SNP分型

1、测序方法

这个是最原始的，也是最简单的（操作简单，工作量不小啊！）一种方法，估计各位都明白，就不再累述了！

2、Taqman探针法

Taqman探针法可是一种无敌的方法，可用于基因荧光定量分析、甲基化检测、SNP分型、miRNA定量分析等等，差不多只要能用到的分子检测技术都有Taqman的身影。Taqman探针法SNP分型技术的核心就是特异性的MGB探针技术，已证实的Taqman探针，3·段结合MGB技术，能更好的进行等位基因的区分。MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验。这种超强的稳定性可使短至13个碱基的探针提高错配的辨别力，并为困难多变的序列设计提供更高的灵活性。所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团（NFQ），它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。

Taqman探针法还有个好处据说AB公司能提供数以万计的现成探针，只要你付得起钱就可以了，什么可将illumina SNP芯片上的所有SNP位点都检测一遍。

Taqman探针法的缺点就是探针购买太贵，一般他们的试剂盒是1500人份的，价格可以咨询AB公司在国内的总代！1000份左右标本，几个位点用Taqman还是蛮核算的。

3、Beckman SNP genomestream技术

Beckman技术的特点就是单碱基延伸法，设计时每个位点共设计3条引物，2条是扩增引物，1条为单碱基延伸引物（这个引物也可理解为探针）。现在Beckman探针法可做到48重（也就是一次检测48个SNP 位点），引物及探针的设计可以直接提交给Beckman（这点同Taqman，不赚你，赚谁啊！），他们帮你有偿设计啊！

Beckman的技术比较适合恰好有12个位点，48个位点检测，假如你的只有几个位点，或者恰巧不是12或48的倍数时，这个就有些不合算了！另外标本量不能太低，Beckman检测采用384板，一两百个样本那就算了吧！

4、SNPshot

SnaPshot技术平台是Applied Biosystems,ABI公司推出了专为检测SNP 设计的分析软

件和试剂盒可对多个SNP 位点同时进行基因分型,也被称为minisequencing 。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot 反应后,产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper 分析,可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。这个平台是建立在3730，3130等PCR测序仪上的技术。

应用SNaPshot 进行定点的序列分析,其基本原理遵循了DNA 直接测序中的双脱氧终止法,所不同的是PCR 反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP 位点的引物3′端都紧靠SNP点,因此每一种引物在聚合酶作用下,根据模板的的序列,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统,检测延伸的那个核苷酸的种类。

5、SNP芯片法

Illumina公司在这方面可谓最强劲的，现在Illumina SNP芯片有650K，1100K，在样本够大的情况下，保证您能筛到满意的结果！！当然价格也是比较贵点的！

记住我的一句话吧，超过300个位点就不用其他的技术了，直接上芯片吧，那样即省时，又省力，10个位点以内，标本又不大的情况下的建议采用测序吧！其他的方法可根据经费情况定夺了！！

SNP与基因型和疾病表型之间的关系

SNP与基因型和疾病表型之间的关系3 随着人类基因组计划精确序列图的完成,功能基因的克隆与鉴定、人类基因组多样性的研究也提到日程,而这些研究的进行将依赖于精细和精确的遗传标记的选择和应用。在人类基因组计划研究的历史上,RF LP(restriction fragment length polym or2 phism)和STR(short tandem repeats)作为上两代遗传标记,在物理图和遗传图的构建、序列草图的拼接和装搭过程中曾起到决定性的作用。但这些遗传标记依然存在多态性不高、无法摆脱电泳分型、难以实现大规模检测和自动化、难于进行基因判定等缺点。1996年由美国的https://www.wendangku.net/doc/b211695793.html,nder提出了并称之为“第3代遗传标记”的“单核苷酸多态性”(single nucleotide polym orphism, S NP)。S NP即以基因组序列中一个核苷酸的变异而导致DNA序列的变化(多态性)为基础。由于所有遗传多态性的分子基础均为核苷酸,因此S NP在密度上有可能达到人类基因组多态位点数目的极限。S NP与RF LP和STR等DNA标记的根本不同,是不再以长度的差异作为检测手段,而直接以序列的变异作为标记;在理论上,S NP有可能在核苷酸水平上,把序列图、物理图与遗传图最终有机地整合、统一起来;在技术上,S NP可以完全摆脱电泳分型的瓶颈,而采用最新的非电泳分型技术等。以下就S NP与基因型和疾病表型之间的关系作一简介。 1　鉴定SNP 发现核苷酸的变体不是一件困难的事情,每天,许多分子遗传学家在他们的研究工作中会不经意间偶然发现。直接地S NP发现可采取对一个有一定规模的基因组并行测序的战略,如对Y染色体;或在看似候选基因的基因内寻找,如心血管疾病、炎症性疾病和Ⅱ型糖尿病等复杂性遗传病。然而,一些生物信息学小组正在应用“in silico”中储存的序列资料寻找S NP。 C.Lee描述了EST数据库如何提供了成千上万个个体的表现度,通过序列比对,使编码S NP的发现成为可能。同样的数据采集方法已经被用于重叠BAC的克隆。这种日积月累的结果使在S NP数据库(dbS NP)和人类基因组数据库(HG BASE)已有超过二百万个候选S NP。现在的任务是证实这些已发现的S NP,即由于序列错误、重复区域和选择性剪接而产生假的S NP变体。此外,由于这些S NP来自世界不同的人群,还有如下未完成的工作要做:一方面,要确定S NP的等位基因频率;另一方面,要区别在某单一人群中特殊的S NP。 2　SNP的应用 涌向S NP发现和分析淘金热的心理起源于推测它们在两个方面的应用潜力。一方面是应用S NP探索复杂疾病的分子遗传学基础,另一方面是应用S NP进行基因自动分型的可靠性。推荐应用S NP多位点作图的方法用于病例———对照(case2con2 trol)研究,其目的是鉴定某一位点的特殊等位基因和某一特定表型统计学上的显著相关性。广泛的基因组相关性研究的设计依赖于人们关于变异的设想,即变异构成复杂性状的基础。一直争论的问题是H ome sapiens在“hominids”有限的遗传变异中是否不同寻常。然而,关于构成人类常见疾病表型的变异已出现两种相互竞争的学说,其正确的学说将指导研究设计。 (1)常见病Π常见变体(C DΠC V)学说:C DΠC V学说认为这些常见病的等位基因在地球的人类迁移以前已经存在,或者这些通过正选择的等位基因在一定程度上(以显著的比例)代表易感性等位基因。在现存的人群中,预测这些等位基因授予人群以中度的危险性,并在人群中出现相对高的频率(>1%)。它们出现的高频率意味着在大规模的人群中进行相关性研究对于鉴定危险性等位基因将是富有成效的。https://www.wendangku.net/doc/b211695793.html,nder(Whitehead Institute)引证了ApoE34等位基因的例子,该等位基因使对阿尔茨海默病(Alzheimer disease)的易感性增加;CCR52△32等位基因可防止被HI V-1感染。以上是在一些独立(特殊)的人群中产生一些常见变体的例子。在C DΠC V学说的指导下,现在主要的问题是要对公共变体库中的所有变体进行实验分析,或者对每一变体进行直接评价,或者对来自祖先的基因片段进行间接实验分析。从根本上说,目前通过环境导致变体的连锁不平衡度(LD)的研究方法是有限的。在大多数群体中,一个大样本的群体模型预测靠近共同变体的显著的LD一般将不会跨越3kb的基因组。然而,最近以经验为根据的研究已经给出了一个非常乐观的理由,在一个有北欧血统的美国人群中跨越60kb的区域显示了显著的LD。在2001年10月出版的《Nature genetics》发表了一系列的论文,表明被重组热点所中断的大范围基因组区域的连锁不平衡是人类基因组的一个特征。通过代表性的S NP定义有限数量的常见单体型好象能解释大多数的单体型。提示:应用代表性的S NP进行相关性研究将鉴定与疾病易感性增加有关的常见的单体型,形成构建人类基因组单体型图谱的必要基础,即鉴定所有主要的单体型和它们特征性的S NP。 (2)常见病Π稀有等位基因学说(C DΠRA):另一方面,C DΠRV学说的支持者认为,他们没有理由预期大多数常见遗传病是由常见的等位基因引起的。该学说最近被正式接受,应用群体模型在疾病位点预期了广泛的等位异质性(不均一性)。A. Clark已经扩展了该学说的研究工作,表明在人口爆炸性增长和分散以后,人类常见病的99.9999%的突变已经出现。另外,许多研究者相信,在复杂的疾病中我们可预示有意义的位点和异质性。观察与孟德尔疾病类似的疾病,C DΠRA的支持者指出视网膜炎色素沉着和非症状性常染色体隐性耳聋的遗传和等位异质性,这些“简单”的孟德尔疾病带有多个已知位点和一系列的疾病等位基因。如果这个方案适用于常见病的研究,在不均一人群中进行广泛的基因组疾病相关性研究将是无效的。J. T erwilliger争辩说,采用远交人群的病例———对照研究,通过遗传(血缘)查找鉴定等位基因没有令人信服的根据。在上一年的一个评论中上述观点引起注意。J.T erwilliger断言,那些我们估计遗传和等位异质性较低的方法在家系和具有独特来历的人群研究中会始终得到应用。鉴于目前仅把构建人类单体型图谱计划的重点放在常见等位基因上,而在一定程度上,那些稀有等位基因也可以解释常见病,在分析远缘人群时单体型图谱将是有用的,可以减少不一致性。 3　回归到生物学 无论常见或稀有等位基因被证实与某一特殊疾病发病风险相关,对所有的研究者而言,下一步的研究策略是相同的:一旦鉴定某一单体型与对某一疾病的易感性相关,那些定义单体型的所有S NP将被作为候选的致病因素。在这一点上,S NP达到遗传学研究的极限,必须重新回归到生物学。研究策略方面,基因型和表型之间关系的阐明将是21世纪面临的最大挑战和重要任务之一。 3第四届单核苷酸多态性和复杂基因组分析国际会议(The fourth international meeting on single nucleotide polym orphisms and complex genome analysis) 顾明亮　摘译自:Challenges for the21st century.Nature G enet,2001,29:353-354 邱长春　审校 ? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. https://www.wendangku.net/doc/b211695793.html,

高通量SNP基因分型技术研究进展

10　Sheng W et al.J Virol,2003;77(6):3859 11　C ohen J I,et al.J Virol,1999;73(9):7627 12　Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7):1843 13　G ao Y et al.Oncogene,2002;21(5):825 14　T anner J E et al.J In fect Dis,1997;175(1):3815　Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19):5584 16　Brink AA et al.J Clin M icrobiol,1998;36(11):3164 17　Hayes DP et al.M ol Pathol,1999;52(2):97 18　zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745 (2002211201　收稿) 高通量SNP基因分型技术研究进展 方唯意综述　姚开泰审阅 中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078) 摘要　在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量S NP基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。 关键词　高通量;单核苷酸多态性;基因分型 单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的S NPs基因分型技术。在本文中,我们主要阐述高通量S NPs基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、DNA芯片/阵列分析法、微球法、MA LDI2T OF质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。 1　一步均质法 T aqman、Scorpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。T aqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。在反应起始,所有试剂和基因组DNA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。 2　焦磷酸测序Pyrosequencing 焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链DNA模板杂交,和各种酶包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。4种dNTP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP 的焦磷酸基团释放出来。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dNTP继续反应。焦磷酸测序最初作为DNA测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料

SNP基因分型的高通量方法

Chapter16 High-Throughput Methods for SNP Genotyping Chunming Ding and Shengnan Jin Abstract Single nucleotide polymorphisms(SNPs)are ideal markers for identifying genes associated with complex diseases for two main reasons.Firstly,SNPs are densely located on the human genome at about one SNP per approximately500–1,000base pairs.Secondly,a large number of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP genotyping.These SNP genotyping platforms serve different purposes since they differ in SNP selection,reaction chemistry,signal detection,throughput,cost,and assay flexibility.This chapter aims to give an overview of some of these platforms by explaining the technologies behind each platform and identifying the best application scenarios for each platform through cross-comparison.The readers may delve into more technical details in the following chapters. Key words:Whole genome association,fine mapping,single nucleotide polymorphism,copy number variation,haplotyping. 1.Introduction Single nucleotide polymorphisms(SNPs)are best known as genetic markers in disease-association studies to identify genes associated with complex diseases(1,2).However,SNPs are also used in many other clinically and biologically important applica- tions(3).A large variety of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP genotyping analysis.On the basis of the purposes of the study,SNP genotyping can be divided into two domains:whole genome association(WGA)and fine mapping(Fig.16.1).Most of the genotyping platforms can be classified accordingly.This chapter aims to briefly explain the principles behind various platforms which lead to a comparison of these platforms so that the readers will get a quick overview before delving into the technical details of some of these methods in the following chapters. A.A.Komar(ed.),Single Nucleotide Polymorphisms,Methods in Molecular Biology578, DOI10.1007/978-1-60327-411-1_16,aHumana Press,a part of Springer Science+Business Media,LLC2003,2009 245

高通量SNP基因分型技术研究进展

10Sheng W et al.J Viro l,2003;77(6):3859 11Co hen JI,et al.J Viro l,1999;73(9):7627 12Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7):1843 13Gao Y et al.Oncogene,2002;21(5):825 14Tanner JE et al.J Infect Dis,1997;175(1):3815Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19):5584 16Brink AA et al.J Clin Micro biol,1998;36(11):3164 17Hayes DP et al.Mol Patho l,1999;52(2):97 18zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745 (2002211201收稿) 高通量SNP基因分型技术研究进展 方唯意综述姚开泰审阅 中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078) 摘要在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量SN P基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。 关键词高通量;单核苷酸多态性;基因分型 单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的SNPs基因分型技术。在本文中,我们主要阐述高通量SN Ps基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、D N A芯片/阵列分析法、微球法、M A LDI2TO F质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。 1一步均质法 Taqman、Sc orpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。Taqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。在反应起始,所有试剂和基因组D NA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。 2焦磷酸测序Pyrosequencing 焦磷酸测序是对短到中等长度的D NA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链D NA模板杂交,和各种酶包括D NA聚合酶、A TP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。4种dN TP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNT P与引物的末端形成共价键,dN TP 的焦磷酸基团释放出来。A TP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成A TP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。A TP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dN TP继续反应。焦磷酸测序最初作为D N A测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料

三种SNP芯片介绍

SNP芯片的原理 Illumina的SNP芯片原理 Illumina的SNP生物芯片的优势在于： 第1，它的检测通量很大，一次可以检测几十万到几百万个SNP位点 第2，它的检测准确性很高，它的准确性可以达到99.9%以上 第3，它的检测的费用相对低廉，大约一个90万位点的芯片（每个样本的）检测费用在一、两千人民币 Illumina的生物芯片系统，主要是由：芯片、扫描仪、和分析软件组成。 Illumina的生物芯片，由2部分组成：第1是玻璃基片，第2是微珠。 这个玻璃基片，它的大小和一张普通的载玻片差不多大小，它起到的作用，就是给微珠做容器。 在这个玻璃基片上，通过光蚀刻的方法，蚀刻出许多个排列整齐的小孔。每个小孔的尺寸都在微米级，这些小孔是未来容纳微珠的地方。小孔的大小与微珠正好相匹配，一个小孔正好容纳一个微珠。 微珠是芯片的核心部分，微珠的体积很小，只有微米级。 每个微珠的表面，都各偶联了一种序列的DNA片段。每个微珠上，有几十万个片段，而一个珠子上的片段，都是同一种序列。 这些DNA片段的长度是73个碱基，而这73个碱基又分成2个功能区域。

靠近珠子的这一端的23个碱基的序列，被称为Address序列，它也是DNA片段的5'端。它是标识微珠的标签序列。标签序列，通过碱基的排列组合，得到许多可能，每种序列，就是相应微珠的身份证号码（ID号）。 DNA片段上离珠子远的那一端的50个碱基，也就是3'端的序列，被称作Probe序列，它的作用，是与目标DNA进行互补杂交。 一种Address序列，就对应了一种probe序列。它们之间有着一一对应的关系。 在Illumina生产芯片的过程当中，是把要做芯片的几十万种微珠，按设定的比例进行混合好，撒到玻璃基片上。微珠随机地落入基片的小孔当中，然后，通过检测芯片上每个小孔当中的微珠上的Address序列，就可以知道，这个小孔当中是哪种微珠。 又因为Address序列和Probe序列有着一一对应的关系，这样，也就知道了每个小孔当中，有哪种Probe。反过来说，也就知道了每种Probe分布在哪几个小孔中了。 所以，Illumina公司出厂的每一张芯片，都要跟一个“.dmap”文件。这个.dmap文件，标注了每一张芯片上，每一个微孔当中，分别是哪种微珠。 用户做完芯片实验，得到扫描数据后，要从Illumina的网站上下载这张芯片的对应dmap文件，然后才能解读这张芯片。 在一张芯片的一个反应（样本位）当中，每种珠子平均有约15颗或更多。 说完了Address序列的功能，接着我们来说Probe序列的功能。 Illumina的生物芯片扫描仪，是扫描2种（荧光）颜色的：红色和绿色。而碱基有4种：A、C、G、T，要用2种荧光颜色，在一次实验当中，就区分出四种碱基，就需要一些巧妙的设计。 在Illumina的SNP芯片Probe设计上，先把要检测的位点，分成2种情况。 第一种情况是比较简单的，我们先举例来说明。如果一个SNP位点的野生型是“G”，突变型是“A”，那么就设计一个探针。这个探针的3'端的最末一个碱基，就挨着这个SNP位点。在实验过程当中，目标片段通过互补杂交，结合到这个探针上，然后，加入四种带标记的双脱氧核苷酸。其中A、T两种核苷酸是用DNP（二硝基苯）来进行标记的。C、G两种碱基是用生物素来标记的。同时，加入聚合酶，聚合酶就会在探针的3’末端，加上一个双脱氧核苷酸，并同时捎带连上一个标记物。

SNP查找及SNP的几种研究方法

SNP位点的选择 1，如果是检测基因的所有已知的SNP，那么首先要去了解并查询到这些SNP位点，SNP 位点可以通过查询dbSNP数据库（https://www.wendangku.net/doc/b211695793.html,/SNP/）和TSC（The SNP Consortium）数据库（https://www.wendangku.net/doc/b211695793.html,/），可以获知基因及上下游邻近序列的SNP位点。 2，至于挑选的原则，可以介绍一下Hap Map的正规化标准： SNP Selection Criteria Category 1 "verified" This contains all SNPs for which we have allele frequency or genotyping data. This includes SNPs from the TSC allele frequency project, as well as SNPs characterized by JSNP. These SNPs were generated from those rs clusters in which at least one of the SNPs in the cluster contains genotype or allele frequency data and the minor allele must have been seen in at least two individuals. Category 2 "two-hit" These are true double-hit SNPs, produced in collaboration with Jim Mullikin and Sarah Hunt. A double-hit SNP must be seen twice, in two different DNA samples which must have produced two alleles. TSC trace data was only allowed to contribute one hit per allele because the individual source DNA for a trace could not be identified. Category 3 "jsnp-verified/perlegen-verified" This category contains two groups: SNPs that JSNP certifies are likely to be real based on manual inspection of their data (but have not been genotyped)，and SNPs that Perlegen verified independently. Category 4 "bac-overlap" These are SNPs from BAC overlaps that do not fall into category 1 or 2 above. 我的经验： 也可以从文献中查找，找好几个SNP位点，如果你样本量很大，那么很容易出有意义的结果。有以下三种方法可供选择： 1、提取EDTA抗凝全血中的DNA，荧光定量PCR法。用ABI的SNP分型试剂盒，只要你提供位点，买来试剂盒就上仪器，成本也不高，效果还可靠。 2、提取EDTA抗凝全血中的DNA，普通PCR扩增（需设计引物，可自己设计或者让公司设计），限制性内切酶分型（在引物设计的同时找到合适的酶切位点），分出基因型，统计SPSS 卡方检验 3、提取EDTA抗凝全血中的DNA，高分辨溶解曲线，一次性即可完成PCR扩增及基因分

SNP检测方法汇总

TaqMan SNP基因分型 技术方法： 此技术是由美国Life technologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型。 整个技术的示意图如下： 应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。尤其适合针对全基因组SNP 关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。 RFLP (多重荧光)SNP分型技术 已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。 技术方法： RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。现在我们用荧光标记其PCR引物，通过测序毛细管电泳来精确区分酶切片

MassARRAY技术SNP分析检测,SNP分型.pdf

Sequenom MassARRAY技术SNP分析检测 1.背景介绍 全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3 ×10E6个，是继微卫星之后，SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。 现在普遍认为SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试、肿瘤相关的基因组突变以及生物学的基础研究等。 应用领域 ◇群体遗传学研究（生物进化、遗传分析） ◇疾病相关基因研究（复杂疾病的易感性基因分析与基因定位） ◇环境因子易感基因的检出与病原体基因分析 ◇药物基因组学（药物开发与个体用药） ◇个体识别与法医鉴定 ◇生物医药研究（系统发育分析与病理分子遗传机理阐明） 2.技术原理及特点 Sequenom MassArray飞行时间质谱生物芯片系统是为基因组学研究提供兼顾灵敏度和特异性服务的中高通量技术平台，是目前唯一采用质谱法进行直接检测的设备。Sequenom Mas-sArray系统反应体系为非杂交依赖性，不需要各种标记物，实验设计灵活，更可实现高达40重反应，是目前市场上拥有最高性价比的检测系统。 技术特点 ◇高通量：一张芯片可对384个样本进行多重检测；每个体系最多可实现40重反应； ◇高性价比：每个SNP检测成本仅需5-6元（依据SNP个数及样本量而定）； ◇高灵敏度：分析所需样本量少（10ng），准确性>95%；检出率>90%； ◇高灵活度：一张芯片上样本数量和位置可随意选择、样本和位点检测匹配可随意选择。3.服务内容 服务内容 1.SNP检测/单核苷酸多态性检测； 2.病原菌筛查； 3.肿瘤、遗传病等基因突变检测；