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免疫组化

免疫组化.txt花前月下,不如花钱“日”下。叶子的离开,是因为风的追求还是树的不挽留?干掉熊猫,我就是国宝!别和我谈理想,戒了!免疫组化非特异性染色及控制方法
一、非特异性染色的识别

常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处,坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性,均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

二、非特异性染色的原因

1. Ig与Fc受体结合

多见于冰冻切片(特别是淋巴造血组织,淋巴细胞,单核细胞,组织细胞表面多),主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体,所以石蜡切片不多见。

避免方法:

(1)用以二抗相同种族的正常血清封闭切片;

(2)用不含Fc段的抗体,但价格贵。(V区,C1区不含Fc段,用Pepsin消化)

2. 静电吸附

抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。

避免方法:

(1)尽量稀释一抗;

(2)降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;

(3)用去垢剂如triton-100,Tween-20等处理切片。

3. 二抗与组织中的Ig结合

如羊抗兔的二抗,二抗可以标本中(人)Ig发生交叉反应,科学上越接近的动物,交叉反应越明显,如人与猴,兔与豚鼠。

避免方法:用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。

4. 组织中残存醛基与Ig的结合

如醛类固定后未能彻底的冲洗,残留醛基可以和Ig结合。

避免方法:

(1)彻底冲洗;

(2)0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗。


免疫组化基本原理
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
众所周知,抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性,即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物,制备特异性抗体,再用这种抗体(第一抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体,并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,将抗原放大,由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此,还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来(常用显色剂DAB显示为棕

黄色颗粒)。通过抗原抗体反应及呈色反应,显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一,包括荧光抗体和荧光抗原技术,具有抗原抗体反应的特异性,染色技术的快速性,在细胞或组织上定位的准确性,以及荧光效应的灵敏性等优势。但是,由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜,荧光强度随时间的延长而逐渐消退,结果不易长期保存等缺点,在普及应用上受到一定限制,而逐渐被免疫酶法所取代。
免疫组化实验步骤
1 仪器设备
(1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉;
(2)水浴锅

2 试剂
(1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。
(2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。
(3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
(4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
(5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
(6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
(7)封裱剂:
a 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合;
b 油和TBS(或PBS)配制。
(8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。

3 操作流程
(1)脱蜡和水化
脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟;
2)无水乙醇中浸泡5分钟;
3)95%乙醇中浸泡5分钟;
4)70%乙醇中浸泡5分钟;



(2)抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1)抗原热修复
在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲

液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

2)煮沸热修复
电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10~15分钟。

3)微波热修复
在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。适用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。

4)酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。



(3)免疫组织化学染色
SP法
1)脱蜡、水化;
2) PBS洗2~3次各5分钟;
3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟
4)PBS洗2~3次各5分钟;
5)抗原修复;
6)PBS洗2~3次各5分钟;
7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8)滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10)PBS洗3次各5分钟;
11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室温静置,或37℃1小时;
12)抗中可加入0.05%的tween-20。
13)BS洗3次各5分钟;
14)DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度;
15)PBS或自来水冲洗10分钟;
16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;
17)自来水冲洗10~15分钟;
18)脱水、透明、封片、镜检。



SABC法
1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。
4) 抗原修复。
5) PBS洗5分钟。
6) 滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
7) 滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。
8) PBS洗三次每次2分钟。
9) 滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂SABC,20℃~37℃20分钟。
免疫组化的经验总结
1 固定:最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片,甲醛固定有时比冰冻丙酮好;但对于不同的组织和抗原,可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较

适合而推荐的固定液,请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液:饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织的穿透力较强,固定较好,结构完整,但因偏酸,对抗原有一定损害,且组织收缩明显,不适于组织标本的长期保存。
PLP液:即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛,适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2.组织脱水,透明:时间不能太长,否则在切片时容易碎片,切不完整。
3.切片时展片:有些组织在切片后难以在水中展开,这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4.烤片:60℃ 30分钟或37℃ 过夜,温度太高或时间太长,抗原容易丢失。
5.蜡块及切片的保存:最好在4℃保存
6.脱片问题: Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂,6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液,适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行,可用双重处理(APES和Poly-L-Lysine)的切片。在以上两种条件都行不通的情况下,可用如下方法:切片在脱蜡前,放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分钟,晾干,即可进行下一步。
7.灭活内源性酶:HRP系统:3%双氧水灭活;AP系统:3%HAc灭活。
8.暴露抗原:对于石蜡切片的免疫组化实验时,必须采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9.封闭:在山羊血清封闭,非特异性染色仍然较强时,可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10.抗体稀释:应遵循“现用现配”的原则,对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11.背景高:在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下,如果背景依旧高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特别是在显色之前要多洗。
12.返蓝:在苏木素复染后,可用碱性缓冲液(如PBS)或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13.显色:一定要在显微镜下观察,注意控制背景。 DAB法 显示过氧化物酶〔原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中,下面反应不直接发生:AH2(供氢体) H2O2→A(供氢体的氧化物) 2H2O2实验可知,有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶――底物(受氢体)复合体生成,在复合体最后分解为酶和水时,游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质,如奈酚和联苯胺。免疫组化染色步骤(以ABC法为例)溶液的配置:1. 0.

1M PBS 2000ml:NaCL 18g, NaH2PO4?2H2O 0.8g, Na2HPO4?12H2O 12g. 共六份2. 柠檬酸盐缓冲液:贮存液:0.1M柠檬酸溶液(A):21.01g 柠檬酸 1L 蒸馏水0.1M柠檬酸三钠溶液(B):29.41g 柠檬酸三钠 1L 蒸馏水工作液:9ml A液 41ml B液 450ml 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液3. 0.03% H2O2-甲醇:30% H2O2 0.4ml 400ml 纯甲醇→充分混匀4. 20% 甘油:80ml 纯甘油 320ml 蒸馏水5. 稀释抗体:1?U300 ,1?U400 ,1?U600 (临用前配)6. 酒精的配置 染色步骤:一步法1. 载玻片 烤箱中 60℃ 40′。2. 二甲苯Ⅰ,60℃ 20′(水浴箱中),二甲苯Ⅱ,室温 15′。3. 脱水,100%→95%→85%→75%酒精,每级均为3′。4. 蒸馏水冲洗,PBS 5′?~15. 微波炉修复抗原:0.01M 柠檬酸盐缓冲液,99℃ 肺 20′,心肾 12′6. PBS 3′*37. 0.03% H2O2-甲醇,室温20′8. PBS冲洗,PBS 3′*3,甩干或纸巾吸去多余液体(勿碰到组织),PAP Pen划境线。9. block solution 封闭抗原,室温10′。10. 倾出封闭液,不洗,滴加一抗(60ul),4℃过夜或37℃ 1~2h。11. PBS冲洗,3′*3。12. 除去PBS,滴加A增强剂,室温25′。13. PBS冲洗,3′*3。14. 除去PBS,滴加B剂,室温35′。15. PBS冲洗,3′*3。同时配置DAB显色剂。16. 除去PBS,DAB显色10′(在显微镜下观察染色程度控制染色时间)。蒸馏水冲洗。17. 复染:苏目素均匀滴加2滴,40′′,蒸馏水冲洗,60℃温水泡半分钟。18. 脱水:75%酒精→85%→95%→100%(3次),每级3′。19. 透明:二甲苯Ⅰ3′,二甲苯Ⅱ3′。18. 封片:中性树脂,加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡),60℃ 0.5h烘干。 结果:棕褐色反应产物代表抗原X的定位。拍照1. 更换样品时,除了调整焦距和视野外,显微镜上的其他部件都不能动!所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中,不要一会用高倍镜,一会用低倍镜,来回切换物镜。2. 数码相机必须设置为手动曝光,并且保持每张照片用同样的曝光条件,同样的曝光时间,同样的光圈。特别要注意的是,一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉3. 免疫组化切片一般染色不太深,因此拍摄出的照片颜色较浅,就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色,一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄,也不偏蓝。
免疫组化染色注意事项
免疫组化染色方法已不是什么很难的问题,操作步骤简单也易掌握,但要染好免疫组化,其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事,但最基本的应从以下方面加以注意:
(1) 去除内源酶及内源性生物素 
一般

我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织,其中自身含有一定量的内源酶和内源性生物素,而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的,酶的作用是催化底物,使显色剂显色,而组织中的内源性酶同样也能催化底物,使其显色,这就影响免疫组化的特异性,所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活,以保证免疫组化染色在特异性情况下进行。
1) 去除内源酶 
常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。但在含有丰富血细胞的标本中,由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶,能与过氧化氢反应,出现气泡现象,易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响,但用3%过氧化氢的方法,能够去除大部分内源性酶,即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应,但由于其形态结构与组织细胞不同,也易鉴别,而且此方法比较通用易操作,但应注意过氧化氢的浓度不能过高,一般为3%一5%,时间不宜过长,最好室温10min。
2) 去除内源性生物素 
在正常组织细胞中也含有生物素,特别是肝、脾、肾、脑,皮肤等组织中,在应用亲和素试剂的染色中,内源性生物素易结合卵白素,形成卵白素一生物素复合物,导致假阳性,所以在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min,使其结合位点饱和,以消除内源性生物素的活性。
3) 灭活碱性磷酸酶 
最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6~8.2,能除去大部分内源性碱性磷酸酶,对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。
(2) 抑制非特异性背景着色 
非特异性着色最常见的情况是抗体吸附到组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分上,而出现背景着色,为了防止这种现象,最好用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理,以封闭荷电点,不让一抗与之结合,但这种方法一般实验室很难实现,一般常见实用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min即可,但应注意此种结合是不牢固结合,所以最好不要冲洗,倾去余液直接加一抗,对于多克隆抗体来讲,易产生背景着色,在稀释特异性抗体时可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。
(3) 缓冲液 
免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记,抗原抗体最适合的pH值为7.2~7.6,最常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸缓冲液(PBS)。简易配法:5000ml蒸馏水中分别加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采

用碱性磷酸酶(AP)作为标记物底物的方法时可以用0.02mol/L TBS pH8.2缓冲液比较好。
(4) 抗原修复 
经甲醛固定的部分组织细胞,可使免疫组化标记敏感性明显降低,这是因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此,在染色时,有些抗原需先进行修复或暴露。
抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法,常用胰蛋白酶及胃蛋白酶,配制浓度与消化时间要适度。常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。在选用这三种加热法时,浸泡切片的缓冲液的离子强度和PH值、加热的温度和时间均影响着抗原修复效果。目前最常用的修复方法有如下凡种:
1)胰蛋白酶(Trpsin)
主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为0.1%,37℃作用10min。
配法:0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(无水)水溶液中溶解后即可。
2)胃蛋白酶(Pepsin)
主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%,37℃作用30min。
配法:0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。
3)热引导的抗原决定簇修复(Heat Induced Epitope Retrieval,HIER) 
HIER对大多数的抗体有益,尤其是对核抗原的修复作用更加明显,最常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液,它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。抗原修复液的pH值非常重要,有效的抗原修复pH值要比修复液的化学成分更重要,同样的修复液随着pH值的升高染色的强度逐渐增强,但最佳pH值范围为6.0~10.0,对于大多数抗原这个范围的pH值都能进行有效的修复,有些抗体(如Ki-67、ER)则在pH值l.0~3.0和6.0~8.0更为有效。作为通用修复液碱性pH值的修复液要比酸性的有效,而对固定很长时间旧的存档组织,酸性pH值的修复液则优于碱性的修复液,所以两种抗原修复液可作为相互替补的进行抗原修复。在进行HIER过程中应防止切片的干燥,加热时必须达到规定的温度,保温时间要足够,对于一些不要抗原修复的抗体最好不要采用HIER处理,否则对染色无益,但有些抗体则需要利用多种修复联合应用。
HIER方法有
1)水浴加热法 
将脱蜡人水后的切片放人盛有修复的容器中,放人加热煮沸水中,当修复液温度达到95℃左右时计时l5min,自然冷却,PBS洗3min×3次。
2)微波加热法 
将切片放入修复液中微波加热使温度在96℃左右,计时l0min,在微波炉中停留2min,室温自然冷却,PBS洗3min×3次。
3)高压加热法 
将修复液在高压锅中煮沸,切片插在染色架上,放入锅

中(要使修复液淹没切片)开始喷气时盖上压力阀。计时2min,冷水冲至室温取出切片,PBS洗3min×3次。
(5) 显色 
免疫组化染色的显色是最后的关键问题,一般辣根过氧化物酶(HRP)的检测系统选用DAB或AEC显色系统进行显色。但要得到最佳的显色效果,必须在镜下严格控制,以检出物达到最强显色而背景无色为最终点,尤其DAB显色时间短着色浅,时间长背景又深,都将影响结果判断,根据经验DAB在配制完后最长宜放置30min以内,过时不能使用,DAB加到组织切片时作用时间最长不宜超过10min(最好在5min内),否则不管有无阳性都应终止反应。对一些含有内源性酶较高的组织用DAB显色时极易出现背景色更应尽早在镜下控制,以达到最佳的分辨效果(棕色)。AEC显色系统(红色)的弊端是易溶于有机溶剂,所以封片时应以水性封片剂为主,同时染色的切片也不能久存。
如果是碱性磷酸酶(AP)最好选用NBT/BCIP作为显色系统(结果染为蓝黑色)。
(6) 结果判断 
免疫组化的结果判断有两种方法:
一是对以检测结果阳性细胞指数来定性(如核抗原的标记),判断方法是以一个视野中的阳性细胞数与总细胞的百分比,再取10个相同视野算取平均指数。
另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定,一般阳性细胞数在0~25为阴性,25~50为十,50~75为十十,75以上为十十十。此种判定方法容易出现人为误差现象。
有条件的实验室最好能用图像分析系统进行结果检测定量分析更为准确。一切的判定方法都是力求使免疫组化染色结果判断更标准,但各单位采取的标准不尽相同,所以判断标准化问题还有待长期实践中病理学术界商讨判定标准。
IHC中常见的抗原表达模式有以下几种:
1)细胞浆内弥漫性分布,多数胞浆型抗体的反应如此,如细胞角蛋白(cytokeratin,CK)和波形蛋白(vimentin)等;
2)细胞核周的胞浆内分布,其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚,如CD3多克隆抗体的染色;
3)胞浆内局限性点状阳性,如CDl5抗体的染色;
4)细胞膜线性阳性,大多数淋巴细胞标记的染色如此,如CD20、CD45RO;
5)细胞核阳性,如Ki-67及雌、孕激素受体蛋白ER、PR等。一种抗体可同时出现细胞浆和细胞膜的阳性表达,如EMA可呈膜性和胞浆内弥漫性阳性反应;CD30抗体可同时呈膜性和胞浆内点状阳性反应等。
(7) 对照片的设置
免疫组化的质量取决于正确使用各种对照,没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照包括阴性对照、阳性对照和自身对

照。在实践中可用染色组织切片中不含抗原的组织作为阴性对照,而用含抗原的正常组织作阳性对照,这种自我对照具有节约的意义。观察染色结果时,先观察对照组织的结果,如阳性对照组织中阳性细胞呈强阳性,阴性对照细胞呈阴性,内源酶阴性,背景无非特异性染色时,表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误,待检组织中的阳性细胞也就是可信的正确结果。 免疫组化染色中对照片的设置非常重要,它是判断您的染色是否成功的关键依据,而且也是检测每一个抗体的质量标准,常设的对照如下,一般实验最常用的只选第二种方法。
1)空白对照(阴性对照) 第一抗体由PBS或非免疫血清取代。
2)阳性对照 用已知含有要检测抗原的切片作阳性对照。
3)回收实验阴性对照 已知抗原与相应的第一抗体混合,发生结合沉淀,再用此沉淀抗体复合物进行免疫组化实验,结果为阴性。
4)替代对照 用于第一抗体同种动物的血清或无关抗体代替第一抗体结果为阴性。
5)自身对照 在同一切片上,应将不同组织成分中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性,vimentin可以间质细胞,对照desmin以血管壁及肌束为对照,S-l00蛋白以小神经末梢为对照等,如果应为阳性的组织是阳性,则免疫组化技术正确,如为阴性,则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。




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