转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证
转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证
一、农杆菌介导的棉花胚胎再生遗传转化体系
（一）实验方法
以W0为受体，将pC2-dsGFP、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH3、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP载体的农杆菌菌株，运用农杆菌介导法分别将目的基因转入棉花下胚轴，通过组织培养技术获得转基因再生株系。
嫁接试验采用根系发达抗病性强的海岛棉（海7124）的实生苗做砧木，接
穗是转化基因再生植株。
（二）实验步骤
农杆菌介导的棉花遗传转化分3步，转化、胚胎发生和植株再生。
1）种子脱绒：轧花后的棉花种子，烘干（40℃左右），用适当硫酸（H2SO4）脱去短绒，自来水洗掉种子表面浓硫酸，充分晾干；
2）种子的消毒处理：选取饱满棉花种子于无菌三角瓶中，无菌水冲洗一次，70%乙醇表面消毒种子30 Sec，弃去乙醇，加入30%过氧化氢（H2O2）于摇床振荡2-3 h，弃掉H2O2，无菌水冲洗种子3-5 次，保留少量无菌水浸过种子，存放28℃，18-24 h，待到种子破壳露白；
3）外植体制备：在无菌条件下，滤掉消毒过种子的无菌水，剥去种子种壳，接种于苗培养基（1/2MS）上，28 ℃黑暗培养（N）3 d，然后在28℃、3000-5000 Lx光照下培养(D/N＝16 h/8 h) 3 d。
4）农杆菌活化与浸染液制备：将-70℃保存的农杆菌载体菌株，取出冻融。
在固体LB平板培养基上（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）划线，28℃静止培养1-2天。平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体（Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养基（10ml）中，28℃振荡过夜，再按1%接种量转接入50mL新鲜培养基中（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养8小时左右，测定OD600为0.5左右。4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。然后用5mLMSB0（含100 uM/ml AS）液体培养基重新悬浮沉淀，再转入15-45mL的MSB0（含100uM AS）液体培养基，28℃摇床上培养至OD600为0.5左右，稀释培养液OD600 值0.3-0.7 时备用。
5）浸染与共培养：在超净台上使用手术刀切割茎段7cm左右，将下胚轴茎段浸泡于农杆菌侵染液中5-8 min，用灭菌滤纸吸干胚轴段菌液，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基上，用封口膜封口，22℃～25℃共培养2d。
6）下胚轴切段两端切口长出的愈伤组织直径大约0.5-1.0 cm时切下来单独继
代，愈伤组织块的直径大约2 cm时转移到胚性愈伤组织诱导培养基上。
7）转化组织从1个或几个细胞开始分裂，3-4个月即有蚕豆大小（直径2 cm 左右）。
8）愈伤在MSB上长到直径2cm左右，接种到MSB2诱导胚性愈伤，在MSB2上继代1-3次即会有胚性愈伤的出现。
9）待愈伤组织长到直径约2-3cm 时，将其从胚轴段切除，愈伤组织块转入相同的培养基增殖，可以有效的去除农杆菌和防止愈伤组织褐化现象。
10）当愈伤组织块直径达到7-8 mm 放入胚性愈伤诱导培养基中，在培养间常规条件下培养，每隔一个月左右转一次相同的培养基，2-6 次，到出现黄绿色或灰绿色，米粒状的胚性愈伤为止。
11）只要疑似分化就挑出来少许，分散继代到分化培养基上，在分化培养基上能生存的一般是胚性愈伤组织，而非胚性愈伤在分化培养基大多不能存活。
12）由胚性愈伤再生植株经历体细胞胚的形成、成熟、萌发和小植株的生长。经过10天左右的抗性胚筛选，将成活的胚性愈伤挑到瓶口包棉塞、使用透气瓶塞培养瓶里培养，促进胚状体的形成和萌发。
13）将萌发的小植株平铺接种到铺滤纸的培养基上，诱导成苗。小植株再转入大的三角瓶中（培养基同愈伤组织增值配方），无菌条件下取小植株2－3 片叶，小量法提取DNA，进行标记基因和目的基因的PCR 扩增，将阳性小植株嫁接温室。
14）在装有营养土的土盆中种上根系发达、抗逆性强的海岛棉或育成品种（抗病、植株旺盛），待棉苗3-5 片真叶时待用（称砧木苗）。用劈接法和插皮接法将转基因再生棉株嫁接到砧木苗上（吴慎杰等，2007）。
15）嫁接后的管理：嫁接后3-4d通气，即旋开瓶盖罩住瓶口2/3，以防接穗发霉，7 d去掉瓶盖，10-12 d揭瓶，15 d左右解绳成活。为了让其快
速生长，成活后用霍格兰营养液浇一次。
（三）农杆菌介导棉花下胚轴转化
利用优化了的陆地棉体细胞再生转化体系，以转化模式品种W0为受体，利用带有目的基因的农杆菌载体菌株EHA105与棉花下胚轴进行共培养后，经过一系列的组织培养再生过程，获得大量的转基因株系。
（四）实验结果
目前，转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1、pC2-dsGFP载体转基因抗虫棉获得再生植株的情况如下，后续实验还在进行中。pC2-dsPTTH3 ：已获得20个克隆，10个克隆已嫁接成苗，有2个克隆已经拿到T1代种子。
pC2-dsPTTH5 ：已获得30个克隆，有25个克隆已出大量小苗，20个左右克隆已嫁接，其中几个克隆已结铃。
pC2-dsJHAMT ：已获得61个克隆，35个克隆已出大量小苗，嫁接20个克隆，还有小苗待嫁接。
pC2-dsJHBP1：已获得15个克隆，12个克隆嫁接，有2个克隆已经拿到T1代种子，已南繁。
pC2-dsGFP ：已获得5个克隆，其中3个克隆均嫁接成活，收到T0代种子。
1. pC2-dsPTTH3
2. pC2-dsJHAMT
3. pC2-dsPTTH5
4. pC2-dsJHBP1
5. pC2-dsGFP
二．pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT 、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1转基因株系的分子检测结果
用CTAB 法提取转基因株系叶片的基因组DNA ，以目的基因的特异性引物
进行PCR 扩增。结果如下：
（注：各载体获得的转基因后代株系，具体实验还在进行中，后续将获得更
多克隆数，并进一步进行分子检测。所以，现获得检测结果没有具体统计。）
（一）pC2-dsPTTH3
T0代验证： 1为marker ；2为阳性对照；5为加水阴性对照； 3、4、6、7、8、9、
10、11分别为转基因不同株系
（二）pC2-dsPTTH5
T0代验证：1为marker；2为阳性对照；3为水阴性对照；4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16分别为转基因不同株系
（三）pC2-dsJHAMT
T0代验证：1为marker；2为阳性对照；3为加水阴性对照；4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18分别为转基因不同株系
（四）pC2-dsJHBP1
T0代验证：1为marker；2为阳性对照；13为加水阴性对照；3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、分别为转基因不同株系
T1代验证:1为marker；2为阳性对照；12为加水阴性对照；3、4、5、6、7、8、9、10、
11、13、14、15、16、17、18分别为转基因不同株系
（五）pC2-dsGFP
T0代验证：1为marker；2为阳性对照；8为加水阴性对照；3、4、5、6、7分别为转基因不同株系
三、转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1载体转基因棉花抗虫遗传性分析
（一）转不同世代pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉材料的抗性分离情况：
本实验将依据抗虫转化植株筛选和生物鉴定的结果，并根据田间生长情况和种子成熟状况，选择部分转化材料进行南繁，对其T2代(T1代自交获得T2代)、T3代(对T2代中的部分抗虫单株自交获得T3代)材料的抗虫性分离情况进行遗传分析。
（二）转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉不同发育时期抗虫性分析
本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt 杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。将分别于棉花苗期、蕾期和铃期取各种试验材料倒3位或倒4位展开叶，接棉铃虫初孵幼虫进行室内抗虫性生物检测。每材料接15管，每管接棉铃虫幼虫5头，重复3次。调查72h幼虫死亡
率及叶片受害面积。
（三）转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉相同时期不同器官的抗虫性分析
本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt 杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。于棉花生长花铃期分别取其棉叶、棉蕾、花瓣、(未成熟)棉桃等组织器官材料进行棉铃虫饲喂试验。不同组织器官(材料)均接虫30管，每管接入棉铃虫幼虫1头，重复取样3次。调查72小时幼虫死亡情况。
（四）不同龄期棉铃虫幼虫对转基因抗虫棉的敏感性分析
本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt 杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。于棉花生长蕾期分别取其倒3叶或倒4叶，并分别接入1龄、3龄、5龄棉铃虫幼虫进行抗虫棉抗性鉴定研究。每组试验安排30管，每管接入幼虫1头，设3次重复。调查72小时幼虫死亡情况及叶片受害面积
（五）转基因抗虫棉对不同世代棉铃虫的敏感性分析
本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt 杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。在第2代、第3代、第4代棉铃虫发生期间，分别以棉花叶片和棉蕾为试验材料进行抗虫性分析研究。每处理为15个样管，每样管接入棉铃虫3龄幼虫l头，设3次重复。调查72小时幼虫死亡情况。
（六）环境条件对转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉抗性的影响
本实验将以我国三大棉区以及沿海植棉区的某些特定或易变气候、环境条件，设计温度变化(突然升高、突然降低)、干早和水浸、盐碱等不同试验处理，以了解转基因抗虫棉对环境条件的敏感性。以转基因抗虫棉为实验材料，转 Bt 杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。
（1）温度处理试验
在温室内用花盆种植，温度的突然上升和突然下降处理在人工气候箱内进行。试验以正常温室条件下生长的棉花幼苗为环境对照处理，设20℃、30℃、
35℃、45℃恒温处理以及由20℃突然上升到30℃、35℃、40℃，稳定24小时;30℃突然上升到35℃、45℃，稳定24小时:45℃突然下降到35℃、30℃、20℃，稳定24小时;35℃突然下降到30℃、20℃，稳定24小时等不同处理。各处理光照强度、光照时间均保持一致。每材料接15管，每管接棉铃虫初孵幼虫5头，重复3次。调查72小时幼虫死亡情况。
（2）干早处理试验
在温室内用花盆种植。试验以正常条件下生长的棉花幼苗为环境对照处理，设水浸48小时、干旱(不浇水)72小时(3天)、120小时(5天)、168小时(7天)、216小时(9天)以及至叶片半萎蔫等几个不同处理。每材料接15管，每管接棉铃虫幼虫5头，重复3次。调查72小时幼虫死亡情况。
（3）盐碱处理试验
在温室内用花盆种植。试验以正常条件下生长的棉花幼苗为环境对照处理，设1%、2%、3%、4%、5%NaCI盐水等几个不同处理，以正常条件下自来水浇灌为对照，并分别在第3天和第7天取样。每材料接15管，每管接棉铃虫幼虫5头，重复3次。调查72小时幼虫死亡情况。
四、转基因棉花抗虫试验鉴定结果
对部分转化体进行抗虫鉴定的预实验，结果显示，与对照植株相比，在接种前期，转基因株系所接棉铃虫幼虫表现早期（接种1-2天）死亡严重。但是，实验数据量不足，需要重复性实验。转基因后代的抗虫性鉴定，有待进一步验证。
REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化
REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化 摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ｒｅｍｉ）技术介导的红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素b 作为抗性筛选标记，ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ、ｐｃｂ１００３、ｐａｎ７－１作为转化质粒，采用ｒｅｍｉ技术转化红曲霉。结果表明，用ｒｅｍｉ技术介导红曲霉转化时，质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ和ｐｃｂ１００３适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ｒｅｍｉ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍｌ时，每微克质粒可获得的潮霉素ｂ抗性转化子为２８００～３２００个；ｈｉｎｄⅲ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０ｕ；在质粒用量为８μｇ／１００μｌ时转化率最高。 关键词：红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（remi） ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｍｏ ｎａｓｃｕｓ anka ｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍ ｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ｒｅｍｉ），ｕｓｉｎｇｔｈｅｈｐｈｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒａｎｄｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，ｐｃｂ１００３ａｎｄｐａｎ７－１ａｓｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｆｕｎｇｕｓ
ｍ．ａｎｋａｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏｂｅｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｙｒｅｍｉ．ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｔｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｗｈｅｎｕｓｉｎｇｐｂｃ－ｈｙｇｒｏａｎｄｐｃｂ１００３ａｓｖｅｃｔｏｒｓ．ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｎｏｍａｔｔｅｒｉｆｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｏｒｎｏｔ．ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｒｅｄｕｃｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１×１０７～１×１０８ｍｌｗｅｒｅｆｉｔｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｍ．ａｎｋａ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒｗａｓ２８００～３２００ｉｎｄ．／μｇｖｅｃｔｏｒｄｎａ．ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｈｉｎｄｉｉｉａｎｄｖｅｃｔｏｒｄｏｓｅｗａｓ１０5～１２０ｕａｎｄ８μｇ／１００μｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
烟草遗传转化实验
烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入 工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时 称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制 鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的
微生物的遗传与变异
微生物的遗传与变异 遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。 遗传性：指世代间子代和亲代相似的现象； 变异性：是子代与子代之间及子代与亲代之间的差异。遗传性保证了种的存在和延续；而变异性则推动了种的进化和发展。 遗传型（基因型）：某一生物个体所含有全部遗传因子即基因的总和。它是一种内在潜力，只有在适当的环境条件下，通过自身的发代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。 表型：指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。 变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。 饰变：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。如粘质沙雷氏菌，在25℃培养时，可产生深红色的灵杆菌素，这是一种饰变，但当在37℃培养时，则不产生色素，再在25℃下培养时，又恢复产生色素的能力。 微生物在遗传学中的地位： ?个体微小，结构简单； ?营养体一般都是单倍体； ?易培养； ?繁殖快； ?易于累积不同的中间代谢物； ?菌落形态可见性与多样性； ?环境条件对微生物群体中每个个体的直接性与一致性； ?易于形成营养缺陷型； ?存在多种处于进化过程中的原始有性生殖过程。 对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且还为育种工作提提供了丰富的理论基础，促使育种工作向着不自觉到自觉，从低效到高效，从随机到定向，从近缘杂交到远缘杂交等方向发展。 第一节遗传变异的物质基础 遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。对此有着不同的猜测。直到1944年后，利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是DNA才是遗传变异的真正物质基础。 一、证明核酸是遗传物质的三个经典实验 （一）转化实验 ?发现者：英国人Griffith于1928年首次发现这一现象。 ?研究对象：肺炎链球菌S型和R型 ?过程：
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第五章微生物的遗传和变异 本章要点： 1.遗传变异的物质基础。 2.基因突变的特点和机制。 3.菌种如何选育及如何诱变育种? 4.基因重组。 5.基因工程的原理和操作步骤。 6.如何保藏菌种？ 5.1 基因对遗传性状的控制 5.1.1遗传和变异的物质基础DNA 遗传变异的物质基础曾是生物学中激烈争论的重大问题。1944年Avery等人以微生物为研究对象进行的三个经典实验有力地证实了核酸是遗传物质，基因是其信息单位，染色体是其存在形式。 一.证明核酸是遗传变异的物质基础的经典实验 1.转化实验 转化指A品系的生物吸收了来自B品系生物的遗传物质从而获得B品系的遗传性状的现象。转化现象是格里菲斯（Griffith）于1928年研究肺炎链球菌感染小白鼠的实验中发现，后经艾弗里（Avery）等于1944年证实的。 2.噬菌体感染实验 1952年，侯喜（A.D.Hershey）和蔡斯（M.Chase）为了证实噬菌体的遗传物质是DNA，用放射性同位素标记大肠杆菌T2噬菌体进行实验(图5-1)。 图5-1 噬菌体感染实验
3.植物病毒重建实验 1956年Fraenkel-Conrat等用含RNA的烟草花叶病毒进行了病毒(TMV)重建实验(图5-2)，证实了RNA是遗传物质。 图5-2 TMV重建实验 5.1.2 DNA的结构与复制 一.DNA的化学组成 DNA是一种大分子化合物，由4种核苷酸组成。每一种核苷酸又由碱基、脱氧核糖和磷酸3部分构成。4种核苷酸的差异仅在于碱基不同。在DNA中，4种碱基是；腺嘌呤 (adenine，A)、鸟嘌呤(guanine，G)、胞嘧啶(cytosine，C)和胸腺嘧啶(thymine，T)。脱氧核糖1位上的碳原子与嘌呤9位上的氮原子相连，5位上的碳原子与磷酸相连，就构成了4种不同的核苷酸。 二.DNA的双螺旋结构模型 1953年美国遗传学家沃森(James Deway Watson)和英国物理学家克里克( Francis Harry Compton Crick)根据英国晶体衍射专家维尔金斯(Maurice Hugh Frederick Wilkins)对脱氧核糖核酸的X射线衍射资料，以及碱基含量分析、键长键角资料、酸碱滴定数据等，提出了像麻花、油条一样扭在一起的DNA双螺旋结构模型（图5-3、5-4）。
烟草遗传转化实验
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等 放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养 基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
烟草遗传转化实验 实验目的 烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求： 掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。 实验原理 根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 实验器材 摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。 实验材料 植物材料：烟草无菌苗 农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系Protocol Introduction 1．水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源 3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1 ~ 获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼 13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5 ~ 独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻 对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻 见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻
微生物的遗传变异与育种答案
第七章习题答案 一.名词解释 1.转座因子：具有转座作用的一段DNA序列. 2.普遍转导：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象称为普遍转导。 3.准性生殖：是一种类似于有性生殖,但比它更为原始的两性生殖方式,这是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生的融合,它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子. 4.艾姆氏试验：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法 5.局限转导：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体的少数特定基因携带到受体菌中,并与后者的基因整合,重合,形成转导子的现象. 6.移码突变：诱变剂使DNA序列中的一个或几个核苷酸发生增添或缺失,从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变. 7.感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态. 8. 高频重组菌株：该细胞的F质粒已从游离态转变为整合态,当与F- 菌株相接合时,发生基因重组的频率非常高. 9.基因工程：通过人工方法将目的基因与载体DNA分子连接起来，然后导入受体细胞，从而使受体细胞获得新的遗传性状的一种育种措施称基因工程。 10.限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子的特定序列，并能在识别位点内部或附近进行切割的内切酶。
11.基因治疗：是指向靶细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 12.克隆：作为名词，也称为克隆子，它是指带有相同DNA序列的一个群体可以是质粒，也可以是基因组相同的细菌细胞群体。作为动词，克隆是指利用DNA体外重组技术，将一个特定的基因或DNA序列插入一个载体DNA分子上，进行扩增。 二. 填空 1.微生物修复因UV而受损DNA的作用有光复活作用和切除修复. 2.基因组是指一种生物的全套基因。 3.基因工程中取得目的基因的途径有_____3_____条。 4.基因突变可分为点突变和染色体突变两种类型。 5.基因中碱基的置换(substitution)是典型的点突变。置换可分两类：DNA链中一个嘌呤被另一个嘌呤所置换或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，被称为转换；而DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，被称为颠换。 6.诱变剂导致DNA序列中增添（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框发生改变，并进一步引起转录和翻译错误的一类突变称为移码突变。 序列通过非同源重组的方式,从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象,被称为转座.凡具有转座作用的一段DNA序列,称转座因子,包括原核生物中的插入顺序转座子和的Mu噬菌体. 8.把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下,死亡率可明显降低,此现象称为光复活.最早是1949年有在灰色链霉菌中发现.
目的基因的遗传转化
实验十目的基因的遗传转化 一、目的基因的表达载体构建 1. 实验目的 本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的，涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway 技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。此外，还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi（RNA interfere，RNA 干涉）进行基因功能研究进行试验指导。为从事相关领域的科学研究奠定基础。 通过本实验，要求学生理解和掌握Gateway 技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。 2. 实验原理 利用高保真聚合酶，采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点，然后将含有attB 位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合，之后转化E. coli。在两对att 位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体，融合载体随即分解成两个分子，重组位点在结构上重新分配，目标基因进入新的载体骨架，通过筛选阳性克隆，获得此重组产物，称为“entry克隆”。在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase酶混合，在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达（目标）载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体，形成表达（目标）克隆（图）。 Gateway技术构建植物表达载体原理 3. 仪器设备 微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。 4. 实验试剂 克隆全长基因，pDONR TM221 载体（Invitrogen，12535-019），目标载体（购自Invitrogen，
微生物 遗传变异习题
遗传变异 一、名词解释 1、基因型 2、表型 3、突变 4、突变型 5、饰变 6、普遍性转导 7、转化 8、细菌素 9、抗生素 10、突变率 11、光复活作用 12、准性生殖 13、野生型 14、原养型 15、营养缺陷型菌株 16、完全培养基 17、补充培养基 18、F+菌株 19、F-菌株 20、Hfr菌株
21、F'菌株 22、接合中断法 二、填空题 1、、和是证明核酸是遗传物质的三个经典实验。 2、细菌的质粒的种类很多，其中接合性质粒如，抗药性质粒如，产细菌素质粒如，诱癌质粒如，诱生不定根的质粒如，执行固氮功能的质粒如，降解性质粒如等。 3、细胞的平均突变率是。 4、选择性突变株可包括、和等，而非选择性突变株则可包括、和等。 5、、、、、和是基因突变的六个特点。 6、基因突变的自发性和不对应性曾有三个著名的实验予以证明，它们是、和。 7、点突变是由于碱基置换而引起的，和是两种具体机制。 8、诱发突变可分为三类，即、和。 9、紫外线对微生物的损伤，主要是产生，主要通过两种方式修复DNA的损伤，即和。 10、、、和是在DNA的切除修复
中参与的四种酶；参与光复活作用的酶则仅有一种。11、若利用紫外线诱变微生物，应在条件下进行操作，并在条件下培养。 12、常见的“三致”是指、和作用，是目前检出某试样是否有“三致”的简便快速高效的试验。 13、艾姆斯试验中用的菌种是，通过回复突变可以检测待测样品中的存在。 14、、和是与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基。 15、与营养缺陷型有关的菌株有三种：从自然界分离到的任何菌种的原始菌株称为，该菌株经诱变剂处理后所发生的丧失某酶合成能力的菌株称为，若再经回复突变或重组后的菌株称为。 16、、、和是筛选营养缺陷型菌株的四个环节。 17、、、和是四种从混合菌液中检出营养缺陷型菌株方法。 18、普遍转导与局限转导的主要区别在于：第一，普遍转导噬菌体是属于噬菌体，而局限转导噬菌体属于噬菌体；第二，普遍转导噬菌体能转移供体菌的基因，而局限转导噬菌体只能转移供体菌的基因。
烟草遗传转化体系的建立
本科生毕业设计（论文） （ 2015届） 农业与食品科学学院 题目：烟草遗传转化体系的建立 学号： 姓名： 专业班级： 2015 年 5 月18 日
本科生毕业设计（论文）诚信承诺书 我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）《烟草遗传转化体系的建立》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。 承诺人（签名）： 年月日
目录 本科生毕业设计（论文）.............................................................................................. 封1 本科生毕业设计（论文）诚信承诺书...................................................................................... 封2 1 前言. (1) 1.1 农杆菌介导法 (1) 1.2 基因枪法 (2) 1.3 PEG法 (2) 1.4 显微注射法 (2) 2 材料与方法 (3) 2.1 试验材料 (3) 2.1.1 植物材料 (3) 2.1.2 菌株和质粒 (3) 2.2 试验方法 (3) 2.2.1 农杆菌的制备 (3) 2.2.2 叶片表面消毒 (3) 2.2.3 预培养-侵染-共培养 (4) 2.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用 (4) 2.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定 (4) 2.2.6 根分化 (5) 2.2.7 炼苗-移栽 (5) 2.2.8 转基因植株的分子鉴定 (5) 3 结果与分析 (6) 3.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响 (6) 3.2 共培养时间对转化率的影响 (7) 3.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果 (7) 3.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响 (8) 3.5 转基因植株的分子鉴定 (8) 4 讨论 (9) 参考文献 (9) 致谢 (11)
百脉根稳定遗传转化方法
培养基配方 种子萌发（1/2×B5） B5 basal salts：0.775g 溶解定容到500ml； 用NaOH调PH至5.5，然后加入琼脂粉3g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 250 μl 共培养（1/10×B5） B5 basal salts：0.124g；溶解定容至400ml; 用NaOH调PH至5.5，分装成两个200ml； 121℃灭菌20min；4℃保存； 使用前加： 1000× B5 vitamin stock: 20 μl 6-BA（1 mg/ml）: 40 μl NAA（1 mg/ml）：10 μl MES(1M PH5.2): 1 ml AS(20mg/ml): 200 μl 愈伤组织诱导（1×B5） B5 basal salts：1.55g； 蔗糖：10g 溶解定容至500ml; 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶3g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 0.5ml 6-BA（1 mg/ml）: 100 μl NAA（1 mg/ml）：25 μl 头孢霉素（250mg/ml）：600 μl 潮霉素（100mg/ml）100 μl 芽诱导（1×B5） B5 basal salts：1.55g； 蔗糖：10g 溶解定容至500ml; 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶3g； 121℃灭菌20min； 冷却之前，加入4M (NH4)2SO4 625 μl 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 0.5ml 6-BA（1 mg/ml）: 100 μl NAA（1 mg/ml）：25 μl 头孢霉素（250mg/ml）：600 μl 潮霉素（100mg/ml）100 μl 根诱导（1/2×B5） B5 basal salts：0.775g 蔗糖：5g，溶解定容到500ml； 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶2.5g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 250 μl NAA: 25 μl YEB培养基（农杆菌用可能效果会好些）牛肉膏：2.5g 蛋白胨：2.5g 酵母粉：0.5g 蔗糖：2.5g MgSO4·7H2O: 0.25g 溶解定容至500ml，调PH至7.0； 试剂： 1M MES PH5.2 4M (NH4)2SO4 1 mg/ml 6-BA 1 mg/ml NAA 20mg/ml AS 250mg/ml Cefotaxime 100mg/ml Hygromycin B 以上试剂配好好过滤除菌 B5 B5 Basal salts 3.1 g/l (sigma) B5 vitamine (sigma) 1000×（无菌）
玉米遗传转化体系的研究进展
玉米遗传转化体系的研究进展 摘要：植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得使外源基因稳定表达的可育植株。玉米作为世界上主要三大粮食作物之一, 是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料,在世界经济乃至人类生存方面占据肴举足轻重的地位，所以它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视，至今对玉米遗传转化的研究已经取得了一些成绩，本文主要针对近年来玉米遗传转化技术所取得的重要进展进行论述。主要包括玉米转化受体系统、转化方法及其优点与存在的问题以及对未来的展望等几方面论述玉米遗传转化的研究进展。 关键词：玉米；受体系统；遗传转化方法 0 前言 近年来，随着环境着人口、资源、环境三者之间矛盾的加剧，转基因作物渐渐地进入人们的视野并且显得极为重要。玉米是重要的粮食、饲料，同时还是制药、淀粉、糖浆、油料、酒精工业的主要原料，在我国经济生产中占有非常重要的地位。所以玉米遗传转化的研究备受各国科学家的重视。自1988年Rhodes等首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米遗传转化技术得到了较大的发展[1]。不但许多有价值的基因转入玉米，而且转基因方法也出现了多样化，如基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等。随着转基因技术的发展与完善，更多的优良外源基因将被用于玉米的遗传改良，并且为阐述单子叶植物基因表达调控机理提供了新方法。 1玉米遗传转化受体系统的研究 1．1玉米基因转化受体体系应具备的条件是： 1 高效稳定的再生能力： 用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有稳定性和重复性。根据贾士荣等报道认为，用于基因转化的受体系统应具有80%-90%以上的再生频率，并且每块外植体上必须再生丛生芽，其芽数量越多越好，这样才有可能获得较高频率转化。 2 较高的遗传稳定性： 植物基因转化是将外源基因导入植物并使之整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状之目的，这就要求植物受体系统接受外源DNA后应不影响其分裂和分化并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传稳定性，尽量减少变异。
小麦遗传转化技术的研究进展
X X 学院 本科毕业论文 小麦遗传转化技术的研究进展 所在学院 专业名称 申请学士学位所属学科 年级 学生姓名、学号 指导教师姓名、职称 完成日期
摘要 摘要 最近几年小麦遗传转化方法的研究发展快速。自报道第一株转基因小麦以来，小麦转基因育种研究取得了很大的成就。转基因技术实现的小麦遗传转化进一步补充了经典小麦育种的不足，可利用基因库的限制被有效的降低了，取得了可喜的进展。为了实现小麦转基因工程育种更好更快的发展，人们尝试了利用基因枪、花粉管通道、超声波、离子束注入、激光穿刺和农杆菌介导等方法转化小麦。经过十多年的努力，研究者对小麦转基因技术的研究取得了实实在在的进展。目前，基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法是主要的小麦遗传转化方法，研究涉及小麦各种抗性、品质改良、提高产量等方面。本文介绍、比较，分析了小麦遗传转化的主要方法，包括其基本原理、优缺点及其影响因素，以期通过本文人们能更好的了解小麦遗传转化技术及其进展，促进其持续改进和提高。 关键词：小麦，遗传转化，基因枪法，农杆菌介导法，花粉管通道法 Ⅰ
Abstract ABSTRACT In recent years wheat genetic transformation method developing so fast.Since the first reports of transgenic of wheat, wheat transgenic breeding research has achieved great things.Wheat genetic transformation of transgenic technology to further complement the classic deficiencies of the wheat breeding, effectively reducing the restrictions on the use of gene libraries, has made encouraging progress. In order to realize the wheat genetically modified engineering breeding better and faster development, people try using gene gun, pollen tube channel, ultrasonic, ion beam injection, laser puncture and agrobacterium mediated transformation method such as wheat. After ten years of hard work, the researchers on wheat transgenic technology research made real progress. At present, the gene marksmanship, agrobacterium-mediated technique and pollen tube channel is the main method of wheat genetic transformation method, research involves the wheat all resistances, quality improvement, increase production, etc. This paper introduces, the comparison, analyzes the main method of wheat genetic transformation, including its basic principle, advantages and disadvantages and its influencing factors, so as to through this article, people can better understand the wheat genetic transformation technology and its progress, and promote continuous improvement and improve. Key words:Wheat, genetic transformation, gene marksmanship, agrobacterium-mediated technique, pollen tube channel method Ⅱ
种子真空侵染法遗传转化体系的建立与优化
第４１卷一第１期２０１９年３月一一一一一一延一边一大一学一农一学一学一报A g r i c u l t u r a l S c i e n c e J o u r n a l o fY a n b i a nU n i v e r s i t y 一一一一一V o l ．４１N o ．１一M a r ．２０１９收稿日期:２０１９Ｇ０１Ｇ２２一基金项目:国家青年科学基金项目(３１３０１０４３) ,吉林省教育厅 十三五 科研规划项目(J J K H ２０１９１０１３K J )作者简介:杨丽萍(１９７４－),女,吉林蛟河人,博士,研究方向为表观遗传学,金太成为通信作者,一一一一E Ｇm a i l :J i n t a i c h e n g ２５３５＠１６３．c o m 文章编号:１００４Ｇ７９９９(２０１９)０１Ｇ００５８Ｇ０４一一一一D O I :１０．１３４７８/j ．c n k i ．j a s y u ．２０１９．０１．０１０种子真空侵染法遗传转化体系的建立与优化 杨丽萍,一王一悦,一孟大伟,一吴艳菊,一金太成? (吉林师范大学生命科学学院,吉林四平１３６０００ )摘要:针对植物遗传转化体系中周期长二表达效率低等的局限性,在拟南芥中建立并优化了一种新的遗传转 化体系,称为发芽种子真空侵染法.以发芽种子作为真空侵染的材料,在拟南芥中成功地表达了βＧ 葡萄糖苷酸酶(β ＧG l u c u r o n i d a s e ,G U S ),并对影响基因表达的侵染条件进行了优化.结果表明:当农杆菌细胞浓度(O D ６００)为１．２,真空泵的压强为０．０７M P a 时,植物中G U S 基因的表达效率更高.R T ＧP C R 检测结果表明,利用这种体系在紫花苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a L ．)中有效表达了外源基因G U S .这种体系具有快速和高效的优势,为农杆菌介导的植物遗传转化体系提供了新的途径. 关键词:发芽种子真空侵染;稳定转化体系;β Ｇ葡萄糖苷酸酶;拟南芥中图分类号:S ６５２一一一文献标识码:A 一一一E s t a b l i s h m e n t a n do p t i m i z a t i o no f g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n s y s t e mf o r g e r m i n a t e d Ｇs e e d v a c u u mi n f e c t i o n Y A N GL i p i n g ,一WA N G Y u e ,一M E N G D a w e i ,一WU Y a n j u ,一J I N T a i c h e n g ?(K e y L a b o r a t o r y f o rP l a n tR e s o u r c e sS c i e n c e a n dG r e e nP r o d u c t i o n ,S i p i n g J i l i n １３６０００,C h i n a )A b s t r a c t :D u e t o t h e l i m i t a t i o no f l o n g t i m e a n d l o we x p r e s s i o ne f f i c i e n c y f o r g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o ns y s Ｇt e m s i n p l a n t s ,an e wt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m w a sc o n s t r u c t e d i n A r a b i d o p s i s p l a n t s ,n a m e d g e r m i n a t e d Ｇs e e dv a c u u mi n o c u l a t i o n ．T h e g e r m i n a t e d Ｇs e e d sb y v a c u u mi n f i l t r a t e dw i t hA g r o b a c t e r i u ma s t h em a t e r i Ｇa l s ,βＧG l u c u r o n i d a s e (G U S )g e n ew a ss u c c e s s f u l l y e x p r e s s e di n A r a b i d o p s i s p l a n t s ,a n dt h e i n f i l t r a t i o n c o n d i t i o n s i n f l u e n c i n gg e n e e x p r e s s i o nw a s o p t i m i z e d ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e f f i c i e n c y o f G U S g e n e e x p r e s s i o nw a s h i g h e r i n t h e p l a n t sw h e nA g r o b a c t e r i u mc e l l c o n c e n t r a t i o n a n d t h e p r e s s u r e i n t h e v a c u u m b u m p w a s １．２a n d ０．０７,r e s p e c t i v e l y ．R T ＧP C Rd e t e c t i o ns h o w e d t h a t t h e G U S w a s e f f e c t i v e l y e x p r e s s e d i n M e d i c a g o s a t i v a w i t h t h i s g e r m i n a t e d Ｇs e e dv a c u u mi n o c u l a t i o ns y s t e m．T h e s y s t e m h a da d v a n t a g e so f f a s t a n dh i g h Ｇe f f i c i e n t ,a n d p r o v i d e d an e w w a y f o r t h e s t a b l e t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m s i n p l a n t s ．K e y w o r d s :G e r m i n a t e d Ｇs e e d s v a c u u mi n f i l t r a t i o n ;s t a b l e t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m ;β ＧG l u c u r o n i d a s e ;A r a b i d o p s i s 一一植物的稳定遗传转化方法已经被广泛的应用于 植物品种的改良,其中,最常用的２种方法是农杆菌介导法和基因枪法.基因枪法导入的外源基因存在拷贝数较多及遗传不稳定等缺点,大多数植物的遗