突变体质粒构建—PCR法
实验题目：突变体质粒构建——PCR 法
背景与原理：
蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR 方法可向目的DNA 片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR 定点突变迅速、高效并且重复性好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图：
本实验拟在某基因编码区（CDS ）内，通过PCR 定点突变引入一个EcoRI 酶切位点。该基因片段长724bp ，上下游分别以XhoI 和BamHI 两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS 。此基因内部含有一个EcoRI 酶切位点，我们通过PCR
法诱
产物I
产物II
第一轮PCR
第二轮PCR
退火
延伸
8个循环后加入
引物1/引物4
变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计如下：
仪器、试剂及药品配方：
1.仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作
台，冰箱
2.试剂及配方：
2.1试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA电
泳marker
2.2PCR反应体系：
primex 12.5μl
模板1μl
上游引物（10μM）2μl
下游引物（10μM）2μl
水7.5μl
2.3primex配制：
primex
Taq酶0.125μl
10×Taq酶buffer 2.5μl
dNTP（2.5μM）2μl
水7.875μl
2.4DNA电泳buffer（TAE）：
工作液（1×）储存液（50×）
40mM Tris-乙酸242g Tris/57.1ml冰乙酸
1 mM EDTA 100ml 0.5M EDTA（pH8.0）
2.5LB液体培养基（1000ml）
蛋白胨10g
酵母抽提物5g
NaCl 5g
2.6LB固体培养基（100ml）
蛋白胨1g
酵母抽提物0.5g
NaCl 0.5g
琼脂粉1g
3.实验方法：
3.1PCR制备突变体片段：
3.1.1第一轮PCR反应体系：
1
1
2
2
7
反应条件：
94℃1min
94℃30S
55℃1min
30循环
72℃30S
72℃5min
3.1.2 第二轮PCR反应体系：
primex 12.5
μl
产物I 2～
3μl
产物II
2～
3μl
引物1（10μM ） 2μl 引物4（10μM ） 2μl 水
补足至25μl
注：引物1/引物4在PCR 反应进行8个循环后加入。 反应条件：
94℃ 1min 94℃ 30S 35循环（第8个循环后暂停加入引物）
55℃ 1min 72℃ 30S 72℃
5min
3.2 凝胶回收： a. 配制琼脂糖凝胶； b. DNA 琼脂糖凝胶电泳；
c. 紫外灯下截取相应的DNA 片段凝胶，置于1.5ml dorf 管内；
d. 每管加入500μl 溶液A ，55℃水浴融化10min ，其间可振荡助融2-3次；
e. 融化后，每管加入15μl 溶液B ，混匀，加入离心柱；
f. 离心12000rpm ，30s ；
g. 弃下管液，每管加入500μl 溶液C ，离心12000rpm ，30s ；
h. 重复步骤g （弃下管液，每管加入500μl 溶液C ，离心12000rpm ，30s ） i. 弃下管液，离心12000rpm ，30s ；
j. 将离心柱置于新的dorf 管中，室温敞开离心管盖2-3min ，每管加入25μl 溶液D ，室温
放置2min ；
k. 离心12000rpm ，1min 。 3.3 酶切体系：
3.3.1构建质粒酶切体系：
3.3.2酶切验证体系：
3.4 连接体系：
载体（100ng）μl
片段（68ng）μl
T4连接酶0.5μl
10×buffer 1μl
水补足至10μl
3.5制备感受态：
a.取培养的菌液1ml转至100ml LB液体培养基，菌体振荡培养至OD600＝0.35（可凭经验）；
b.将100ml菌液转至两个冰预冷的灭过菌的50ml离心管内，冰浴10ml；
c.离心，4℃ 4000rpm，10min；
d.弃上清，每管加入10ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀；
e.离心，4℃ 4000rpm，10min；
f.弃上清，每管加入2ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀，再分别加入2ml
灭过菌的40％甘油，混合均匀；
g.按每管150μl分装，-80℃贮存备用。
3.6转化：
a.超净工作台内，将连接体质粒加入感受态细胞，冰浴30min；
b.热击，42℃，90秒；
c.冰浴1～2min；
d.超净工作台内，加入800μl LB液体培养基，振荡预培养50min；
e.离心，8000 rpm，1.5min，弃上清，余100μl左右，吹散沉淀；
f.涂布LB固体培养基平板，37℃正置培养1h；
g.翻转平板倒置培养过夜。
3.7小提质粒：
a.离心收集菌体，12000rpm，30S；
b.弃上清，150μl 溶液I（25mM Tris-Cl，10mM EDTA）重悬菌体；
c.加入150μl 溶液II（2％SDS：0.4M NaOH ＝1：1）轻混；注：溶液II现用现配。
d.加入150μl 溶液III轻混；
乙酸钾（5M）60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
e.离心，12000rpm，5min；
f.收集上清至新管，加入等体积酚：氯仿（1：1），振荡；
g.离心，12000rpm，5min；
h.移上清至新管，二倍体积无水乙醇沉淀20min；
i.离心，12000rpm，10min；
j.弃上清，室温干燥，20μl TER溶解；
k.电泳验证。
日程安排：
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →←314bp
图2：产物II 电泳
2000bp → 1000bp → 750bp → 500bp → 250bp → 100bp →
←446bp
图1：产物I 电泳
注意事项与建议：
1. 实验准备工作一定要提前做好。
2. 每一步实验都需要电泳验证，得到阳性结果以后才可以进行下一步实验。
3. 具体实验步骤，如酶切时间，醇沉时间等可以灵活掌握。
思考题：
1. PCR 原理；
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →←6163bp
图12：EcoRI 单酶切阴性结果
2000bp → 1000bp → 750bp → 500bp → 250bp → 100bp →
←245bp
←5918bp
图11：EcoRI 单酶切阳性结果
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →←5427bp
←736bp
图10：BamHI/XhoI 双酶切验证
6623bp → 4254bp →
←5427bp
图9：载体酶切电泳回收
2000bp → 1000bp → 750bp → 500bp → 250bp → 100bp →
←736bp
图8：片段醇沉回收
6623bp → 4254bp →
←5427bp
图7：载体酶切电泳
2000bp → 1000bp → 750bp → 500bp → 250bp → 100bp →
←736bp
图6：全长突变片段电泳回收 ←
736bp
2000bp → 1000bp → 750bp → 500bp → 250bp → 100bp →
图5：全长突变片段电泳
2000bp → 1000bp → 750bp → 500bp → 250bp → 100bp →
←314bp
图4：产物II 电泳回收
2000bp → 1000bp → 750bp → 500bp → 250bp → 100bp →
←446bp
图3：产物I 电泳回收
2.限制性内切酶原理及双酶切buffer选择问题；
3.转化原理。
参考文献：
分子克隆实验指南(第三版) 〔美〕J．萨姆布鲁克D．W．拉塞尔著黄培堂等译北京科学出版社2002.8