山荆子CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建
山荆子CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建
摘要利用RT-PCR技术从山荆子cDNA中克隆CBF基因，ORF全长756 bp，编码252个氨基酸；其氨基酸序列含典型的CBF基因蛋白保守的序列AP2/EREB DNA结合域及CBF家族蛋白特征短多肽序列（PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR）；与Genebank上收录的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比对，结果发现山荆子CBF转录因子MbCBF和苹果CBF/DREB1基因的氨基酸序列相似性为98%；与梅树CBF相似性为67%；进一步构建了植物表达载体，为利用CBF 基因提高植物抗逆性奠定基础。
Abstract The CBF transcription factors were cloned by RT-PCR technique from the plants of Malus baccata.The full-length of open reading frame（ORF）was 756 bp，encoding 252 amino acids；The amino acids sequence owned the characteristics of CBF protein，which contained an AP2/EREB DNA binding domain and two special short amino acids sequences；The amino acids sequences of MbCBF had highly homologous with CBF genes of other plants included in Genebank，reached 98% with Malus domestica，and 67% with Prunus mume respectively；Then we connected the gene into the plant expression vector PBI121，which laid the foundation for the utilization of CBF genes to improve plant stress tolerance.
Key words Malus baccata；CBF transcription factor；clone；sequence analysis；plant expression vector
低温在很大程度上限制了植物生长、发育及其地理分布，例如许多重要作物和水果（水稻、玉米、番茄、香蕉等），在低温非冰冻条件下（0～12 ℃）就会受到损害，产量下降，严重的甚至绝收[1]。如何有效提高植物抗寒性成为目前亟待解决的问题。CBF（C-repeat binding factor）转录因子的发现为基因工程改良植物抗逆性提供了一种全新的途径。CBF基因是一类对植物多个抗逆基因表达起调控作用的植物特有的转录因子，能识别并结合逆境胁迫应答相关基因启动子区域的CTR/DRE（C-repeat dehydration-responsive element）顺式作用元件，启动下游抗逆基因的表达，从而增强植物的抗逆性[2]。CBF基因的表达水平在植物抗寒性差异中起着至关重要的作用。
该文以抗寒性较强的山荆子（Malus baccata）为试验材料，从该植物中分离并克隆CBF同源基因，对其进行序列分析，并进一步构建了植物表达载体。一方面，为在分子水平上深入理解植物的抗寒机制奠定基础，另一方面，为人们通过基因工程手段进行植物抗寒育种研究提供了新的候选基因。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用山荆子新鲜材料采自吉林农业科技学院院内；大肠杆菌菌株DH5α和
常用的克隆载体
第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作 原理 第三章 基因疫苗抗原 基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构 建 第五章 基因疫苗制备 第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫 效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素 第九章 基因疫苗安全性 第十章 细菌病基因疫苗 第十一章 病毒病基因 疫苗 第十二章 寄生虫病基 因疫苗 第十三章 肿瘤基因疫 苗 第十四章 控制动物生 长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体 克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。其中，质粒是目前应用最为广泛 的克隆载体。下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。 （一）质粒特性 质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。有的质 粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。 质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面 用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类 型。严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。 质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA （ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。实验室常利用这 些理化特性鉴定和纯化质粒。 质粒具有以下几项生物学特性： ? 寄生性：质粒可以在特定的宿主细胞内存在和复制。 ? 稳定性：每种质粒在特定的宿主细胞内保持着一定的拷贝数。 ? 重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 ? 不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中，其分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 ? 传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基 因。
植物基因克隆实验指导
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
植物基因克隆技术的研究进展
植物基因克隆技术的研究进展 随着科学技术的不断发展，人类基因组计划的不断实施，世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步，近年来，我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步，在玉米，小麦，大豆，水稻，拟南芥等植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术，功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。 标签：植物；基因克隆技术；研究 植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色，而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式，正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法，通过研究突变表型性状进行克隆，包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式；反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同，它是通过一些特殊的方法，获得遗传基因片段，然后经过一系列的定位，将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆，同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外，随着社会发展，也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术 基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表，基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列，是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术，其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物，这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识，对其的研究，是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果，其中不乏许多典型的实例，用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究，进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制，可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。 基因芯片技术是一种新型的克隆技术，是科技创新和生命科学的很好的结合，代表着人类在基因的克隆方面进展和成就，解决了很多传统克隆不能解决的问题，也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆 功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略，功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究，其方法原理是先测知基因的编码蛋白质，利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA，再利用cDNA做探针，从基因组中获取基因本身，进而完成克隆。
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
植物基因克隆
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
分子克隆技术第三章
2017/2/21 第三章载体 第一节基因克隆技术概述 一、基因克隆技术 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 二、目的基因的取得 1、直接 2、反转录酶 3、化学合成 4、基因文库 5、PCR ?首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性 内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟 枪法”或“散弹枪”实验法。 三、重组体的构建 1、载体 要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。 （1）质粒（plasmid) （2）噬菌体λ的衍生物 （3）科斯质粒（cosmid） （4）单链DNA噬菌体 M13（5）病毒?面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先 用Eco RI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因的细菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。 2、载体的性质 1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。 2）载体DNA的分子量应该较小。 3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。 4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。 3、酶系的选用
植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此
克隆载体与表达载体教程文件
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
什么是克隆植物的克隆教案-浙科版高中生物选修3
第一节什么是克隆第二节植物的克隆 课标解读 重点难点 1.比较有性繁殖与无性繁殖，简述克隆的含义。 2.通过举例，概述克隆的基本条件。 3.结合单细胞培养成完整植株的示意图，理解细胞的全能性 及简述植物组织培养的程序。 4.联系植物克隆的实例，阐明植物克隆的概念、成就及应用 前景。 1.克隆的定义及其基本条 件。(重点) 2.植物细胞的全能性的含 义。(重点) 3.植物组织培养。(重难点) 无性繁殖与克隆 1.克隆就是无性繁殖，即只要不通过两个分子、两个细胞或两个个体的结合，只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代分子、细胞或个体。 2．在分子水平上，基因克隆是指某种目的基因的复制、分离过程。 3．在细胞水平上，细胞克隆技术应用在杂交瘤制备单克隆抗体的操作中。 4．在个体水平上，植物可由母体的特定部位或结构产生新个体，而动物的克隆较复杂，经历了由胚胎细胞克隆到体细胞克隆的发展过程。 5．克隆的基本条件：具有完整基因组的细胞核的活细胞；能有效调控细胞核发育的细胞质物质；完成胚胎发育的必要的环境条件。 1．克隆技术的发展经历了哪几个阶段？请尝试举例加以说明。 【提示】微生物克隆，如菌落的形成；遗传工程克隆，如DNA克隆或基因克隆；个体水平上克隆，如克隆动物。 植物细胞的全能性 1.基本含义：植物体的每一个生活细胞，都具有发育成完整植株的潜能。 2．全能性的原因：每个细胞都含有本物种所特有的全套遗传物质。 3．特点：不同植物或同种植物不同基因型个体间，细胞全能性的表达程度大不相同。 2．有人说只要找到秋海棠的一个细胞，就能再生出秋海棠，这依据的生物学原理是什么？ 【提示】能让一个细胞发育成一个个体，依据的是细胞的全能性。
植物基因克隆技术及其发展方向
植物基因克隆技术及其发展方向 摘要：基因是染色体上具有一定座位的遗传单位，是DNA分子中一定长度的核苷酸序列。植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现象，开发和分离潜在的各种有价值的基因并深入研究其表达机理，对作物品种的改良具有重要意义。因此对植物基因的克隆并发展与之相关的技术已引起人们的日益关注和投入，近年来其研究方法不断改进，新技术不断涌现，这为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。 关键词：植物基因克隆基因植物基因转化 正文: 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分,是现代生命科学技术中最核心的内容,它是随着20世纪70年代初DNA体外重组技术的发明而发展起来的,其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列,确定其在染色体上的位置,阐明其生化功能,并利用生物工程手段应用到生产实践中。 一、常用的目的基因克隆技术 1、1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI 基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA 对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于
植物基因克隆技术的发展与展望
植物基因克隆技术的发展与展望 摘要:基因克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，为了纵览植物基因克隆的理论和技术的发展创新历程．对各种技术体系、正向遗传学途径、反向遗传学途径(包含定位克隆和同源序列克隆及随后发展起来的电子克隆)进行了综述。随着后基因组时代的到来，植物基因克隆技术将发挥更加重要的作用。 关键词：基因克隆、定位克隆、转座子标簦法、基因芯片电子克隆 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术巾最核心的内容，它是随着20世纪70年代初DNA体外囊组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物T程手段应用到生产实践巾去。一般来讲，基因克隆的策略町分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。现对在植物基因克隆过程巾运用的主要技术进行综述．以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。 1、定位克隆 定位克隆技术(positional cloning)又叫图位克隆(map—based cloning)．是枞据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，适合于克隆编码产物未知的基因、其基本原理是根据功能基因在基因组巾存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组义库(如BAC和YAC)．用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群，再通过染色体步行(chromosomewalking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chro—lnosolne landing)的方法获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆．或以大片段克隆作探针筛选cDNA义库：从而将目标基因确定在一个较小的DNA片段上并进行序列分析．通过遗传转化和功能互补试验分析，签定获得目的基因【1】。 植物巾运用图位克隆技术，从拟南芥、水稻、番茄、大麦、小麦、甜菜、马铃薯等植物巾分离了几十个重要的基因，并以抗病基因的克隆居多．如番茄的埘基因121．Hero基因；马铃薯的Cpa2基因?，拟南芥的RPW8基因?、PBSI基因?、Rppl3基因?和水稻的Pita、Xal、Pi —b等基因。随着比较基因组研究的兴起．利用同科异种植物问染色体的共线性进行比较作图．如以拟南芥、番茄和水稻为巾介来克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物的基因，将成为一个新的发展方向 2、转座子标签法 转座子(Transposon)是口J从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA片段，最早在玉米巾发现的．随后的研究表明，在生物界巾转座子是普遍存在的．并在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子标签技术克隆基因的基本原理是．利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相火表型突变的特点．以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子捕入而功能失活的基因，如果某基因的突变是巾于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就nr从变异株的基因组巾筛选出带有此转座子的部分基因．再以突变基因的部分序列作探针，即口J从野生型义库巾克隆m完整的基因，在植物中利用转座子的有玉米的Ac／Ds．En／Spm和金鱼草的Tn3等，其中应用最多的是AciDs双因子系统【2】。 利用转座子标记技术目前已克隆y-0的植物抗病基因有玉米抗网斑病基因Hml、Hm2“．番船抗叶霉病基因a之、a4d、cf巧、Cf-9、C}9B及cf一磁P型“。1?．烟草抗花叶病毒病基因
第四章克隆策略与体外重组.
第四章克隆策略与体外重组 一、填空题 1．克隆策略有三层涵义：(1)第一层是—--------------—； (2)第二层涵义是—----------------—； (3)第三层涵义就是-------------------- 。 2．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件： (1)—-----------------—(2)——------------------ (3)—------------------—。 3．现有的基因克隆策略大体上分为三类：—--------------—、—------------—、—--------------—。 4．受体细胞的感受态是—--------------—。 5． DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)—---------------—(2)—------------— (3)————————————（4)—--------------------—。 6．平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端DNA连接的效率。常用的凝聚剂是--------------——。 7．一个细菌的表面大约有—-----------—个同DNA结合的位点。 8． 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1)—---------------—(2)—----------------— (3)——----------------。 9．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个—-------------—，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个—---------------—。 10．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个—----------—，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个—-------------------—。 11．在构建cDNA克隆之前，可以用—-----------—来富集一特殊的核苷酸序列。做法是用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA 分子杂交。 12．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用——技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。 13．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用—---------—可以将这段DNA进行百万倍的扩增。 14．SD序列是mRNA分子中同——结合的序列，其结构特征是—----------—的全部或一部分。
常用的植物目的基因克隆技术
常用的植物目的基因克隆技术 常用的植物目的基因克隆技术 1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（Cp TI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共』 虮嗦氲氖芴逯 浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担 圆≡ し⒆拥鞍孜 咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』 颍 绶 延胛薅净 騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。 3、以图谱为基础的定位克隆技术 以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片
植物基因克隆实验总结
2015-2016第二学期生物科学实验 （植物基因克隆）实验总结 班级：13级生物科学2班学号：1312022005 姓名：邓伟强日期：2016年6月10日一、实验原理及方法： 实验原理：基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺 序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。 通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。 实验方法及过程： 1. CTAB法提取水稻基因组DNA 配制CTAB溶液： (2g CTAB ,3.17g Nacl,1mol/L TrisHcl 10ml(PH 8.0),EDTA 4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液： （24gTrisHcl, 1.488gNa2EDTA.2H2O,11g 硼酸，最后定容至200ml.） 2. 配置琼脂糖缓冲液： 10×TBE Buffer配制方法： 每组需要：称量下列试剂，置于1 L烧杯中 Tris：108 g Na2EDTA·2H2O：7.44 g 硼酸：55 g 向烧杯中加入约800 ml的无菌水，充分搅拌溶解。 加无菌水将溶液定容至1 L后，室温保存。用时稀释。
3. 开发设计引物 LOC_Os02g42310 Chromosome 2: 25,442,875-25,450,093 OsSCP8 - Putative Serine Carboxypeptidase homologue, expressed Oryza sativa Japonica GCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAA Oryza sativa Indica GCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAA Oryza sativa Japonica GCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAA TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA T Oryza sativa Indica GCGCCGGAGACGAAGA-----------------A TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA T OLIGO start len tm gc% any 3'seq LEFT PRIMER 9 22 59.60 45.45 4.00 0.00 AACATCTCATCTCCGTGTTTC RIGHT PRIMER 168 20 59.77 50.00 5.00 3.00 ACTCTGGACCGTGCAAACTT Length：201 japonica, 193 Indica 4. PCR反应体系 10×扩增缓冲液：每管：2 ul 共需：24ul dNTP混合物：每管：0.8 ul 共需：9.6ul 模板DNA ：每管3 ul，共需36ul Taq DNA聚合酶：每管0.3 ul，共需3.6ul 引物1、2 ：每管：2 ul（前引物1ul、后引物1ul）共需24ul。两种引物各6管。引物1、2代表的体系分别加灭菌水71.4ul至120 ul，分装6个ep管。 5. PCR反应程序 95℃预加热5分钟， 95℃30秒钟 56℃30秒钟35循环 72℃30秒钟
植物基因的图位克隆
#综述与专论# 植物基因的图位克隆1 M ap-based Cloning for Pla nts Ge ne 王泽立1戴景瑞2王斌3 WA N G Ze-li1DA I Jing-ru i2WAN G Bin3 1山东农业大学,泰安271018;2中国农业大学,北京100094;3中国科学院遗传所,北京100101 1Shandong Agr icultur al Universit y,Tai-an271018;2China Agr icultur al University,Beijing100094;3Institute of Genetics of Chinese Academy of Science,Beijing100101,China 摘要:图位克隆是分离基因的有效方法,本文概述了植物基因图位克隆的研究进展,主要包括图位克隆的一般策略、相关技术、发展前景和其它基因组领域研究于其带来的有益借鉴。 关键词:分离群体;分子标记;基因;图位克隆 A bstra ct:Map-based cloning has already become a valuable method for gene isolation.This paper summarized the pro2 gresses of the map based cloning and described the strategies in which should be adopted to clone a gene in plant.And,the main steps for map based cloning are di scussed also. K e y word:Segr egate population;molecular marker;gene;map-based cloning 中图分类号:Q943.2文献标识码:A文章编码:1002-5464(2000)04-021-07 随着作物遗传水平的不断提高和对生物新技术的渴求,研究者对诸如育种材料的遗传多样性、亲本选择指标、后裔评价方法等提出了更高的要求。因此从表现型选择到基因型鉴别,特别是对有益基因定位、克隆、转移和累加,是人们为获取高产、优质、多抗新品种(系)而应该关注的研究工作。然而无论对于控制质量性状的单(寡)基因还是与大多数农艺性状有关的微效多基因来说,对其进行克隆都需要建立和发展相关的技术和方法。现代遗传学的发展为建立基因克隆新技术提供了理论指导。从遗传学的观点来看,克隆基因的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行;反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。由于绝大多数控制重要农艺性状的基因产物及调控机制尚不清楚,走正向遗传学之路困难较多,而反向遗传学途径则显示出较好的前景。 循反向遗传学途径克隆基因有三种主要方法可资利用,分别是转座子示踪法、随机突变体筛选法和图位克隆法。其中,转座子受其种类、活性、数量的制约,随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量,也限制了其使用。比较而言,图位克隆法随着相关配套技术的日渐成熟,数十个与农业生产密切相关的作物基因已被成功的克隆[1,2,3,4,17,18,19](表1)。本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍,以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所助益。 1图位克隆的一般策略 图位克隆(Map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan coulson提出[5],用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息,但应有以下两方面的基本情况:一是有一个根 ) 21 ) 1作者简介:王泽立,1957年生,男,博士,教授。主要研究方向:玉米遗传育种。 收稿日期:2000-01-20