和大小有关。针孔多, 针孔大, 死亡率高。上述结扎整个盲肠并用9号针头刺孔2 个, 24 h 有75 %大鼠死亡。有人结扎1/2 盲肠并用7 号贯通穿刺, 24 h 无大鼠死亡。另外,饲养动物环境也是影响动物存活率的重要因素。有人曾在室温30 ℃时, 饲养CL P 大鼠5 只, 结果在24 h内全部死亡。

大鼠脓毒症预后判断指标集及预测模型的初步研究

脓毒症是感染导致的全身炎症反应综合征(SIRS),是各种严重创伤、烧伤、休克、再灌注损伤及外科大手术后常见的并发症,其死亡率高达30-50%。脓毒症的发生机制极其复杂,其复杂性和非线性的特点导致了对其诊断、预测和治疗的不确定性。这也是当前脓毒症死亡率居高不下的主要原因。因此,研究脓毒症生物标志物,探讨脓毒症诊断、预测、疗效评估的新方法,以指导脓毒症的防治,降低其发病率和死亡率,具有重要的科学意义。本课题采用盲肠结扎穿刺(CLP)制备大鼠脓毒症模型,观察大鼠CLP前后血清炎症介质TNF-α, IL-1β, IL-6,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),高迁移率族蛋白 1 (HMGB1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及血尿素氮(BUN),肌酐(Cr),乳酸脱氢酶(LDH),谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),肌酸激酶(CK)和血常规的变化,探讨上述指标的改变及其与脓毒症大鼠预后的关系,试图筛选出有意义的指标建立指标集,并采用该指标集对脓毒症大鼠进行预后评估,以改善脓毒症大鼠预后评估的敏感性、特异性和准确度。结果如下：1.大鼠CLP模型复制：大鼠行CLP后,6h开始死亡,12-24h死亡最多,72小时死亡率为59%；血清炎症介质TNF-α, IL-1β, IL-6, GM-CSF及HMGB1水平显著升高；CLP术后12h处死大鼠,发现多个器官(心、肝、肺、脑及肾)发生组织形态学改变。2.根据CLP术后72h是否死亡分为存活组和死亡组。存活组大鼠CLP术后12小时ALT, AST, HMGB1, IL-6以及MCP-1水平高于术前(p<0.05或p<0.01)；白细胞计数、血小板计数、CK及IL-1β水平低于术前(p<0.05或p<0.01)。死亡组大鼠CLP术后12小时体温、红细胞计数、红细胞比积、BUN,ALT,AST,HMGB1,IL6以及MCP1水平高于术前(p<0.05或p<0.01)；白细胞计数、血小板计数、血清肌酸激酶水平低于术前(p<0.05或p<0.01)。3.死亡组CLP术后12小时BUN, Cr, ALT, LDH, CK, IL-6以及MCP-1水平高于存活组(p<0.05或p<0.01)；血小板计数、血清HMGB1及GM-CSF水平低于存活组(p<0.05或p<0.01)。4.CLP术后12小时体温以及血清尿素氮、肌酐、谷丙转氨酶、肌酸激酶、IL-6和MCP-1水平与大鼠存活结局呈负相关,而血小板计数、血清HMGB1及GM-CSF与大鼠存活结局呈正相关。5.为判断各指标在脓毒症预

后预测中的价值及选择最优的指标集,采用Logistic回归对上述与脓毒症预后相关的指标进行了分析,发现将尿素氮、肌酐、IL-6.GM-CSF纳入方程,则预测的敏感性(86.2%)、特异性(83.3%)以及准确度(84.7%)均达最高,据此建立下述回归方程：Logit P=-8.367+1.124BUN+1.134Cr+0.003IL6-0.249GM-CSF其中P为死亡与存活概率之比,LogitP为死亡与存活概率之比的自然对数。综上所述,本研究在成功复制了大鼠CLP脓毒症模型基础上,筛选出与大鼠脓毒症预后相关的指标,并选择最优指标集建立了脓毒症预后预测模型。该预测模型显示,脓毒症大鼠血清BUN,Cr,IL-6水平升高及GM-CSF水平降低时预后不良。上述结果为临床脓毒症的预后判断和疗效评估提供了新的实验证据和研究思路。

脓毒症模型大鼠肿瘤坏死因子α和肝细胞凋亡的关系

摘要：目的：探讨脓毒症大鼠肿瘤坏死因子a（TNFa）与肝细胞凋亡的关系以及对肝功能的影响。方法：大鼠随机分为正常对照组和实验组，实验组采用盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症大鼠模型，分别于术后30、60、120、180 min （CLP术后30、60、120、180 min组）处死动物，测定肝组织和血浆TNFa 水平，并检测肝细胞凋亡的情况，同时测定丙氨酸氨基转移酶（ACL）正常对照组相比，CLP术后30、60、120、180 min组肝细胞凋亡数、血清TNFα、ALT 水平均明显升高（P<0.01），有随着时间的延长增加的趋势；与正常对照组相比，CLP术后120、180 min组血清AST含量明显升高（P<0.01）；CLP术后大鼠肝组织、TNFα表达强度随时间延长而有增强的趋势。结论：CLP后大鼠肝脏产生大量TNFα，与肝细胞凋亡有密切关系，肝功能受到损伤。

脓毒症是严重创伤、感染及大手术后常见的并发症，可引起脓毒症休克及多脏器功能障碍综合征（MODS）。随着分子生物学和基因分析技术的发展和应用，人们对脓毒症发病机制的了解日益加深。肝脏是脓毒症过程中最易受损的器官之一，肝细胞凋亡是造成肝脏损伤和肝脏疾病最基本的中心环节［1］,肿瘤坏死因子α(TNFα)是肝脏的一个主要炎症因子和效应分子，它与肝细胞凋亡的关系甚为密切［2］。我室采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症大鼠模型，观察TNFα和肝细胞凋亡的关系以及脓毒症大鼠肝功能的变化，为临床防治脓毒症提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物及模型制备雄性Wistar大鼠30只，清洁级，体重180～220g，由新疆医科大学实验动物中心提供，实验前饲养1周，禁食过夜，自由饮水。30只大鼠分为2组，实验组24只，参照文献［3］的方法行CLP，建立脓毒症大鼠模型。20％乌拉坦腹腔注射麻醉后固定，沿腹正中线作1.5 cm切口，结扎盲肠根部，避免结扎回肠及盲肠系膜血管，用18号针穿刺盲肠4次，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，分别于CLP术后30、60、120和180 min （CLP 术后30、60、120、180 min组）断头取血，分离血清，并留取肝组织标本，48～72 h内行石蜡包埋，切片4.5 μm厚，脱蜡后常规HE染色。正常对照组6只，麻醉后不进行盲肠结扎穿孔，其余同CLP组。

1.2观察指标和方法

1.2.1肝细胞凋亡原位末端标记检测(TUNEL)［4］采用ＴＵＮＥＬ法进行检测肝细胞凋亡，计算5个高倍视野（400）下的凋亡细胞数，凋亡指数以每百个细胞中的凋亡数表示。

1.2.2肝组织TN Fα的免疫组化检测及结果判定常规石蜡切片脱蜡，3％

H2O2处理10 min消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗3 min×3，加枸橼酸修复液放入微波炉（70°C）8 min，自然降温至室温，PBS冲洗3 min×3。湿盒中滴加小牛血清，室温放置25 min，加入TNFα抗体Ⅰ室温放置2 ｈ，再滴加ＴＮＦα抗体Ⅱ室温放置20 min后，滴加抗体Ⅲ，20 min后室温显色15 min。PBS 冲洗3 min×3，苏木素复染，常规封片，镜下观察。结果判定：阴性：细胞及间质内着色（－）；弱阳性：细胞内见淡黄色颗粒（±）；阳性: 细胞及间质内见棕黄色颗粒（+）；中等阳性：细胞及间质内见较深棕黄色颗粒（++）；强阳性：细胞及间质内见大量深棕黄色颗粒（+++）。

1.2.3血清TNFα、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平的测定采用放射免疫法测定血清ＴＮＦα水平，试剂盒购自北京东亚免疫所。采用CX7自动生化分析仪（美国Beckman公司）检测ALT、AST水平。

1.3统计学处理所得数据以±s表示，计量资料采用t检验、方差分析进行统计学处理，检验水准α=0.05。

2结果

2.1肝脏病理组织学观察正常对照组肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态结构正常，肝窦清晰，窦内皮细胞、枯否氏细胞均未见明显变化。汇管区小叶间动静脉、小叶间胆管结构清晰，未见炎细胞。CLP组肝细胞明显肿胀，胞浆疏松，肝小叶结构紊乱，肝窦变窄，窦腔内有胆汁聚集，门脉区有较多炎细胞浸润。CLP术后3 h,可见肝窦间隙变宽,偶见点状坏死。

2.2各组大鼠肝细胞凋亡及变化TUNEL染色阳性细胞以肝细胞为主，很少见枯否氏细胞。CLP术后30 min时肝组织即出现细胞凋亡，随着时间的延长细胞凋亡数逐渐增加,CLP术后30、60、120、180 min组肝细胞凋亡与正常对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）(表1)。

表1各组大鼠肝细胞凋亡分级及变化(略)

2.3各组大鼠肝组织TNFα的表达染色阳性细胞以肝细胞和枯否氏细胞为主，并间质着色，其阳性表达强度随着时间的延长而逐渐增强，正常对照组及CLP术后30、60、120、180 min组肝组织TNF的表达分别为－、＋、＋、＋＋、＋＋＋。

2.4各组大鼠血清TNFα、ALT、AST水平比较CLP术后30minTNFα即增加，但随后增加缓慢,与正常对照组相比，CLP术后30、60、120、180 min 组血清TNFα水平均明显升高（P<0.01）,CLP术后30 min组与60 min组相比差异无统计学意义（P>0.05)，CLP术后180 min比术后120 min含量明显增加(P<0.01)。CLP术后30 min ALT即增加，且呈进行性增加，CLP术后30、60、120、180 min组ALT水平与正常对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01），与正常对照组及CLP术后30、60 min相比，CLP术后120、180 min组AST 明显升高（P<0.01）（表2）。

表2各组大鼠血清TNFα、ALT和AST水平比较(略)

3讨论

肝脏是全身最大的网状内皮系统，肝脏枯否氏细胞具有强大的中和、灭活和清除毒素的作用，其在脓毒症与器官损害的发生、发展中具有重要的调控作用。肝脏组织中单核巨噬细胞是产生和释放TNFα的主要细胞，也是脓毒症时最早释

放且起关键作用的介质，因此TNFα在肝脏中的含量较其它组织多［5］，诱导产生的氧自由基以及多基因的激活共同导致的肝细胞凋亡在肝损害的发生发展过程中有十分重要的作用［6］。本实验结果表明，脓毒症模型大鼠肝脏组织和血中TNFα水平明显升高，肝细胞凋亡的数目增多，肝功能损害的程度加重，正常肝组织中TNFα有少量表达，而CLP组大鼠TNFa在胞浆内表达明显增强，染色加深，且部分细胞间质着色，分布不均匀，在窦间隙周围较多。肝细胞凋亡的主要特征是：肝细胞结构紊乱，有散在的凋亡细胞，窦间隙内有大量白细胞聚集，可见枯否氏细胞及肝窦内皮细胞发生凋亡。

脓毒症时细菌产生各种调节素，调节素分子与机体相应受体结合，通过相应的信号传递系统，诱导单核/巨噬细胞、纤维母细胞、上皮细胞、淋巴细胞等合成各类致炎或抗炎的细胞因子，生成的细胞因子以自分泌或旁分泌的方式作用于宿主细胞，调节机体反应。尤其是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的内毒素进入机体后，通过内毒素结合蛋白的转移和提成使之与细胞结合位点结合后将脂多糖（LPS）转呈至Toll样受体2（TLR2）上，LPS的信号通过TLR2胞内区域而传递至IL1受体辅助蛋白（IRAP），再进一步与IL1受体辅助蛋白激酶( IRAK )作用，IRAK启动细胞内主要功能蛋白（如丝裂原激活蛋白激酶）的磷酸化，后者进一步使INFκB的抑制蛋白（IκB）磷酸化而使NFκB游离出来进入细胞核，作用于增强子或启动子导致炎性细胞因子基因激活，最终产生大量的炎性细胞因子［7］。研究表明，在这些细胞因子中TNFα为一种主要的炎性因子，其升高程度与血浆内毒素含量呈正相关［8］。TNFα诱导肝细胞损伤的机制可能有：（1）TNFα与TNFR1的胞外区结合后，引起TNFR1的三聚，三聚的TNFR1通过其聚集的胞内死亡结构域招募下游的信号传导蛋白如TRADD、FADD、TRAF和RIP等组装成庞大的TNFR1信号复合体，再激活下游的各条信号传导通路，最后激活NFκB、JNK激酶，诱导细胞凋亡［9,10］。(2)细胞中ASK1与其抑制性蛋白Trx结合,当细胞受到TNFα刺激后，可通过某中未知的机制产生活性氧自由基，活性氧自由基引起Trx从ASK1上脱落，ASK1最终可激活JUK和p38激酶诱导细胞凋亡［9］。(3)TNFα能介导脂类介质或其它肽类介质产生，诱导自由基的产生及脂质过氧化，活化中性粒细胞和单核巨噬细胞以及对内皮细胞的作用［11］。

由CLP造成的脓毒症模型大鼠，血清中ALT、AST呈进行性升高趋势，与细胞凋亡的变化规律相一致，表明脓毒症时产生的TNFα参与了机体炎症反应和脏器功能损害的病理生理过程。光镜观察显示，大鼠肝组织内出现炎性细胞浸润、淤血，肝细胞出现变性、坏死等不同程度的改变，说明存在肝组织结构受损、肝功能障碍。龙海波等［12］做动物实验证实特异性免疫吸附可清除循环中TNFα，有效调节NO和氧自由基在肝细胞的生成和作用，从而减轻内毒素休克时氧化应激对肝细胞损伤。临床研究也显示，脓毒症患者发展为MODS时，急性生理学与慢性健康状况评分高的体内TNFα水平也升高［13］，但临床用抗TNFα抗体或可溶性TNFα受体治疗脓毒症或脓毒症休克时疗效不佳。

综上所述，脓毒症时TNFα在肝细胞凋亡中有重要作用，并且肝细胞凋亡和肝脏损伤有密切的关系，随着对肝细胞凋亡认识的深入，将促进人们探讨新的肝细胞凋亡机制和产生阻止肝细胞凋亡的新方法。

盲肠结扎穿孔术致大鼠脓毒症模型的建立及其器官功能损伤的研究

实验一、具有稳定死亡率的盲肠结扎穿孔术致脓毒症大鼠模型的建立目的：通过盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture，CLP)制作有稳定死亡率(50-70％)的脓毒症大鼠动物模型。方法：采用不同大小穿刺针贯穿盲肠末端2—3次的方法制作腹腔感染的大鼠脓毒症动物模型，观察实验动物术后的表现及72小时死亡率。结果：采用12～16号针头在结扎处远端贯穿盲肠二到三次并挤出少量肠内容物至腹腔内造成的动物模型死亡率可稳定达到50-70％，所有实验动物的死亡均出现于实验后12小时后。结论：采用12～16号针头在结扎处远端贯穿盲肠二到三次并挤出少量肠内容物至腹腔内造成的动物模型死亡率为50-70％，符合临床脓毒症休克高死亡率特点。可作为脓毒症研究的理想实验动物平台。实验二、CLP术后大鼠循环系统功能变化及心肌损伤的研究目的：研究脓毒症早期大鼠心功能及心肌酶指标的动态变化，了解二者在病程进展中的作用，探讨脓毒症早期心功能不全的病理生理学机制。方法：60只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组，实验组采用盲肠结扎穿刺法(CLP)复制脓毒症动物模型，并根据术后不同时间点将大鼠分为CLP术后3、5、7、9h共4个组，每组12只，观察术后心功能指标：平均动脉压(MAP)、左室收缩内压(LVSP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)以及血清心肌酶指标：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶

(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)、LDH-1、羟丁酸脱氢酶(a-HBDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)的动态变化。对照组不进行CLP术，检测指标同实验组。结果：CLP组术后3h LVSP、MAP升高，与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)；CLP组术后3、5、7h±dp/dtmax升高，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)；CLP组术后7、9h AST升高，与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)；CLP组术后3h以后CK、CKMB升高，与对照组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。结论：大鼠CLP术后早期循环系统呈现高排低阻表现，心肌损伤明显：脓毒症早期可导致循环系统呈现高动力状态并引起心肌损伤。实验三、CLP术后大鼠肠道屏障破坏与急，性肝、肺损伤的研究目的：评价CLP术后大鼠能否反映肠源性感染后脓毒症发生的病理生理过程，探讨脓毒症肠道屏障破坏与急性肝、肺损伤的机制。方法：制作CLP脓毒症大鼠模型，测定模型动物致伤后不同时间小肠组织二胺氧化酶(DAO)、血液AST和ALT变化，肺湿重/干重比值(W/D)及动脉血气；采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)测定肺组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)mRNA的表达；通过ELISA法检测肠、肝、肺组织的TNF-α和白细胞介素-6(IL-6)水平并测量血清、肺、肝脏组织脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)浓度以了解各脏器在脓毒症发生发展过程中的脏器损伤情况和炎症反应的水平。结果：CLP术后DAO迅速下降；AST、ALT升高，血气分析提示血氧分压持续降低，肺组织含水量随时间延长而增加。肝、肺组织炎症因子及内毒素水平显著升高，肺脏IL-6、TNF-α mRNA表达增强。病理观察肠、肝、肺组织损伤严重。结论：CLP致大鼠脓毒症动物模型能很好的反映肠源性感染导致的脓毒症发生发展的病理生理过程，各脏器炎症反应剧烈，功能损伤严重，是脓毒症研究的理想实验动物平台。

脓毒血症抗炎机制重症监护病房脓毒性休克罗格列酮免疫应答炎症指标摘要:一、研究背景及目的本实验采用盲肠结扎穿孔制作大鼠脓毒血症模型，观察大鼠脓毒血症时有核细胞PPAR γ活性、血浆炎症介质的变化，探讨有核细胞PPAR γ活性与血浆促炎介质IL-6、TNF-α及抗炎介质IL-4之间的关系比较PPAR γ配体罗格列酮治疗组、头孢他啶治疗组及联合治疗组三组间各组脓毒血症大鼠血浆中促炎介质及抗炎介质水平变化趋势及外周血有核细胞PPAR γ活性，比较三个治疗组治疗效果阐明PPAR γ配体噻唑烷二酮类药物在脓毒血症

中应用的地位二、材料和方法1、动物与分组雄性SPF级SD大鼠180只，体重280-300g，随机分为A、B、C、D、E、F六个组,观察指标为有核细胞中的PPAR Y活性及血浆中IL-6、TNF—α、IL-4的水平变化趋势2、模型制备及干预方法采用盲肠结扎穿孔制作大鼠脓毒血症模型，行CLP术后3小时腹腔注射药物干预，每12小时重复一次3、有核细胞的收集和纯化到达预定时间后，动物腹腔注射10％水合氯醛3mlkg，器械分离一侧颈总动脉，5ml注射器穿刺采血5ml，缓慢注入含有10％EDTA的干燥试管中，30min内进行离心10min，取上层血浆-80℃保存待检炎症指标，下层血液以PBS液稀释后，大鼠白细胞分离液分离有核细胞-80℃保存提取有核细胞总蛋白4、有核细胞总蛋白的提取用组织蛋白提取液裂解有核细胞，提取有核细胞总蛋白用于测定PPAR γ活性5、指标的测定大鼠血浆炎症指标的水平及有核细胞中的PPAR γ活性均采用ELASA 方法测定，具体操作按试剂盒说明书进行6、统计学分析各组数据以均数±标准差表示，所有数据的计算、统计分析用SPSS13.0 for windows软件处理，以P ＜0.05为有统计学意义三、结果1、CLP大鼠脓毒血症模型的建立各组间大鼠体重两两比较差异无统计学意义，提示各组间具有可比性2、脓毒血症大鼠体内促炎介质和抗炎介质水平 2.1血浆IL-6水平析因设计的方差分析显示大鼠血浆IL一6水平具有分组主效应和时间主效应，且两者具有交互效应假手术组和正常对照组比较P＞0.05，差异无统计学意义正常对照组、假手术组各组组内各时间点之间两两比较P＞0.05，差异无统计学意义CLP术后第12h、24h、48h，脓毒血症组大鼠血浆IL-6水平明显升高，和正常对照组、假手术组比较P＜0.05，差异有统计学意义脓毒血症组大鼠血浆IL-6水平随时间的延长逐渐升高，24小时达高峰，然后逐步下降，组内各时间点之间两两比较P=0.000，差异有统计学意义CLP术后第12h、24h、48h，与脓毒血症组相比，CAZ治疗组、RSG治疗组、联合治疗组大鼠血浆IL-6水平明显下降，差异有统计学意义联合治疗组血浆IL-6水平低于CAZ治疗组、RSG治疗组，差异有统计学意义CAZ治疗组血浆IL-6水平低于RSG治疗组，并且差异有统计学意义各治疗组大鼠血浆IL-6水平均较正常对照组、假手术组升高，差异有统计学意义CAZ治疗组大鼠血浆IL-6水平各时间点两两比较，差异无统计学意义RSG治疗组12h与24h、12h 与48h比较，差异有统计学意义24h与48h比较，差异无统计学意义联合治疗

组12h与48h比较P=0.009，差异有统计学意义，12h与24h比较，24h与48h 比较，差异无统计学意义 2.2血浆TNF-α水平析因设计的方差分析显示大鼠血浆TNF-α水平具有分组主效应和时间主效应，且两者具有交互效应假手术组的TNF-α水平较正常对照组升高，但差异无统计学意义正常对照组、假手术组组内各时间点之间两两比较，差异无统计学意义CLP术后第12h、24h、48h，脓毒血症组大鼠血浆TNF-α水平明显升高，和正常对照组、假手术组比较P＜0.05，差异有统计学意义脓毒血症组大鼠血浆TNF—α水平随时间的延长逐渐升高，24小时达高峰，然后逐步下降12h与24h、24h与48h比较差异有统计学意义12h 与48h比较差异无统计学意义CLP术后第12h、24h、48h，与脓毒血症组相比，CAZ治疗组、RSG治疗组、联合治疗组大鼠血浆TNF-α明显下降，差异有统计学意义联合治疗组大鼠血浆TNF-α水平较CAZ治疗组、RSG治疗组降低，差异有统计学意义CAZ治疗组大鼠血浆TNF-α水平较RSG治疗组降低，差异有统计学意义各治疗组大鼠血浆TNF-α水平均较正常对照组、假手术组升高，差异有统计学意义CAZ治疗组大鼠血浆TNF-α水平12h与24h、48h比较差异有统计学意义，24h与48h比较比较差异无统计学意义RSG治疗组12h与24h比较差异有统计学意义、与48h比较差异无统计学意义，24h与48h比较差异有统计学意义联合治疗组组内各时间点间两两比较，差异有统计学意义 2.3血浆IL-4水平析因设计的方差分析显示大鼠血浆IL-4水平具有分组主效应和时间主效应，且两者具有交互效应假手术组的IL-4水平与正常对照组相比，差异无统计学意义正常对照组、假手术组组内各时间点之间两两比较，差异无统计学意义CLP术后第12h、2411、48h，脓毒血症组大鼠血浆IL-4水平较正常对照组、假手术组升高，差异有统计学意义脓毒血症组大鼠血浆IL-4水平随时间延长逐渐升高，48h达高峰组内12h和24h比较，差异无统计学意义48h与12h、24h组相比，差异均有统计学意义CLP术后第12h，与脓毒血症组相比，CAZ 治疗组、联合治疗组大鼠血浆IL-4明显降低，差异有统计学意义RSG治疗组虽较脓毒血症组有降低，但差异无统计学意义CAZ治疗组、联合治疗组较RSG 治疗组IL-4水平降低，差异有统计学意义联合治疗组、CAZ治疗组大鼠血浆IL-4水平比较，差异无统计学意义各治疗组大鼠血浆IL-4水平均较正常对照组、假手术组升高，差异有统计学意义CLP术后第24h、48h，与脓毒血症组相比，

CAZ治疗组、RSG治疗组、联合治疗组大鼠血浆IL-4均下降，差异有统计学意义联合治疗组大鼠血浆IL-4低于RSG治疗组、CAZ治疗组，差异有统计学意义CAZ治疗组大鼠血浆IL-4低于RSG治疗组，差异有统计学意义各治疗组大鼠血浆IL-4水平均较正常对照组、假手术组升高，差异有统计学意义联合治疗组12h与24h，24h与48h比较差异无统计学意义，12h与48h比较，差异有统计学意义余CAZ治疗组、RSG治疗组大鼠血浆IL-4水平组内各时间点之间两两比较，差异均无统计学意义3、有核细胞PPAR γ活性析因设计的方差分析显示大鼠有核细胞的PPAR γ活性具有分组主效应和时间主效应，且两者具有交互效应假手术组有核细胞的PPAR Y活性与正常对照组相比，差异无统计学意义正常对照组、假手术组组内各时间点之间两两比较，差异无统计学意义CLP 术后第12h、24h、48h，脓毒血症组大鼠有核细胞的PPAR γ活性逐渐下降，与正常对照组和假手术组相比，差异有统计学意义，组内各时间点之间两两比较，差异均有统计学意义CLP术后第12h、24h、48h，与脓毒血症组相比，罗格列酮治疗组、头孢他啶治疗组、联合治疗组大鼠有核细胞的PPAR Y活性升高，差异有统计学意义RSG治疗组与联合治疗组均较CAZ治疗组高，差异有统计学意义联合治疗组较罗格列酮治疗组高，差异有统计学意义联合治疗组、罗格列酮组大鼠有核细胞的PPAR Y活性均较正常对照组、假手术组升高，差异有统计学意义，头孢他啶治疗组在CLP术后第12h较正常对照组、假手术组低，但差异无统计学意义，在CLP术后第24h、48h较正常对照组、假手术组降低，差异有统计学意义CAZ治疗组组内PPAR y活性比较，12h与24h、48h比较，差异均有统计学意义，24h与48h比较，差异无统计学意义RSG治疗组与联合治疗组有核细胞PPAR γ活性组内各时间点之间两两比较，差异均无统计学意义四、结论1、本实验进行盲肠结扎穿孔成功的复制大鼠脓毒血症模型2、与正常对照组和假手术组相比，脓毒血症组大鼠血浆促炎介质IL-6、TNF-α及抗炎介质IL-4升高明显，随时间延长有上升趋势，IL-6、TNF—α在术后24小时达高峰，后逐渐下降，但仍然处于较高水平状态，IL-4呈持续性升高，存在促炎和抗炎平衡失调3、脓毒血症组大鼠有核细胞PPAR γ活性与正常对照组和假手术组相比明显降低，并随病情加重而逐渐下降4、罗格列酮可提高脓毒血症大鼠有核细胞PPAR γ活性，降低血浆IL-6、TNF-α、IL-4水平，但疗效不及头孢他啶治

疗组和联合治疗组5、脓毒血症组大鼠有核细胞PPAR γ活性与血浆促炎介质IL-6、TNF-α水平呈负相关6、应用抗生素进行有效抗感染的基础上使用噻唑烷二酮类药物罗格列酮，有协同作用，可明显提高有核细胞PPAR γ活性，使炎症一抗炎介质失衡有所改善。

【CN109938870A】一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型的建立方法及其应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910214737.6 (22)申请日 2019.03.20 (71)申请人 复旦大学附属华山医院 地址 200040 上海市静安区乌鲁木齐中路 12号 (72)发明人 宫晔　邓水香　朱宏达　冯圣捷　 田觅　金朋　 (74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272 代理人 俞涤炯 (51)Int.Cl. A61D 1/00(2006.01) A61D 7/00(2006.01) (54)发明名称 一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型 的建立方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种大鼠重症脑出血合并脓毒 症复合模型的建立方法，其包括：大鼠注射麻醉 后，断尾取血匀速注入右侧尾状核，获得脑出血 大鼠模型；脑出血大鼠模型制备成功后，采用盲 肠结扎穿孔法获得重症脑出血合并脓毒症复合 模型。本发明还涉及上述复合模型在制备预防/ 治疗重症脑出血合并脓毒症的药物中的应用。本 发明成功构建了重症脑出血合并脓毒症复合模 型，更好的模拟临床重症脑出血并发感染以及脓 毒症的临床表现，为进一步探索重症脑出血合并 感染和脓毒症的发病机制和干预措施提供理论 基础；并将其具体应用于治疗重症脑出血+脓毒 症的药物的筛选，对防治重症脑出血合并感染和 脓毒症的发生及后期的康复治疗及预后具有重 要的意义。权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109938870 A 2019.06.28 C N 109938870 A

权　利　要　求　书1/1页CN 109938870 A 1.一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一、脑出血大鼠模型的制备； 大鼠注射麻醉后，断尾取血匀速注入右侧尾状核，留置预定时间，缓慢拔针，防止反流，获得脑出血大鼠模型； 步骤二、重症脑出血合并脓毒症模型的制备； 步骤一的脑出血大鼠模型制备成功后，大鼠注射麻醉后仰卧固定，腹部手术区域皮肤杀菌后铺无菌孔巾，沿正中线剪开皮肤、肌肉、腹膜后牵出盲肠，以无菌丝线测量盲肠全长后取该段丝线对折处所对应的盲肠部位以无菌丝线结扎，扎紧前将盲肠内容物向降部挤压，扎紧后用无菌不锈钢针沿结扎远端肠管外侧缘穿刺两孔并将穿刺针来回抽动后退出穿刺针；轻轻挤压结扎盲肠降部，挤出少量粪质后将肠管还纳腹腔，确认腹腔内无活动性出血后以无菌丝线逐层缝合腹壁，获得重症脑出血合并脓毒症复合模型。 2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，大鼠采用10％水合氯醛320～380mg/kg腹腔注射麻醉，其断尾取血量为50～180ul，其血液注入方法为：2次注入法，先注入一半，留置8～12min后，再注射另一半血量；注入完成后，留置12～18min后拔针。 3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，所述右侧尾状核的注入位置为：前囟中线旁开2.8～3.2mm，冠状缝前0.8～1.2mm，深度5～7mm。 4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，在拔针后，采用骨蜡封闭颅骨创口，缝合头皮，局部皮肤用复合碘消毒液消毒，防止局部感染。 5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，在脑出血模型制备成功20～28h后制备重症脑出血合并脓毒症复合模型。 6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤二中，大鼠采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉；皮肤杀菌采用安尔碘涂搽；无菌不锈钢针的尺寸为外径2～4mm，其来回抽动的次数为2～5次。 7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤二中，腹壁缝合完毕后，即刻注射生理盐水15～25毫升/千克体重于大鼠后腿根部皮下。 8.根据权利要求1～7中任一项制备的大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型在制备预防和治疗重症脑出血合并脓毒症的药物中的应用。 2

高脂血症资料

实验动物学综述 题目：《高脂血症动物模型的探讨》姓名：张阳慧 学号： 2010109118 院系专业班级：硕2010级12班生理学任课老师刘政江老师 付建华老师

高脂血症动物模型的探讨 张阳慧综述司军强?审校 （石河子大学医学院民族高发病与地方病教育部重点实验室电生理研究室石河子 832002） 摘要：随着生活水平日益提高,高脂血症( hyperlipidemia) 发病率在逐年升高,大量流行病学调查和研究均表明,高脂血症是导致动脉粥样硬化(AS) ,冠心病、糖尿病等多种疾病最重要的的危险因素之一。高脂血症已经成为研究热点,但至今尚未明显突破,除了其他原因外,理想的动物模型(animal model) 制备可能也是制约其发展的重要原因。在研究高脂血症的模型动物中,有野生型、自然缺损和基因修饰的,动物种类包括大鼠、小鼠、兔、金黄地鼠、豚鼠和小型猪等。本文就对先天性、化学物质诱导的和转基因动物模型作一综述,为研究高脂血症的模型选择提供依据。 关键词: 高脂血症; 动物模型; 文献标识码: A Discussion on the animal model of hyperlipidemia Yanghui Zhang, Si Jun-qiang? （Division of Electrophysiology, Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Shihezi University Medical College, Xinjiang Shihezi, 832002） Abstract:With the increasing standard of living, hyperlipidemia incidence has increased year by year, a large number of epidemiological surveys and studies show that hyperlipidemia is a cause of atherosclerosis(AS), coronary heart disease, diabetes and the risk factors of other important disease . Hyperlipidemia is the hot point in the medicine field, but has not been broken through. Besides other reason, the experimental animal models play an important role in the study of the disease. In the study of animal models of hyperlipidemia, there are wild-type,natural defects and genetic modification, the animal species are including , rats, mice, rabbits, hamsters, guinea pigs and small pigs. To provide information for the choice of the animal models for the study of hyperlipidemia, congenital,chemical - induced and transgenic models were introduced in the review. Key words：hyperlipidemia ; animal model； 高脂血症( hyperlipidemia) 又称脂质代谢紊乱或异常, 是导致脂肪肝、动脉粥样硬化等多种疾病的重要因素。随着发病率的持续增加, 高脂血症的病因学、预防和治疗依然是医学界研究的热点。然而至今药物治疗尚未取得明显突破, 究其原因, 除了其它因素而外, 高脂血症动物模型的制备也可能是影响该类药物发展的重要原因之一, 因此, 选择理想的高脂血症动物模型是推进高脂血症研究进程的关键。本文就近年来高脂血症动物模型的研究概况作一综述, 为该领域的研究者正确合理选择高脂血症动物模型提供依据。 1常见高脂血症模型动物的种类及特点 1.1 大鼠建立大鼠高脂血症模型, 方法简单, 成本适中, 采血量较大, 可以满足一次做多种指标, 且模型建立的方法最多。更重要的是大鼠的食性与人类相似, 所形成的病变与人类早期病理改变相似, 且适应性较强, 是目前国内研究脂质代谢最多的实验动物。但大鼠有对抗动脉粥样硬化形成的能力, 不宜作为抗动脉粥样硬化药物

代谢综合征大鼠模型的建立

代谢综合征大鼠模型的建立 【关键词】代谢综合征 代谢综合征（metabolic syndrome,MS）是一种涉及多种代谢异常、与心血管病紧密联系的疾病状态，其中以肥胖（超重）、血压、血糖和血脂异常四项为突出，MS患者DM风险增高5倍，CVD风险增高3倍，心血管死亡率增高2倍，总死亡率风险增高1．5倍［1］。因此，研究代谢综合征的防治对于降低上述疾病的死亡率非常重要，而实验动物模型的建立是该研究工作的重要前提。 1 实验材料 1.1 实验动物选用离乳健康性Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，雌雄各半，体重49～70g，普通清洁级，购自山东中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20050015。 1.2 动物饲料基础饲料为山东中医药大学实验动物中心提供普通清洁级动物饲料，高脂高热量饲料参照文献［2，3］改进，配方为：普通饲料56%，猪油10%，白糖10%，奶粉10%，蛋黄12%，豆粉2%。白糖为山东省东方糖业有限公司生产的天园牌优级绵白糖，批号为GB1445，奶粉为内蒙古伊利实业集团股份有限公司生产的全脂甜奶粉，批号为81211F3，猪油、蛋黄、豆粉均由市场购买。两种饲料组成及营养成分见表1。 1.3 主要试剂与仪器 Olypus Au2700全自动生化分析仪（日本东芝公司生产），奥林巴斯诊断产品有限公司提供的血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇试剂盒，批号：

OSR6121。电子天平YP600型（上海精科天平仪器厂），电子动物称（北京六一仪器厂），高速台式离心机TDL-5型（上海安亭科学仪器厂）。 2 实验方法 2.1 分组喂养离乳SD大鼠100只，随机分为2组：对照组20只（雌雄各半）给基础饲料，高脂组80只（雌雄各半）给高脂高热量饲料喂养。大鼠实验期间均自由摄食和饮水，饲料和水每日更换一次，饲养环境清洁，自然光照，温度20～25℃，湿度50%～70%，通风良好，共喂养8周。表1 两种饲料组成及营养成分表（略） 2.2 代谢综合征大鼠的筛选标准饲养8周后，称体重，量身长，计算Lee’s指数，公式为 3 体重（g）×103/体长（cm）。以高脂组体重超过对照组平均体重加1.96倍标准差为模型大鼠。 2.3 血糖和血脂检测对照组和筛选后符合标准的MS模型大鼠禁食禁水12h，尾静脉取血，分离血清，全自动分析仪上检测血糖、血脂，包括血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLc）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLc）。用Dobiasova 等［4］的方法计算血浆致动脉硬化指数（atherogenic index of plasma，AIP）：AIP=log［TG／HDLc］。 2.4 统计学处理各组数据用均数±标准差（x±s）表示，分别对雄性模型组和雄性对照组，雌性模型组和雌性对照组进行独立样本的t检验（Independent-Samples t test），用SPSS14.0软件进行统计分析，以P＜0.05作为差异有显著性检验水准。 3 实验结果 3.1 实验动物的体重、身长、Lee’s指数比较用两种不同的饲

脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究

脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究 摘要】目的应用基因芯片技术初步分析脓毒症大鼠肝脏组织细胞基因表达谱的 变化。方法健康Wistar 大鼠40 只，随机分为模型组和假手术组，每组各20 只。通过盲肠结扎穿孔术（CLP）制备大鼠脓毒症模型，应用含有22523 个大鼠基因cDNA 克隆的表达谱基因芯片进行检测，筛选差异表达基因，用计算机软件分析 脓毒症大鼠肝脏组织术后24 小时的基因表达变化。结果与假手术组比较，共筛 选出差异表达基因共285 条，占基因芯片总点数的1.26%，其中已知基因180 条，93 条基因表达上调，87 条基因表达下调。涉及到一系列与细胞生长调节相关基因，物质能量代谢相关基因，信号转导、炎症、应激反应相关基因，转录调控及 蛋白质翻译、修饰、加工、降解相关基因等相关的基因异常表达。结论脓毒症导 致的多脏器功能不全（MODS）是多种基因作用的结果，采用基因芯片技术全面 揭示脓毒症肝脏基因表达的模式，有利于发现新的研究目标和治疗途径。 【关键词】脓毒症肝基因表达基因芯片 【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）08-0053-03 脓毒症(Sepsis) 及其所导致的多脏器功能不全（MODS），在临床上发病率高，病死率高，临床救治棘手，源于其发病机制非常复杂。目前多数认为是过度的炎 症反应与代偿性抗炎反应失衡，出现免疫系统功能紊乱的病理生理过程，并与机 体多系统、多器官病理生理改变密切相关，涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织 损害等一系列基本问题[1]。国内外已有学者运用基因芯片技术对经C L P 或腹腔 注射脂多糖制备小鼠脓毒症模型的多个脏器组织的基因差异表达分别进行研究， 其结果初步显示了这些组织中部分基因表达的特异性改变，但并未对脓毒症机制 和治疗的研究提出新的看法。本实验再次运用基因芯片技术研究分析脓毒症时肝 脏相对应的基因表达谱变化，旨在进一步探讨脓毒症的研究治疗新途径。 1 材料和方法 1.1 实验动物及模型制备 雄性健康Wi s t a r 大鼠40 只，体重180 － 220g，购自上海斯莱克实验动物 有限公司。实验前在清洁级环境下饲养2 周，常规饲料喂食、正常饮水。按随机 数字表法分组：假手术组（n ＝ 20 只）、模型组（n ＝ 20 只）。模型组：采用 盲肠结扎穿孔术（CLP）方法建立大鼠肠源性脓毒症模型。实验前大鼠禁食过夜，自由饮水，称体重后以氯胺酮（100mg/ kg）腹腔麻醉固定，消毒铺巾，沿中下腹正中线切开2cm 开腹提出盲肠，7 号丝线距盲肠根部1c m 处血管弓内结扎盲肠；用9 号无菌针头刺穿盲肠3次，使肠内容物流出，避免伤及肠系膜血管，然后将 盲肠放回腹腔，缝合腹部切口。假手术组：不结扎和穿刺盲肠外，其余操作同CLP组。两组术毕皮下注射平衡液5ml/kg以补充术中丢失的体液并抗休克治疗， 术后正常饮食、自由饮水。 1.2 肝组织的留取和处理 两组大鼠（n＝40只）24h断颈活杀迅速开腹摘取肝脏，置入液氮罐中骤冷保存，温度－70℃，备用。 1.3 基因芯片杂交及检测分析 用一步法总RNA提取试剂（Trizol）抽提液氮中肝组织总RNA。反转录并标记探针，与RatRef-12大鼠表达谱基因芯片(由联合基因技术有限公司制作，每个芯 片含有22523个大鼠基因cDNA克隆)杂交过夜，洗片、晾干后扫描，采用Scan

炎调方干预脓毒症大鼠模型的效果研究

炎调方干预脓毒症大鼠模型的效果研究 发表时间：2019-09-23T16:25:49.893Z 来源：《医师在线》2019年5月9期作者：张燕婷1 朱佳琳1 李淑芳2 熊旭东2 [导读] 目的探讨炎调方对脓毒症大鼠的作用机制。张燕婷1 朱佳琳1 李淑芳2 熊旭东2通讯作者（1上海三林康德社区卫生服务中心，中医科；2上海中医药大学附属曙光医院，感染科；上海200000）摘要：目的探讨炎调方对脓毒症大鼠的作用机制。方法将SD雄性88只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、炎调方组、对照组(炎调方减去大黄、芒硝)，采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型。术后分别于12h、24h、36h致死大鼠，测定血清IL-1β水平及观察各组肺病理切片的变化。结果血清方面：假手术组与正常组相比，血清IL-1β水平无统计学意义(P>0.05)；与正常组相比，12h模型组的血清IL-1β水平与24h的血清IL-1β水平比较升高 (P<0.05)；造模后12h炎调方组血清IL-1β水平和模型组对比，有显著降低(P<0.01)，差异在24h 无统计学意义(P>0.05)；对照组(炎调方去掉大黄和芒硝)与模型组对比，12h和24 h均无统计学意义(P>0．05)；炎调方组血清IL-1β水平和对照组对比在12 h水平显著降低(P<0.01)，24 h但是未见明显差异(P>0.05)；肺病理切片方面：正常对照组及假手术组肺组织未见明显病理 学损伤性变化。CLP术后12h,模型组的肺组织轻微充血，CLP手术后24h，与12h对比，模型组肺组织损害更甚，充血更明显，减方对照组肺组织病变情况较模型组无明显改变。炎调方组和模型组相比，病变范围略小。结论炎调方能明显下调脓毒症大鼠血清IL-1β水平，并且能减轻脓毒症大鼠肺组织损伤。 关键词:炎调方脓毒症肺病理切片脓毒症（sepsis）是指由感染导致的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS），进一步发展可以成急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和脓毒症休克（septic shock），甚至可导致多脏器功能障碍综合征（MODS）[1]。严重的脓毒症患者和脓毒性休克目前仍然是作为ICU内患者死亡的主要原因，其病死率达2８％~５０％。脓毒症一直以来都作为危重病、急救医学领域临床和基础科研的难点和热点 [2]。本研究是通过经典的盲肠结扎穿孔(CLP)术制作脓毒症大鼠模型，以通腑活血法治疗脓毒症，通过检测大鼠部分炎症介质变化和肺组织的变化及观察大鼠的死亡情况，进一步探讨并丰富炎调方对脓毒症干预的效果研究，为诊疗脓毒症疾病的发展提供研究证据。 1 实验材料 1.1动物来源与分组 88只雄性SD大鼠，购自上海中医药大学的实验动物中心，购回后所有大鼠均作适应性饲养一周后随机分为正常组、假手术组、模型组、炎调方组、对照组（炎调方减去大黄和芒硝）。 1.2 药物炎调方组：玄参l5g，当归15g，生大黄10g(后下)，芒硝10g(冲)，桃仁10g，赤芍15g。对照组：玄参l5g，当归15g，桃仁10g，赤芍15g。中药均由上海曙光西院中药房提供。按常规的煎煮方法来煎煮，最后将芒硝充分溶解于药液中，将药液浓缩为含生药1.0 g ／ml，放入4℃冰箱备用。对照组（炎调方减去大黄和芒硝）煎煮方法同前，药液被浓缩为含生药1.0g／mL，保存备用于4℃冰箱。 1.3 仪器 Multiskan MK3 酶标仪（赛默尔上海世飞仪器厂）；501C超级恒温水域槽（上海精宏实验设备公司）；台式离心机(microfuge lite)(Beckman 公司)；OLYMPLUS BH2 显微镜（PHILIP）；石蜡全自动切片机(德国CUT6062切片机)；低温冰箱（-70℃）(Forma scientific公司)。 2 方法 2.1 脓毒症模型的制备 参照相关文献[3-5]，采用盲肠结扎穿孔(cecal ligationand puncture，CLP) 法制造脓毒症大鼠模型，实验鼠术前禁食12小时，腹腔注射2﹪的戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，安尔碘消毒皮肤，沿中下腹做大约1.5cm的切口，提出盲肠，用4号线把盲肠根部结扎，将18号针把盲肠穿通3次后将肠还纳于腹腔，并逐层缝合皮肤。术后注射生理盐水（30mg/kg）于皮下抗休克。待麻醉清醒后可自由活动、喝水、进食。假手术组仅仅切开腹腔并翻动肠道，不去结扎穿刺，剩下的操作同模型组。 2.2 分组按随机方法将实验大鼠分成5个组，正常组8只，麻醉并腹主动脉取血和肺部组织后处死；假手术组8只，麻醉后开腹翻动肠道，关闭腹腔，12h后麻醉并腹主动脉取血和肺部组织后处死；模型组24只，CLP术后12h、24h、36h分别麻醉然后腹主动脉取血和肺部组织后处死，每个组各8只；炎调方组，将炎调方于术前灌胃（9.9g/kg），每天一次，连续3天，灌胃3次后2h予以造模，CLP术后各时间点分别麻醉并腹主动脉取血和取肺部组织后处死，每个组各8只；对照组（炎调方减去大黄和芒硝）24只，该方造模前灌胃（9.9g/kg），每天一次，连续3天，灌胃三次后2h予以CLP造模，术后各时间点分别麻醉和腹主动脉取血致死，每组各8只。 2.3 标本采集与检测 腹腔注射2％戊巴比妥钠(40mg／kg)麻醉大鼠，安尔碘消毒皮肤后逐层开腹，予以腹主动脉抽血．取血后静置30min于室温下，离心（3000转／rain15min）后血清存于4℃冰箱，备测白细胞介素1β（IL-1β），然后快速打开大鼠左右胸腔，取出左右两边肺叶。切取左肺和右肺的病理组织，左肺固定于福尔马林10％液体，酒精极度脱水，石蜡包埋并切片，常规HE染色，在光镜下对比肺组织的变化。右肺迅速置于液氮中备用，然后转入-70℃冰箱冻存。 3 统计学方法统计软件用于SPSS 19.0，计量资料的数据以Mean±SD（x±S)来表示，采用单因素方差分析方法。（P<0.05是差异具有统计学意义） 4 实验结果 4.1 多组大鼠死亡情况观察实验中,实验鼠共死亡19只（其中模型组8只，炎调方组4只，减方炎调方组7只），进入后续实验共69只。正常组、假手术组大鼠活动无异常。模型组的手术之后都有脓毒症严重现象，如手术结束后清醒推迟，呼吸变快明显，腹部向下膨隆，精神不振，少动等现象，剖开腹腔发现脓血和浑浊性恶臭液体，肠管可见肿胀，肺部明显淤血，CLP+减方对照组大鼠与模型组相比未见明显变化。CLP+炎调方组大鼠精神明显好于CLP组，术后表现较轻。取材前，各组大鼠的死亡情况（只）(见表1)。正常组和假手术组全部存活，模型组12h,24h分别死亡2，5只（死亡率8.3％,3 5.7％），炎调方组12h,24h分别死亡1,2只（4.17％,13.3％），减方炎调方组12h, 24h分别死亡1,4只（4.17％,2 6.67％）。 4.2各组大鼠血清IL-1β的比较

脓毒血症动物模型具体步骤及说明

脓毒血症动物模型具体步骤及说明 原型物种人 来源盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症 模式动物品系SPF级SD大鼠，健康，雄性，体重为180g~200g 实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 实验周期2d 建模方法1. 称量大鼠，腹腔注射水合氯醛（350mg/kg）麻醉，腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。 2. 沿腹白线切开腹腔约2cm，找出盲肠，用5-0 缝线结扎约1/3盲肠，以21G针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。轻轻挤压使少量肠内容物从穿刺孔溢出确保通畅；将处理好的盲肠回纳入腹腔，用5-0 缝线缝合内层，3-0缝线缝合外层，将大鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。 3. 待大鼠苏醒后自由饮水，正常饲养。 4. 2d后大鼠水合氯醛钠麻醉后，于腹主动脉取血5ml，室温静止2h，4℃离心机3000r/min离心10min，分离出上层血清，置-80℃冰箱保存备用。处死大鼠，取出心脏、肝脏、肾脏、肺、小肠，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片(厚4um)，HE染色，观察病理改变，其余组织置于-80℃冰箱备用。 应用疾病模型

1.一般情况观察脓毒症组术后苏醒延迟，醒后精神萎靡，身体蜷缩，基本不活动，进食进水减少，对外界反应迟钝，呼吸频率加快，被毛蓬松少光泽，大便稀软，不再扎堆取暖。12h出现死亡大鼠，随着时间的延长大部分大鼠出现皮温低，肌力减弱，眼周血性分泌物，停止进食进水，排泄稀水样便，色黄，腥臭味。进一步发展出现呼吸急促，对被动仰卧无反抗，排泄物呈黏液状，量多，最终死亡。剖腹可见恶臭味血性渗液，肠管水肿黏连，盲肠坏死变黑。 心脏：光镜下结果比较，对照组大鼠心肌肌纤维结构排列紧密、无水肿、充血及渗出。模型组心肌肌纤维结构排列疏松，带状空泡化，细胞核肿胀，间质水肿、充血。 肝脏：肝有大量空泡脂肪样变性，肝细胞肿胀并有炎性细胞浸润。 肺：模型组肺间隔增厚，部分肺泡组织结构被破坏，炎症细胞浸润。 肾：可见肾皮质及间质水肿伴大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞均有肿胀。空泡变性，坏死脱落。肾小管囊腔扩张、管型形成。皮髓质境界欠清晰，肾小球收缩、毛细血管微血栓形成 小肠：模型组小肠粘膜水肿、白细胞浸润、出血和上皮细胞坏死脱落。 血浆中炎症因子增加是脓毒症的典型特征之一,IL－1β、TNF－α及IL－6 是主要的促炎症细胞因子，在脓毒症模型后显著升高。

大鼠脓毒症模型

大鼠盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症模型脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatoy response syndrome，SIRS)，临床上证实有致病菌侵袭存在或有高度可疑的感染性病灶，临床中多以常见并发症出现在重度感染、大面积烧伤、严重创伤或大手术术后的危重患者当中。脓毒症一旦发生，进展迅速，短时间可由全身炎性反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、脓毒症进展为重度脓毒症(severe sepsis)(合并器官功能不全)、脓毒症休克(septic shock)(并发充分液体复苏亦无法纠正的低血压)及多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，以上三者可贯序发生，亦可同时发生，严重危及患者生命，产生极高的致死风险。虽然目前已经有许多动物模型用来复制脓毒症，但盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症的啮齿动物模型仍然是目前应用最广泛的脓毒症动物模型。 1.实验动物 SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为180g~200g 2.实验分组 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 2d 4.建模方法 1.称量大鼠，腹腔注射水合氯醛（350mg/kg）麻醉，腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。 2.沿腹白线切开腹腔约2cm，找出盲肠，用5-0缝线结扎约1/3盲肠，以21G针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。轻轻挤压使少量肠内容物从穿刺孔溢出确保通畅；将处理好的盲肠回纳入腹腔，用5-0缝线缝合内层，3-0缝线缝合外层，将大鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。 3.待大鼠苏醒后自由饮水，正常饲养。 4.2d后大鼠水合氯醛钠麻醉后，于腹主动脉取血5ml，室温静止2h，4℃离心机3000r/min离心10min，分离出上层血清，置-80℃冰箱保存备用。处死大

SD 大鼠脓毒血症

大鼠脓毒血症建立方法 SD 大鼠, 体重190～270 g ,雌雄均有, 禁食24 h 后进行实验。用2.5 %戊巴比妥钠按1 ml/ kg 体重, 腹腔注射麻醉大鼠, 随机分为实验组和对照组(假手术组) 。常规消毒腹部, 在下腹部正中央切口, 长约2 cm , 打开腹腔寻找盲肠, 小心分离其远端与大肠的系膜, 盲肠内如有粪便, 则把粪便小心挤向相连的大肠, 实验组在盲肠远端1/ 2 处用无菌4 号丝线紧紧结扎, 并用无菌7 号针头在已结扎盲肠远段中央处贯通穿刺。然后把盲肠推回腹腔, 关闭腹腔, 逐层缝合。对照组仅做开腹分离盲肠远端与大肠的系膜及关腹手术。术后按50 ml/ kg 体重皮下注射生理盐水, 补充手术中丢失的体液, 连续观察24h , 整个实验过程中在室温22～25 ℃环境进行并让大鼠自由饮水。在盲肠结扎前、结扎后8 h、16h、和24h 在无菌条件下取大鼠尾血1 滴进行细胞培养, 实验组还在无菌条件下取腹腔渗出液少许进行细菌培养。 用结扎整个盲肠加穿刺的方法可复制出动物的理想败血症模型, 因为动物模型血液细菌培养阳性, 培养出来的细菌与感染灶细菌完全或部分相同, 动物表现与临床败血症类似, 重复性好, 模型复制后有一定的存活时间供研究之用。有人把结扎整个盲肠改为结扎盲肠1/ 2 , 把穿刺盲肠2 次改为贯通穿刺盲肠, 操作更为简便, 效果也令人满意。 造成盲肠缺血坏死, 自身肠道的细菌进入腹腔造成感染。血液培养显示, 在CL P 后16 h , 血液已有大肠杆菌及绿脓杆菌生成, 与腹腔渗出液细菌培养结果相同; 培养出的菌种与报道略有不同, 这可能是由于大鼠来源及实验室的条件不同造成的。 实验组动物术后24 h 活杀, 见盲肠结扎的远端已发生坏死, 穿刺的针孔明显, 腹腔感染, 有臭味的渗出液,但腹腔未见粪便, 这与人类阑尾穿刺并发腹膜炎等疾病过程相似。大鼠盲肠结扎加穿刺引起的败血症存活情况与结扎盲肠部分的多少, 穿刺针孔的多少和大小有关。针孔多, 针孔大, 死亡率高。上述结扎整个盲肠并用9号针头刺孔2 个, 24 h 有75 %大鼠死亡。有人结扎1/2 盲肠并用7 号贯通穿刺, 24 h 无大鼠死亡。另外,饲养动物环境也是影响动物存活率的重要因素。有人曾在室温30 ℃时, 饲养CL P 大鼠5 只, 结果在24 h内全部死亡。

脓毒症动物模型的选择与评价

脓毒症（Ｓｅｐｓｉｓ）作为急危重症领域的棘手难题，日益引起临床医师及科研工作者的关注。近十年来，现代生物科技的飞速发展极大地促进了人们对脓毒症发病机制的认识，并推动了脓毒症治疗措施的改进和更新。其中，脓毒症动物模型的应用对此起到了十分重要的作用。脓毒症动物模型的不断发展也反映了人们对脓毒症本质的认识正在逐渐深入，总结和分析现有动物模型，对于如何建立更贴近临床实际的脓毒症动物模型、合理设计实验以及准确解释动物实验数据都具有重要意义。 １ 应用脓毒症动物模型的意义 在过去的几年中，人们对感染后炎症反应分子机制的研究已取得显著进展，其中很大部分是利用体外观察的方法对细胞生理学研究的成果。应明确的是，尽管体外实验的手段先进而且方便，但要更好地了解脓毒症时体内炎症反应的发生、发展过程和其他病理生理变化，还需采用临床相关的脓毒症或脓毒性休克动物模型进行深入的探讨。 一般认为，利用动物模型进行脓毒症研究具有以下优点。 １．１　在进行具有高度创伤性的操作或进行器官离体实验时只能使用动物模型。特别是在研究脓毒症的病理生理变化时通常需要采集组织标本（如肝、肺、肾等），而这些标本很难从临床获得。只有利用动物模型才可能方便地采取脓毒症各个阶段的组织标本。 １．２　临床脓毒症病因较复杂，难以判断其确切的发病时间。很多患者还伴有其他严重的非相关疾病。并且，临床的脓毒症患者通常接受多种支持治疗，这些治疗不可避免地会影响对脓毒症自然病程的观察。因此，直接探讨人类脓毒症的病理生理机制相当困难，而采用动物模型进行实验则可免受上述因素的干扰。 １．３　由于临床脓毒症患者的遗传学背景非常复杂，加之患者年龄、性别、同时存在的其他疾病以及支持治疗等因素均可导致临床资料的高度变异性。而要控制这种变异只能靠加大样本量，这无疑将会耗费更多的时间并给临床脓毒症试验带来很大的经济压力。由于动物模型的生物学差异较人类要小，因此所需的样本量也明显少于临床观察。 １．４　在探讨脓毒症的发病机制时经常要使用一些药物或试剂（如某种细胞因子的抗体或拮抗剂等），这些制剂可能具有毒性或未经过临床的安全性检验不能用于人体。因此，只有采用动物模型才能方便地利用这些制剂来了解脓毒症发病的分子机制。除此之外，应用脓毒症的动物实验模型还可对药物进行临床试验前的筛选。 由此可见，在探索脓毒症发生、发展机制的过程中，选择适宜的脓毒症或脓毒性休克动物模型进行体内研究仍具有不可替代的地位。 ２ 脓毒症动物模型的选择及其局限性 大量的临床及实验研究资料表明，尽管在过去十几年中有关脓毒症发病机制的认识已取得较大进展，但对于脓毒症治疗和新药开发方面的研究却不容乐观。许多新的干预脓毒症制剂虽然在动物实验中表现出很好的应用前景，但其在临床ＩＩ期和ＩＩＩ期试验中均未取得显著的临床疗效，甚至反而加重疾病的程度。迄今为止，严重脓毒症或脓毒性休克的死亡率仍高达５０％左右。造成这一现象的重要原因之一即是在药物应用于临床前的动物实验观察中所 脓毒症动物模型的选择与评价 姚咏明（解放军总医院野战外科研究所 解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所，北京，１０００３７） ＹＡＯ　Ｙｏｎｇ－ｍｉｎｇ 作者简介 姚咏明（１９６５－），男，湖 北人，医学博士后，教 授，博士生导师。主要从 事创伤休克、脓毒症和 多器官功能障碍综合征 发病机制及防治的研究。 现任解放军总医院野战 外科研究所副所长、中 国微生物学会微生物毒 素分会副主任委员、中 国中西医结合急救医学 分会常委、中国灾害防 御协会救援医学会常务 理事等职。

脓毒血症

重症脓毒血症治疗的理论基础 文章来源： 2006-7-24 11:35:13 重症脓毒血症治疗的理论基础 肾脏病与透析肾移植杂志 1999年第6期第8卷基础医学 作者：孙启全王金泉 单位：南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所 (南京，210002) 关键词：脓毒血症；器官衰竭；治疗 脓毒血症是一种由感染引起的临床综合征，伴有下列征象：体温高于或低于正常，白细胞增多或减少、心动过速、呼吸急促或每分钟通气量异常升高，如临床上出现其中两项或两项以上症状，即可诊断脓毒血症［1］；当伴发器官功能衰竭，即称为重症脓毒血症（severe sepsis）。美国每年有50万名脓毒血症患者，存活率仅55％～65％。近年来在大量临床及实验研究的基础上，人们对脓毒血症有了许多新的认识，针对脓毒血症的检测手段有了提高，抗感染治疗、支持治疗有了很大改善，使脓毒血症患者的死亡率有所下降。本文就近年对脓毒血症的发病机制及重症脓毒血症的治疗综述如下。 1 脓毒血症的发病机制 正常情况下当微生物入侵人体，机体免疫防御系统会作出迅速而恰当的反应；然而，当免疫防御能力缺陷、反应过高或过低，都可以通过内源性致炎物质导致脓毒血症的发生和发展。早期起关键作用的是细胞因子，在内毒素刺激下，单核细胞产生炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF）和白介素-1（IL-1），这些炎症因子能促进中性粒细胞与内皮细胞粘附，激活凝血系统，释放大量的炎性介质，包括其它细胞因子、白三烯及蛋白酶等，同时也产生抗炎性介质如IL-6、IL-10等（附图）。IL-1和TNF二者有协同作用，具许多相同的生物学效应。对脓毒血症动物模型研究表明，抑制IL-1和TNF可以改善器官功能并能提高存活率［2］。IL-8能够趋化中性粒细胞，导致炎症迁延不愈。IL-6和IL-10可能起负性调控作用，抑制TNF的产生，增强急性时相反应物质和免疫球蛋白的作用，抑制T淋巴细胞和巨噬细胞的功能。但在众多的临床研究中，仅一项研究提示TNF 的浓度改变具生理学效应，可以影响免疫级联反应下游的细胞因子水平［3］。 花生四烯酸代谢产物与脓毒血症的发生及发展有关，动物及临床试验已经观察到，环氧化酶抑制剂（布洛芬）通过抑制上述物质的产生可以降低体温、减慢心率、减少每分钟通气量和纠正乳酸中毒，但并不能降低死亡率［4］。进一步证实血栓烷A2（收缩血管）、前列环素（扩张血管）

脓毒血症大鼠模型建立

CLP致脓毒血症大鼠模型建立 一、实验目的 利用CLP技术建立脓毒血症大鼠模型 二、实验原理 脓毒血症患者最常见的感染源来自腹腔且易造成腹腔感染，所以腹腔感染模型是目前最常见的动物模型。鼠类盲肠结扎穿刺（CLP）是临床研究脓毒血症常见模型，是模仿腹腔脓毒血症感染的临床过程，引起多菌群感染，最终导致脓毒血症。 三、实验材料和设备 成熟期雄性Sprague-Dawley大鼠，体重400-500g。 外科手术器械：手术台，手术刀，刀片，剪刀，刮毛器，镊子，止血钳，持针器，缝皮针，1号线，4号肠线，18g针头，血管夹，医用胶布，PE50导管（厂家），探针，硬膜外穿刺针，肝素帽，留置针，注射器（规格）。 实验药品：1.5%戊巴比妥钠，2%利多卡因，丁苯诺啡，75%酒精，碘伏，肝素钠（10000U），蒸馏水，生理盐水。 四、实验方法和步骤 1.购买SD大鼠，适应性饲养1周，自由饮水，饮食； 2.术前禁食12小时； 3.称重以1.5%戊巴比妥钠40mg/kg（4%水合氯醛 0.1ml/10g抽取麻药，一般3-5分钟起效，可以维持1小时左右。），腹腔注射（先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。），麻醉大鼠，止血钳夹小鼠脚趾确定麻醉深度； 4.将大鼠背位固定于手术台上，剪去颈部和腹部被毛； 5.取血导管的制备：取PE50导管约15cm，一侧剪契口，另一端平口，对楔面要进行简单打磨处理,以防表面粗糙划破血管外壁。抗凝处理是将导管用装满肝素钠的注射器灌流、冲洗,保证导管每个部位都充分接触肝素钠。 6.颈静脉置管术： a.用碘伏常规消毒颈部，铺无菌手术单。 b.于胸锁乳突肌连线中点起向颈部垂直延伸15mm,做皮肤切口约1.5cm，暴露皮下结缔组织，用血管钳逐层钝性分离至显露颈静脉(特征是在胸廓入口处，有轻微搏动，直径2～4 mm)，2%利多卡因3-5滴局部浸润1min，完全游离一段长1-1.5cm血管，血管夹分别夹闭远心端和近心端，血管下穿过两根1号线。 c.在游离颈静脉中间部位，用镊子提起血管壁，全层剪一“V”形小口，约占静脉的1/3。预先植入探针，再将导管沿切口缓慢送入静脉切口，轻轻开放近心端的血管夹，将导管植入2.5-3cm，可见有血回流或回抽有血。1号线结扎固定导管，松紧适宜，再次回抽，确定导管在血管内，结扎远心端，开放远心端血