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胚胎冷冻技术进展

胚胎冷冻技术进展
胚胎冷冻技术进展

胚胎冷冻技术进展

周丽颖,王树玉(首都医科大学附属北京妇产医院生殖医学科,100054)

中图分类号:R321-33文献标识码:A文章编号:1006-9534(2009)05-0014-03

胚胎冷冻保存就是将动物的早期胚胎,采用特殊的保护剂和降温措施进行冷冻,使其在-196e的液氮中代谢停止或者减弱到足够小的程度,但又不失去升温后恢复代谢的能力,从而能长期保存胚胎的一种生物技术。1983年T rounson 等首先将胚胎的冷冻-解冻技术用于人胚,并成功妊娠[1]。目前,世界上已普遍开展了胚胎的冷冻和复融技术。

11胚胎冷冻的低温生物学原理

当细胞在水溶液中冷却时,温度一般先降到细胞和培养液的冰点以下,然后才发生冻结,即细胞和培养液均处于过冷状态。在大多数情况下,细胞的过冷程度比周围溶液更深,细胞外溶液先结冰,使溶质浓缩,导致细胞外环境渗透压升高。如果降温足够慢的话,可以通过脱水来维持细胞内外环境渗透压平衡。但是如果降温过慢,细胞长时间处于高渗环境中,会产生渗透休克;如果降温过快,细胞内水分又来不及移到细胞外,而在细胞内形成冰晶,胞浆内结冰过多会破坏细胞器,刺破细胞膜,并破坏蛋白质的硫氢键,使之发生不可逆变化,导致细胞死亡。胚胎细胞内水分含量达80%以上,在冷冻过程中有90%的水分形成游离水,而游离水在低温下易形成冰晶。一般胚胎在冷冻过程中不可避免要形成细胞内冰晶,但只要不形成大冰晶而是维持微晶(冰核)状态,细胞将不受伤害。胚胎在冷冻过程中,大约在-10e以上细胞内不结冰,但处于过冷状态的胞质产生溶液效应和细胞内外化学势差异,导致胞质水分在胞内胞外冻结。这两种情况谁占优势对细胞存活尤为重要。

通过冻前在稀释液中加入一定浓度的低温保护剂,如甘油(GLY)、二甲基亚砜(DM SO)、乙二醇等,则可大幅度减小冷冻对胚胎的损伤。冷冻保护剂的成分通过细胞膜进人细胞内,改变细胞膜渗透性和溶液渗透压,防止溶液效应和渗透压差异,同时让细胞在保护剂中平衡并适当脱水形成玻璃化的凝固状态,减少降温和复温过程冰晶的形成,可将损伤降到最低限度。该过程也是胚胎冷冻最重要的保护机制。

21抗冻保护剂和冷冻溶液

在胚胎冷冻过程中,冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。对于胚胎的冷冻和解冻,-15e--50e是一个致死温度区。在这个温度区,细胞内容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。抗冻保护剂常分为细胞内液抗冻保护剂,即渗透性冷冻保护剂(per m eati ng ctyopro tectant)和细胞外液抗冻保护剂,即非渗透性冷冻保护剂(non-per m ea-ti ng ctyoprotec tant)两种。

前者常用低分子量可渗物质,例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、G LY、DM SO等。渗透型保护剂的主要保护机制可能是降低细胞周围未冻结液体中电解质的浓度,减少损伤并降低细胞内水分的蒸汽压,使细胞内外压趋于平衡,从而在细胞外液冻结时降低细胞皱缩的程度和速度。同时能通过细胞膜并与水结合,从而使溶液粘性增加,细胞内冰晶形成温度显著降低(约为-40e)。目前,已知冷冻保护液中毒性最低的乙二醇,其渗透性好,进出胚胎的速度快,加入10%的合成血清替代品可促进玻璃化的形成,并可降低渗性保护液的毒性,增加细胞膜的稳定性。后者常用低分子量不可渗物质,例如半乳糖(g alactose)、蔗糖(sucrose)、海藻糖(treha lose)、聚蔗糖(fico l1)等。该类保护剂由于分子量大,不能透过细胞膜,但能改变渗透压而使细胞脱水,通过减少细胞内冰晶形成发挥保护作用。另外一种可能是蔗糖等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合,降低溶液中的自由水的含量,使冰点降低,减少冰晶的形成。

此外,抗冷冻蛋白(antifreezeprote i n,AFP)作为一种新型的冷冻保存剂在细胞冷冻试验中也得到应用。它是一种具有特殊功能的蛋白质,在低温(-40e)和超低温(-168--130e)下,可以与细胞膜相互作用,抑制细胞内冰晶的形成而保护细胞。

冷冻保护液常用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)来配制,p H 值保持712-714。也可用简单的生理盐水或TC M-199来配制。在实际操作中,根据不同冷冻剂有不同的优、缺点,经常联合使用,并能降低细胞毒性和提高保护效果。

31胚胎冷冻方法

目前用于胚胎冷冻保存的技术有慢速冷冻法、快速冷冻法、一步细管法以及玻璃化法等。

临床常规应用的是程序化慢速冷冻法,它是一项较成熟的冷冻技术。按其解冻速度快慢又可分为慢速冷冻-慢速解冻法和慢速冷冻-快速解冻法。前者使用渗透性较慢的低温保护剂,一般以低于1e/m i n的速度降温到-30--80e,再投入液氮,解冻速度不超过25e/m in。该法脱水完全,细胞内冰晶形成较少,但耗时间较长,且解冻时细胞内易出现重结晶现象,损伤细胞。后者在胚胎降温时与前者类似,但解冻时胚胎直接投入15、20、25e或37e水浴中快速复温。运用该法可防止解冻时细胞内发生的重结晶现象,但由于温度恢复过快,细胞内外渗透压急剧变化,易引起胚胎细胞破裂死亡。

快速冷冻法是将胚胎部分脱水后以高于1250e/m i n的速度快速冷冻胚胎的方法。该法一般使用混合保护剂,保护剂由浓度为0112-315mo l/L的渗透性保护剂(GLY和PG)与浓度为01125-0115m o l/L的非渗透性保护剂(如蔗糖)混合而成。这种方法与玻璃化冷冻法相同的是胚胎都在高浓度的低温保护剂中平衡;而不同的是快速冷冻过程中细胞内外水分都要结晶。在快速冷冻过程中胚胎在保护剂的作用下只经过一个短暂的平衡,脱水并不完全,易造成细胞内冰晶的形成,导致胚胎发生物理损伤。

玻璃化(V itrificati on)冷冻法是1985年发展起来的一种快速冷冻胚胎的方法。它的主要特点是使用快的冷冻和解冻速率以及使用高浓度的低温保护剂,操作简单,不需要昂

贵的设备。玻璃化冷冻不要求严格的降温速率,就方法而言,最不利的因素就是高浓度的冷冻液对胚胎造成的毒害作用,所以胚胎暴露在冷冻液的时间应严格控制在一定的范围之内。自玻璃化法出现以来,人们不断探索更为简单、高效的玻璃化冷冻方式,寻找低毒、高渗透性的抗冻剂组合。玻璃化技术已经过了20年的发展,已报道的玻璃化液有许多种。根据渗透性保护剂的不同,目前应用于临床研究的玻璃化溶液可分为2类:一类是单用乙二醇(ethy leneg l yco,l EG)为渗透性保护剂;另一类则是以联合乙二醇和二甲亚砜(di m ethy l su lfox ide,DM SO)为基础的保护剂。第一类中有代表性的是VS l4(EG515)和EF S402种玻璃化溶液。V S14溶液的基本组成为515m ol/L EG和110m o l/L蔗糖,已应用于人类胚胎,获得了成功妊娠和分娩。应用此种溶液,国内首例玻璃化冷冻人早期胚胎获得成功。在此基础上,朱桂金等观察了其用于临床的效果,积累了一些经验,胚胎存活率为7217%(691/957);临床妊娠率为1917%(35/178)[2]。EFS40溶液于1990年最先报道,含40%乙二醇、18%聚蔗糖(fico ll70)和013mmo l/L蔗糖,应用也较广泛。M ukaida等和Cho等应用此种溶液分别冷冻人早期胚胎和囊胚均获得成功妊娠和分娩[3]。在第二类玻璃化溶液中,乙二醇的毒性低,但玻璃化形成能力较差;而二甲亚砜正相反。2种保护剂配伍使用,作用互补,避免了单一保护剂含量过高产生的毒性作用,从而降低了玻璃化溶液的毒性。乙二醇和二甲亚砜都是小分子量渗透性保护剂,分子量相近,主要是以等体积浓度比的形式配伍。近来,由于冷冻载体的改进使玻璃化溶液体积减小,加快了冷冻速率,从而降低了玻璃化溶液的浓度,这使得乙二醇和二甲亚砜的浓度由原来的25%降至15%。T akahas h i等用15%EG和15%DM S O配伍构成的玻璃化溶液冷冻人囊胚,其妊娠率和出生婴儿先天性缺陷率与新鲜囊胚移植的结果无明显差异,显示出此类玻璃化溶液的可行性和安全性[4]。

41提高胚胎妊娠率和植入率的方法

液氮(LN2)在-196e时沸腾。当标本投入液氮中,液氮被加热,引起沸腾,产生氮气。这时,氮蒸汽围绕细胞形成包被将其隔离,由此减少了温度的传递,其结果是降低了冷冻速率。所以,要达到更高的冷冻速率最好是经液体传热而不是蒸汽,因为液体中的热传导要快得多。为了增加标本被液体而不是蒸汽包围的机会,要减小标本尺寸,以此缩短蒸汽包被的持续时间,并相应地增加冷冻速率。为了减小玻璃化溶液的体积,在玻璃化过程中要使用特殊的容器。超速玻璃化冷冻就是为了达到这种目的,使用微型工具,通过极度缩小含胚胎玻璃化溶液的体积来实现/即时玻璃化0,使降温速率由普通玻璃化的2,000e/m i n提高到20,000e/m i n以上,有效避免了细胞内冰晶形成,并减轻了寒冷损伤。与传统玻璃化冷冻方法比较,超速玻璃化冷冻一方面提高了降温速率,另一方而缩短了胚胎与冷冻保护剂溶液的接触时间,进一步提高了冷冻效率。

其常用容器包括开放式微管(open pull ed stra w s,OPS)或FD P管(fl ex i pet denudi ng)、微滴(m icrodrops)、电镜铜网(e-lectron m icroscopic copper gr i ds)、半开放麦管系统(he m i straw syste m)、尼龙环(ny lon m esh)、或冷冻圈(c ryo l oop)等。有学者报道使用OPS或C ryo loop的玻璃化方法保存人卵、D3胚胎以及囊胚,得到了成功的妊娠和分娩[5]。已经有学者成功使用电镜铜网玻璃化保存了人囊胚[6]。一种新的玻璃化装置V iM t aster(I M T L td,N ess Z i ona,Israel)可用于将液氮的温度轻微降低至-205e)-208e。与-196e相比,明显提高了冷冻速度。这种玻璃化装置是由A rav等首先介绍,并已成功地用于人类胚胎的玻璃化冷冻[7]。一项报告显示,采用MV C法(最小体积法)对人胚胎进行玻璃化冷冻,达到了高复苏率(94%)、高受精率(91%)和高卵裂率(90%),并有临床妊娠[8]。在辅助生殖技术领域,C ryo l oop超速玻璃化冷冻人囊胚获得了较高的妊娠分娩率,结果比O PS、普通麦管玻璃和CP S能更好的保存胚胎的形态和活力。

W ood于1997年报道,在冷冻过程中不是所有的胚胎均成活,在胚胎冷冻和解冻过程中,一些胚胎的部分分裂细胞可能会出现凋亡和坏死[9]。尽管多数研究者认为,当冷冻胚胎中有半数以上的卵裂球细胞完整,可以认为该胚胎是成活的胚胎,具有继续发育的潜力。然而,更多的人认为冷冻胚胎中坏死的细胞可能对成活的细胞产生毒性作用。V an den A bbee l等报道,细胞完整的胚胎的植入率(1114%)显著高于部分细胞坏死的胚胎(315%);部分细胞坏死的冷冻胚胎在体外继续发育的比率远远低于细胞完整的胚胎(4317% vs17910%)[10]。G uerif等2002年报道,移植细胞完整的冷冻胚胎与部分细胞坏死的冷冻胚胎相比,临床妊娠率(37% vs111%)和胚胎植入率(2210%vs1712%)都得到了显著地提高[11]。因此,冷冻胚胎的部分坏死细胞可能通过细胞间的相互作用影响胚胎中其它成活细胞的发育。H ardy等报道,当从人类82细胞胚胎中取出1或2个细胞对胚胎植入前的发育没有不利影响[12]。目前胚胎细胞活检已经广泛地应用于胚胎植入前遗传学诊断中。但问题是去除冷冻胚胎中的坏死细胞碎片是否能够减少这些坏死细胞对成活细胞的毒性作用。R ienzi等2002年报道采用激光辅助去除冷冻胚胎的坏死细胞碎片显著提高了临床妊娠率(4517% vs11711%)和胚胎植入率(1612%v s1413%)[13]。国内也有研究回顾性地分析了人类冷冻胚胎移植前,采用激光及显微操作辅助去除胚胎的坏死细胞碎片,能显著性地提高移植周期的临床妊娠率和胚胎植入率[14]。

有前瞻性研究人受精卵移植过程中不同的冷冻方案对冻融后胚胎发育和妊娠率的影响。在三级护理中心接受辅助生殖技术的夫妇愿意将其剩余的受精卵冷冻保存。采用3种冷冻方案之一冻存这些受精卵,观察冻融后受精卵的存活、发育及受精卵移植后的妊娠率。捡受精卵后放置3m i n,投入液氮前经-180e预处理,其临床妊娠率为2816%; 15m in放置和冷存前-30e预处理的临床妊娠率为3713%;而捡受精卵后放置15m i n,投入液氮前经-180e处理,其临床妊娠率可达6916%。通过增加捡受精卵后放置时间和降低孕卵存放液氮前的冷冻温度,能显著提高冻融后胚胎发育和妊娠率[15]。因此如何提高冻融胚胎的成活率也是需要研究的问题。

51玻璃化冷冻中的安全性问题

液氮是最常用的低温保存介质,我们使用的液氮是由空气经过高压压缩、冷凝、分馏而来的,空气中的一些微生物可

以耐受这种处理过程而生存下来。另外冷冻标本本身已被污染,放入液氮后会有将病原微生物传播给液氮的可能。液氮罐在使用过程中,多次灌注液氮,液氮不断蒸发,而其中的有机物残留在罐中,在罐底及内壁聚集。当液氮蒸发掉,液氮罐内处于室温时,这些微生物会滋生繁衍。从低温生物学的角度讲,大多数病原微生物在低温环境下比被保存的组织细胞更容易存活。一般的生物体在没有添加冷冻保护剂的情况下经历低温之后是很难存活下来的,而有些结构简单的病毒、细菌等即使在没有保护剂存在的情况下,在低温环境中也能存活。因此液氮不是无菌的,在制作过程中会含有少量微粒、水和微生物。他们对来自生殖中心临床使用了7至10年的3个杜瓦罐进行检查,在其沉淀中检测到的细菌数大于105个/m l。其中包括麦芽单胞杆菌(stenotrophom onas m alt oph ila)等影响标本质量的细菌。因此存放于液氮中的冷冻标本有被潜在污染的可能。B i e l anski等的研究表明装入封口的麦管中保存6至15年的胚胎不会受液氮中微生物的污染[16]。尽管目前尚未见人胚胎经玻璃化冷冻后受污染的报道,但其安全问题正引起学者们的重视。同样是出于安全的考虑,L ieber m ann等建议,对于那些受病毒(诸如乙肝病毒、丙肝病毒或人免疫缺陷病毒等)感染患者的胚胎进行玻璃化冷冻时,应将其放在单独的液氮罐中,而不要与健康患者的胚胎混放,以免通过液氮引起交叉污染[17]。

胚胎冷冻技术如今已趋向简单化、实用化及产业化。但是,对人类胚胎的冷冻技术有待于进一步提高,尤其是冷冻过程中细胞形态和代谢的影响是制定冷冻保存的最大难题。胚胎冷冻技术为建立优良品种的胚胎库或基因库提供了条件,同时也便于胚胎的运输和移植。胚胎冷冻保存的自身优越性决定其有很大的发展潜力,尽管其基础研究等还比较欠缺。所以,人们必须对人类胚胎冷冻技术的方法,程序以及冷冻液的选择等做进一步的研究。随着现代分子生物学的发展,人们对于发育生物学和低温生物学的研究将会更加深入,人类胚胎冷冻保存及解冻存活率,都可望取得突破性。

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收稿日期:2009-01-08

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羊水细胞培养及染色体核型分析是目前产前诊断染色体病的重要手段之一,其检测结果的可靠性和相对的安全性已得到世界的公认。以母血清筛查高风险作为羊水细胞核型分析的指征,可以有效地提高染色体异常的检出率,降低了染色体病患儿的出生率。对于提高我国人口素质有着重要的意义。

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收稿日期:2008-06-19

小鼠胚胎冷冻方案

药品器材清单 PMSG 孕马血清促性腺激素 hCG 人绒毛膜促性腺激素 DPBS 杜氏磷酸缓冲液 M16 体外培养液 EG 乙二醇 蔗糖 塑料细管 1ml注射器 35mm培养皿若干 二氧化碳培养箱 小鼠胚胎的获取 控光(14h光照,10h黑暗)饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠,腹腔注射10 IU/只PMSG,48h后腹腔注射10 IU/只hCG。注射hCG后(计时为0h)当晚与雄鼠(≥8周龄)合笼(雌:雄=2:1或1:1)。次日早晨检查阴道栓,见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死,采集桑椹胚。在DPBS中洗净后移入M16培养基,置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。 小鼠胚胎的玻璃化冷冻 平衡液EG10,见附录溶液的配制。 玻璃化溶液EFS40 ,见附表2。或者EG40,亦见附录溶液的配制。 解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。 将室温调至25℃,经1~2小时将溶液及用具充分平衡后,用0. 25ml的塑料细管(Flance) 按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。 用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液,封口后直接投入液氮中保存。 小鼠冷冻胚胎的解冻 将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中,轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。 小鼠胚胎的发育能力判定 体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。 胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5~7枚,每只受体10~14枚胚胎为宜。妊娠19~22天观察产仔情况。

中国首例冷冻胚胎继承权纠纷案

中国首例冷冻胚胎继承权纠纷案 2014年5月15日,中国首例冷冻胚胎继承权纠纷案在江苏宜兴法院一审宣判。原告沈新南起诉他的亲家,要求继承儿子沈杰和儿媳身亡后留下的冷冻受精胚胎。 四位失独老人为争夺子女留下的冷冻受精胚胎诉诸法院,一审却以原、被告双方均无法获得继承权收场。失独老人之痛以及冷冻胚胎管理法律上的空白,均可在这起诉讼中一窥端倪。 判决 胚胎不能被继承 一审判决宣布,52岁的原告沈新南掩饰不住脸上的震惊,他转头看了看被告席上53岁的亲家刘金法,两人苦笑着对视片刻后,各自带着自己的妻子一同缓缓地走出法院。 “把咱们之间的争执先放放,现在先要把胚胎拿出来。”沈新南说。 去年3月20日深夜,沈新南的儿子沈杰、儿媳刘曦在返家途中遭遇车祸身亡。当天,夫妻俩刚获知一个喜讯,5天后刘曦将可以进行人工受精胚胎移植手术。为了这一天,他们等待了整整一年。 这对小夫妻婚后一直未孕,在朋友推荐下,到南京市鼓楼医院做人工受精。 沈杰、刘曦均为各自家中独子、独女,意外发生后,留下了4位失独老人。 2014年春节前,沈新南在江苏宜兴法院将亲家刘金法告上法庭,要求获得儿子、儿媳存放于鼓楼医院的受精胚胎的继承权。“我希望由我来监管胚胎的储存。”沈新南说。 出乎双方意料的是,由于胚胎属性及是否具有继承权尚未确定,宜兴法院将目前存放管理胚胎的南京市鼓楼医院追加为此案第三方。沈新南认为,从鼓楼医院方面出现在法庭上开始,这场诉讼便成为四位失独老人与医院之争了。 对于原被告双方的诉求,医院方面给予明确拒绝。医院委托代理人郑哲兰表示,目前对试管婴儿冷冻胚胎的属性还没有明确,而且我国对处置和监管冷冻胚胎有严格的技术要求,因此不能将冷冻胚胎交予任何一方。 郑哲兰认为,从医学角度讲,唯一能让这些胚胎存活的途径只有代孕,但是中国法律对此明令禁止。 对此,原告律师郭伟表示,“代孕”对双方父母的意愿进行有罪推断,“他们只是想换家医院保存,以等待政策改变的那天。” 主审法官陆亚琴在解释判决理由时称,胚胎具有发展为生命的潜能,含有未来生命特征的特殊之物,不能像一般之物任意转让或继承,不能成为继承的标的。 陆亚琴称,夫妻双方对胚胎的权利的行使也是受到限制的,必须以生育为目的,不能捐赠、买卖胚胎。现在两夫妻均已死亡,通过手术达到生育的目的已无法实现,夫妻俩手术留下的胚胎本身受限制的权利是不能被继承的,因此原告主张由其监管储存胚胎,法院是不支持的。 法院的判决,令双方父母“心急如焚”。根据沈杰、刘曦与医院签订的协议,冷冻胚胎保存期限为一年。如今保存期已过,让老人们最担心的是医院根据协议可能会抛弃胚胎。 “我们还会上诉,这是我们4个失独老人最后的希望。”沈新南说。 失独 两个家庭的悲哀 从2013年3月20日车祸那夜起,沈新南的家便静了下来。之前,儿子、儿媳和沈新南夫妻住在一起,那一夜后,儿子的大嗓门、儿媳钢琴声,都从这栋3层别墅中消失,只留下两个老人压抑着的啜泣。 白天,沈新南夫妻都在对方面前强忍悲伤,沈新南照旧出门做生意,老伴做好早饭便坐

小鼠胚胎-精子冷冻保种申请表-清华大学试验动物中心

小鼠胚胎/精子冷冻保种申请表 需要填写的资料: 说明: 1.*表示必须填写; 2.保种方式的选择:我们采用精子冻存和胚胎冻存的方法进行保种;假如为杂合子,雄性数量≥3 只并且可以和B6交配做净化,我们推荐安乐死一只雄鼠使用精子冻存的方式保种,可以有效控制保种周期,不受雌鼠排卵多少的限制。 3.保种对提供小鼠的要求: 精子冻存 冷冻精子需要提供的小鼠信息:阳性纯合子雄鼠,2-3只,12-18W(最佳),生育能力良好,在实验前7d内进行过成功交配,而在3d内未交配过;冻存2只/品系,20个麦管。 费用:200元/麦管 冷冻的流程和所需的时间: 1)提前1周邮件预约申请,写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 2)通过申请后安排实验,精子冻存后至少1周进行复苏检测实验(1麦管)。 3)等待代孕小鼠生仔(孕期19.5天,小鼠出生后10-12天剪尾,通知取回鼠尾检测,(一周内反 馈检测结果。) 冷冻后的保存:液氮中保存 终生免费保存。 精子复苏(除复苏检测外) a、外来精子复苏 提前1周邮件预约申请,写明小鼠冻精信息(品系,数量),送达时间。

从接收之日起,1周内安排复苏实验 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎,输卵管移植生仔。(孕期19.5天,小鼠出生后10-12天剪尾,通知取回鼠尾检测,一周内反馈检测结果。) 费用:IVF 500元,IVF用B6(含激素)40元/只,移植用受体单侧100元/只,双侧180元/只,试剂和人工费100元。 如需其他品系雌鼠,需从外单位订购。 b、动物中心精子复苏 提前1周邮件预约申请,写明复苏品系。 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎,输卵管移植生仔。(孕期19.5天,小鼠出生后10-12天剪尾,通知取回鼠尾检测,一周内反馈检测结果。) 费用:IVF 500元,IVF用B6(含激素)40元/只,移植用受体单侧100元/只,双侧180元/只,试剂和人工费100元。 注意事项: 1. 运输过程中:请使用专业运输工具(航空罐)进行运输,运输过程中请避免磕碰,注意液氮充足。 2. 由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同,请一定提供冷冻和复苏的protocol作为参考,且不保证100%复苏成功。截止2015年9月,我们复苏精子平均成功率是40%。 胚胎冻存 品系内冻存需要提供的小鼠信息:雄鼠2-3只12-18W,雌鼠至少10只,3-4W或9-12W。正常情况下可冻存200枚胚胎左右。 费用3000元/品系。 与B6冻存:雄性小鼠,2-3只12-18W,中心提供雌性B6小鼠3-4W,30只。正常情况下可冻存500-600枚胚胎左右。 费用3000元/品系+B6费用40元/只。 c.冷冻流程和所需时间 提前1周邮件预约申请,写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 通过申请后一周左右安排实验,胚胎冻存采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎,玻璃化冻存。胚胎冻存后至少1周进行复苏检测实验(1个冻存管,30 -50枚胚胎/管) 复苏回收的成活2-cell,采用输卵管移植到代孕母鼠体内,19.5天生仔,1-12天剪尾通知取回检测,(一周内反馈检测结果。) 冷冻后的保存:液氮中保存 终生免费保存。 胚胎复苏(除复苏检测外) a、外来胚胎复苏 提前1周邮件预约申请,写明小鼠冻存胚胎信息(品系,数量)送达时间。 从接收之日起,1周内安排复苏实验,输卵管移植生仔。(孕期19.5天,小鼠出生后10-12天剪尾,通知取回鼠尾检测,一周内反馈检测结果。) b.动物中心胚胎复苏 提前1周邮件预约申请,写明复苏品系。 通过申请后1周左右安排复苏实验,输卵管移植生仔。(孕期19.5天,小鼠出生后10-12天剪尾,通知取回鼠尾检测,一周内反馈检测结果。) 费用:移植用受体单侧移植100元/只,双侧移植180元/只,试剂和人工费100元。 注意事项: 1.运输过程中:请使用专业运输工具(航空罐)进行运输,运输过程中请避免磕碰,注意液氮 充足。 2.由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同,请一定提供冷冻和复苏的protocol作 为参考,且不保证100%复苏成功。截止2015年9月,我们复苏胚胎平均成功率是60%。

新鲜胚胎移植和冷冻胚胎移植的差别

新鲜胚胎移植和冷冻胚胎移植的差别 患有不孕症的夫妻在成为父母的过程中,有很多决定要做。哪个不孕不育医院合适治疗?你愿意接受什么治疗?在美国试管婴儿过程中移植新鲜胚胎还是冷冻胚胎哪个更好?幸运的是,您的治疗团队可以帮助指导您做出适合您的选择,HRC美中桥这篇文章可以让您深入了解新鲜与冷冻胚胎移植的利弊。 在女性刚开始的第一个美国试管婴儿周期中,她首先服用药物刺激卵巢产生额外的卵子。通过手术取出卵子后,让它们受精。得到胚胎后让胚胎在特殊的培养箱中生长,直到它们准备好移植到子宫中。在大多数情况下,选择1-2个胚胎进行移植,并将剩余的胚胎冷冻。几十年来,新鲜胚胎移植环节是黄金标准......直到最近几年,解冻和冷冻保存方法的快速进步改善了冷冻胚胎移植的结果。 最初胚胎都是采用缓慢冷冻,导致细胞内冰的形成;不幸的是,冰经常损坏胚胎。许多受损的胚胎无法存活,导致剩余被移植的胚胎都是质量不佳的胚胎。然而,在过去几年中,由于玻璃化冷冻技术的引入,我们已经看到冷冻胚胎技术的急剧增涨。玻璃化是一种超快速冷冻方法,它使胚胎冻结的速度比以前的冷冻方法快约60,000倍。这个过程不会再形成冰,使得移植成功的胚胎植入率大幅提升,怀孕成功率接近新鲜胚胎。 我们现在看到的冷冻胚胎移植成功率明显高于几年前的另一个原因是冷冻的胚胎已经和以前不一样。已经表明冷冻胚泡(第5-6天的胚胎)阶段比冷冻早期的胚胎(第2-3天)具有更好的结果。在许多情况下,未成功发育到胚泡阶段的胚胎都是染色体异常的胚胎,这些胚胎不会发育成健康的婴儿。使用胚泡期胚胎进行冷冻胚胎移植的另一个好处是,胚胎移植数量减少- 因为我们能够确定这是最可行的胚胎。这意味着我们可以最大限度地减少多胎妊娠的几率,以及减小对母亲和婴儿的妊娠风险。 研究表明使用冷冻胚胎移植的成功率大约和新鲜胚胎移植的成功率差不多。新鲜胚胎移植具有稍高的成功率是因为通常在第一次移植肯定选择最佳胚胎。但是,在某些情况下冷冻胚胎移植也具有吸引力: 因为您在新的周期中接受了卵巢刺激和取卵,所以您不必再次进行卵巢刺激。让身体做好冷冻胚胎移植准备所需的药物具有较少的潜在副作用,并减少对您身体的影响。 许多患者报告说,冷冻胚胎移植环节没有像新鲜胚胎环节那样紧张,因为他们已经知道它们具有可存活的胚胎。 与新鲜移植相比,时间上安排和规划冷冻胚胎移植更容易。

论冷冻胚胎的法律性质

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/b712428030.html, 论冷冻胚胎的法律性质 作者:王伟 来源:《法制与社会》2015年第24期 摘要随着科学技术的发展,体外受精——胚胎移植技术作为提高生命质量的优生手段之一,已经逐步趋于成熟。然而,由于体外受精技术导致了生育与性爱在客观上的分离,导致了双轨生殖体制的形成,涉及到以人本身为对象的道德情感问题,触及了人之尊严、自由等基本价值,因而该技术自诞生之日起就伴随着伦理上的非难和法律上的质疑。其中最核心的问题就是冷冻胚胎的法律属性问题,在理论和实践中,各国对这一问题作出了不同的回答,主要有主体说,客体说和中介说,并基于此在立法上采取了不同的应对措施。 关键词冷冻胚胎主体说客体说中介说 作者简介:王伟,苏州大学王健法学院。 中图分类号:D923 文献标识码:A 文章编号:1009-0592(2015)08-266-04 《孟子·离娄》中有言:“不孝有三,无后为大”。孟子有关孝道的这一论述,是深深植根 于中华民族传统的信仰,而有限的肉体生命却是人类观念领域最深层的焦虑,因此,各民族都不约而同地有着关于长生不老的传说。关于灵魂的永生,印度佛教讲究转世轮回,基督教讲究末日救赎,而在强调顺应自然、寄希望于人的生命能在后代身上得到某种延续的汉民族,则是通过后代的祭祀使灵魂得到永恒。在汉民族的传统观念里,后代的祭祀能够使人死后灵魂不灭,这种远古的记忆在商代就已经存在,在周朝正式的确定下来,并逐渐成为中华儿女世世代代的信仰之一。在孔孟之说中,“孝”的最高表现就是要生育子嗣,传宗接代,延续香火,而“孝”之一字,逐步成为了“后代们”最强的生育动机。 然而,不孕不育症却在客观上使得患者的自然生育成为不能,并成为影响夫妻双方身心健康,家庭和睦和社会稳定的社会性问题。在这样的医学背景之下,人工辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technique,医学上称为ART技术)应运而生,但是我们不得不承认,人工辅助生殖技术在给广大不孕不育症患者带来福音的同时,也形成了性交生殖与非性交生殖的双轨生殖模式,其所牵扯的道德伦理问题不断冲击着我们传统的法律制度。在国外Davis诉Davis案,Kass诉Kass案等经典案例之后,中国也出现了国内的首例胚胎继承权纠纷案,使得国内对冷冻胚胎法律性质的争议已经从理论层面发展到实践层面。 由于冷冻胚胎和胎儿都具有未来发展为人的可能性,而且对于胎儿法律属性的探讨早已不是一个新的话题,国内外关于胎儿的立法和学说已有大量的资料,因此,本文在分析冷冻胚胎法律性质的问题时,将结合古今中外有关胎儿法律地位的相关规定和学说,站在前人的肩膀上,对冷冻胚胎的法律性质和权利归属问题进行研究。

哺乳动物胚胎冷冻保存综述

哺乳动物胚胎冷冻保存综述 09动物生物技术2班 200930380216 宋骥晨 摘要:哺乳动物胚胎冷冻保存效果受冷冻保护剂、冷冻方法、解冻方法等多种因素影响, 其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻; 玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比, 玻璃化冷冻法简化了操作过程, 大大缩短了操作时间, 不需昂贵的程序控制冷冻仪。 关键词:胚胎; 冷冻保存; 冷冻保护剂; 冷冻; 解冻 胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在 -196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。1972年, whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。 1.胚胎冷冻保存原理 胚胎细胞是发育中的细胞, 细胞内水分含量达到80%以上, 如

果不经保护, 冷冻时细胞内部就会形成冰晶, 破坏蛋白质的结构使其发生不可逆的变化, 从而导致胚胎死亡。常规慢速冷冻法的原理是通过加入低浓度的防冻剂, 缓慢降温将胚胎内的水分在冻结前脱出, 阻止冷冻过程中形成有害冰晶而造成胚胎损伤。将胚胎放到含有渗透性防冻剂的溶液中,防冻剂使胚胎细胞内的水分能够在-10℃以上不冻结并且能替换出部分水分。随着降温的进行, 细胞外液开始形成冰晶, 细胞外液浓度变高, 由于渗透压的原理使细胞内的水分开始脱出。为了保证细胞外液冰晶形成的时间总是早于细胞内液, 大多数冷冻程序采用植冰的方式来诱发细胞外液冰晶的生长, 植冰通常在-5℃到- 7℃进行。缓慢降温使细胞内的水分有更多的时间在冻结前脱出。需要指出的是, 胚胎在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶。关键是冰晶的大小和数量能否造成胚胎的损伤。玻璃化冷冻保存的原理是在足够低的温度下或采用高浓度的防冻剂使冷冻过程中形成玻璃样物质减少细胞内外冰晶的形成。总之, 无论采取何种冷冻方法, 胚胎冷冻保存的原理都是阻止冷冻、解冻过程中细胞内形成致死冰晶。 2.抗冻保护剂和冷冻保护液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中, 冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。-15℃~ -50℃是一个致死温度区, 在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。抗冻保护剂主要分为3类:(1)低分子质量可渗物质, 如甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油等一些醇类; (2)低分子质量不可渗物质, 如葡萄

论冷冻胚胎的法律属性——以无锡胚胎案为例

论冷冻胚胎的法律属性——以无锡胚胎案为例因自然生育存在困难,2012年2月沈某与妻子到南京市鼓楼医院生殖医学中心采用人工辅助生育技术繁育后代。治疗过程中,鼓楼医院保存了4枚受精胚胎,并确定于2013年3月25日进行胚胎移植手术。然而在手术前5天,沈某与妻子驾车发生车祸死亡。此后,双方父母因处理冷冻胚胎事宜发生争执,沈某的父亲因此起诉至法院要求判令沈某与刘某存放于鼓楼医院生殖医学中心的受精胚胎(四支)归原告监管处置。所谓监管处置即将胚胎从法院取出,被告,女方父母胡某某,刘某某则辩称,胚胎系她们女儿留下的唯一东西,要求处置权归夫妻所有。作为第三人的鼓楼医院辩称冷冻胚胎都不具有财产属性,原被告双方都无法继承,要求驳回原告诉讼请求。一审宜兴法院驳回了原告的诉讼请求,二审法院无锡中院改判涉案胚胎由双方父母共同监管和处置。 一审审判的焦点集中于胚胎的法律属性是否能被继承或转让,二审审判的争议焦点集中于涉案胚胎的监管权和处置权的行使主体如何确定。两审裁判的法官对冷冻胚胎的法律属性都没有进行明确解析,二审法院从法理伦理情理的角度,遵从不得对抗公民私权利的精神,裁判胚胎由双方父母共同监管和处置。冷冻胚胎是人还是物,法律上也没有明确界定,随着生殖技术的发展,冷冻胚胎这一技术将被广泛应用。个案裁判的公正兼顾人情迫使我们不得不探寻胚胎的法律属性。学界有三种观点:一种认为胚胎属于物,根据继承法、物权法,可以继承;一种认为是人,也有相关法律;还有一种折中说,认为是介于人与物之间的过渡存在,具有潜在的生命特质。笔者倾向于胚胎是物这一观点。笔者将从以下几个方面来阐述: 首先,民法上的物是指存在于人体之外,人力所能支配,并能满足人类社会

哺乳动物胚胎冷冻保存

摘要:哺乳动物胚胎冷冻保存效果受从稀释液和冷冻保护剂、冷冻前处理、冷冻剂型、冷冻速率、解冻等方面的因素。,其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻;玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比,玻璃化冷冻法简化了操作过程,大大缩短了操作时间,不需昂贵的程序控制冷冻仪。 关键词:胚胎;冷冻保存;冷冻保护剂;冷冻;解冻,玻璃化 胚胎冷冻保存[1]是指通过特殊的保护措施和降温程序,使胚胎在-196℃条件下停止代谢,而升温后又恢复代谢能力的一种技术。一般指0~-80℃的温度下保存胚胎,而超低温冷冻保存则是在极低的温度(液氮-196℃、液氦-269℃)下保存动物胚胎.处于超低温下的胚胎,其新陈代谢几乎完全暂时停止,因而可以达到长期保存的目的[2]。1972年Whittingham[3,4,5]等首次在超低温条件下成功地冷冻保存了小鼠胚胎, 解冻后移植产下后代。由于这种方法的诞生引来了很多的人的注意,此后,许多学者对哺乳动物胚胎冷冻保存进行了大量的研究,取得了大量研究成果, 牛(Wilmut & Rowson,1973)、家兔(Whittingham & Adams,1976)、大鼠(Whittingham,1975)、山羊(Bilton et al.,1976)和绵羊(Willadsen et al.,1976)等动物的胚胎超低温保存也相继取得成功. 1977年Willadsen等[6]对上述方法进行了改良,发明了快速冷冻法,将冷冻降温时间缩短了1 h.1985年Rall等[7]首次发明了玻璃化冷冻法,对小鼠8细胞胚胎冷冻保存取得成功.随后经研究者的不断改进,使这项技术日趋成熟,部分动物胚胎经玻璃化冷冻后已在生产中示范应用,有望在生产实际中得到推广,本文对哺乳动物胚胎冷冻保存技术的最新研究进展加以综述。 1冷冻保护剂的种类 抗冻保护剂(Cryoprotective agents,CAP)也就是冷冻保存剂是指可以保护细胞抵抗低温或超低温时对细胞产生的损害,如细胞结冰、脱水、溶质浓度提高和蛋白质变性及其骨架结构的损伤等的一类化合物。 1.1抗冻保护剂[8]主要包括丙三醇(glycer-ol)、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)、丙二醇(propyleneglycol)、乙二醇( ethylene glycol)、乙酰胺( acetamide)、甲醇(methyl alcohol)和丁二醇(butadiene)等。又称细胞内液抗冻保护剂,这类保护剂分子量小, 能够保证细胞内水分的及时脱出,而且还能降低溶液的凝固点,这样使胚胎有更多的时间把细胞内的水分脱出,避免细胞内形成冰晶。并通过与胚胎的平衡,替换出细胞内的部分水分,这样降低细胞内形成冰晶。但是它们对胚胎有毒害作用,尤其在高浓度或高温下毒害作用更大。 各种渗透性抗冻保护剂对胚胎的保护作用机制基本是相同的,但它们的毒性和渗透性有很大差别,因此在玻璃化冷冻的胚胎存活率上效果不同。关于不同种类的抗冻保护剂的渗透性和毒性,Leibo用毒性相对较低的Gly和EG对牛胚作对比研究发现,EG对细胞的渗透性强。Kasai等用30% (v/v)浓度抗冻保护剂处理小鼠桑椹胚30 min,观察对生存率影响实验的结果表明,乙二醇的化学毒性最小,其次是丙三醇、DMSO、丙二醇,乙酰胺毒性最高。另外,对不同发育时期的胚胎来说,抗冻保护剂的毒性也不尽相同。 1. 2分子量非渗透性抗冻保护剂低分子量非渗透性冷冻保护剂是胚胎冷冻液中 的另一个关键性成分。其主要指糖类,如单糖(葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇)、二糖(蔗糖、海藻糖)和多糖(棉子糖),目前应用最广泛的是蔗糖。糖类除了能通过提高渗透压来促进细胞脱水外,还能保持细胞结构的完整。同时,糖类能减少达到玻璃化所需的渗透性冷冻保护剂的浓度,这两个特性均可降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。此外,糖类还可以作为渗透压缓冲

透过“无锡冷冻胚胎案”谈对法律适用的思考

摘要“无锡冷冻胚胎案”严格遵循法律适用规则,成为中国十年来少见的好判决。而法律适用就是“找法”的过程。首先,现行法律没有明确规定冷冻胚胎的法律属性,法院需对其进行法律解释。冷冻胚胎兼具物的实体性及人的人格性,因此无论如何法律均应给予其充分保护。其次,在目前立法空白的情形下,法院可依“法理”进行创制性地补充,将本案争议归纳为对胚胎的监管和处置权。最后,结合“事理”与“法理”,兼顾冷冻胚胎与双方老人间情感上的密切联系与“法无禁止皆可为”、公序良俗等基本原则,进一步论证胚胎权属分配的合法性与合理性。 关键词法律适用请求权基础法理事理法律补充 作者简介:潘晟,武汉理工大学文法学院民商法专业,硕士研究生。 中图分类号:d920.5 文献标识码:a 文章编号:1009-0592(2016)05-058-02 一、案例简介 2012年8月,无锡夫妇沈某和刘某因始终无法孕育,到南京市鼓楼医院实施“体外受精――胚胎移植助孕手术”。医院未直接将胚胎移植于母体,而是于当天冷冻4枚受精胚胎。双方约定医院在限期内对胚胎负有保管义务。2013年3月,夫妇二人不幸死亡。2013年11月,为获得4枚冷冻胚胎的处置权,沈某父母向刘某父母和该医院提起诉讼。一审法院认为冷冻胚胎是具有发展为生命的特殊之物,不能成为继承标的。且我国禁止代孕、买卖胚胎,对其使用既要合法也不得违反伦理道德。因此双方父母均不能依据《继承法》的有关规定获得胚胎。 而无锡市中级人民法院认为现行法律未明确规定胚胎的法律属性,但双方父母与胚胎联系最为密切。双方老人应获得胚胎的处置权和监管权,不仅是对胚胎的尊重与保护,更是对老人精神上的慰藉。二审法院撤销一审判决,判决双方父母对4枚冷冻胚胎共同享有监管权和处置权。此案因涉及法律、伦理等诸多方面,引发社会的广泛关注。有学者称赞,这是十年来全国少见的好判决。 二、“无锡冷冻胚胎案”的法律适用规则 凯尔森说,“有法律必有法律适用,法律从诞生那一天起就与法律适用密不可分。”法律适用不仅局限于学术研究,更贯穿于整个司法实践活动。王泽鉴先生认为处理民事的主要任务,在于寻找请求权基础,寻找请求权乃法之发现过程。法律适用就是法的应然状态转化为实然状态的过程,一般有三个步骤。一是“找法”,寻找合适的法律。二是法律解释。无明确法律规定时,还要补充法律漏洞,甚至需要“造法”。三是由理论回归事实,将法律解释适用于个案事实。这三个过程在一个案件中可能循环往复,来回于案件事实和法律之间,直到找到最佳的“平衡点”。 (一)“找法” 请求权基础,是指得支持一方当事人向他方当事人有所主张的法律规范。不仅债权债务关系中适用请求权,当人格权、物权及身份权受侵害为恢复圆满状态时,亦用请求权作为其救济方式。因此,任何民事案件归根到底是寻找请求权基础。 本案中医院负有保管冷冻胚胎的义务。失独老人对子女的冷冻胚胎是否享有权利?享有何种权利?对医院享有何种请求权?“找法”过程中,首先面临如何界定冷冻胚胎的性质。若是“物”,则依据《继承法》的规定;若是“人”,则依据《民法通则》有关监护的规定;若介于二者之间,则没有明确规定。因此,需对冷冻胚胎法律属性进行法律解释来寻找请求权基础。 (二)法律解释 社会现象的复杂性及法律关系的多样性导致“找法”过程曲折、复杂。即使是法律关系简单明确的民事案件,在适用法律时亦需要以案件事实为基础通过对法律的阐释寻找相关法

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展 蔡元1、2,张凤鸣1、2,潘红梅1、2、,陈四清1、2 (1.重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460 .2.重庆市养猪工程技术研究中心重庆荣昌402460) 摘要:本文对家畜胚胎冷冻保护液的成分、冷冻方法、胚胎解冻方法与冷冻保护剂的脱除及最新研究进展进行了综述。 关键词:家畜;胚胎;冷冻保存 Present Research Advance in Cryopreservation of Livestock Embryos Cai yuan1、2, Zhang fengming1 2 ,Pan hongmei1、2 ,Chengsiqing1 2 (1.Chongqing Institute of Animal Science ,Chongqing Rongchang 402460 2.Chongqing Swine engineering Research,Chongqing Rongchang 402460) Abstract: Advances on cryoprotextive solution, freezing way, thaw way and the elimination of cryoprotective solution and recent situation in livestock embryos were reviewed in this paper. Key words:Livestock;Embryo;Cryopreservation 家畜胚胎的超低温冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单有效的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。自从1972年,英国学者Whittingham等人首次冷冻保存小鼠胚胎获得成功后[1],到目前已经在20多种哺乳动物上获得成功,奶牛、黄牛、山羊、绵羊、马、兔和小鼠等的冷冻胚胎已得到较广泛的使用[2-3],特别是牛和羊的胚胎冷冻保存研究进展很快,其冷冻胚胎已经走向商品化应用。目前人们对冷冻保存原理、冷冻保存的因素和冷冻方法进行了广泛的研究并取得了巨大进步。 1、抗冻保护剂和冷冻溶液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中,加入抗冻保护剂的目的是为了防止冰晶的形成。抗冻保护剂常可分为三类:(1)细胞内液抗冻保护剂。常用低分子量可渗性物质,例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等;(2)细胞外液抗冻保护剂。常用低分子量不可渗性物质,例如半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trchaose)、聚蔗糖(Ficoll)等。(3)大分子量不可渗性物质,例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP),聚乙烯醇(PVA),羟乙基淀粉及其它一些聚合物。 在实际应用中,缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂,如甘油或乙二醇等,而快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冻保护剂,如甘油和丙二醇、甘油和乙二醇或者乙二醇和丙二醇,再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。甘油可调节细胞脱水并保护蛋白结构,而糖类,例如海藻糖可以保持膜结构,甘油本身并不能保持细胞膜结构,而且在高浓度和高温下可以诱发膜融合,因此解冻后需尽快除去甘油。这些不同低温保护液的特性表明,他们是以不同方法来保持胚胎细胞免受冷冻损伤,有效的低温保护液应将各种低温保护剂

玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用

玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用 戴志俊季钢张芳芳张奕 (合肥市妇幼保健院,合肥230001,安徽) 摘要:目的:探讨玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用效果。方法:回顾性分析2011年1月~10月在我院生殖中心行玻璃化冷冻解冻囊胚患者共12个周期的结局。结果:玻璃化冷冻解冻共21枚胚胎,存活21枚(存活率100%),共解冻12个周期,均有胚胎移植,获得临床妊娠5例(妊娠率41.67%),着床率23.81%(5/21)。结论:玻璃化冷冻法是保存人类囊胚的一种有效方法。 关键词:囊胚,玻璃化,冷冻保存,人类 Clinical Application Of Vitrification For Human Blastocysts Dai Zhijun, Ji Gang , Zhang Fangfang , Zhang Yi (Hefei Maternity and Child Health Hospital,Hefei 230001,Anhui)Abstract:Objective: To examine the clinical value of vitrification for human blastocysts. Methods: Retrospective analysis of 12 patients who conduct embryos vitrification from Jua.2011 to Oct.2011. Results: All of the 21 blastocysts were thawed and survived , survival rate was 100%(21/21);5 cycles of 12 cycles got clinical pregnancy after transferred, clinical pregnancy rate were 41.67% ,implantion rate were 作者单位:合肥市妇幼保健院 安徽医科大学妇幼保健临床学院安徽230001

胚胎冻融的原理

胚胎冻融的原理 本文转载于兰州军区兰州总医院生殖医学中心: https://www.wendangku.net/doc/b712428030.html,/shiguanyinger/sgbk/2012/0625/10282.html 胚胎冻融的原理介绍 很多人都不明白胚胎冻融的原理是什么?所以在网上一直发问,就于这个问题,今天小编给大家一起分享这个迷惑的答案,希望对有困惑的您有所帮,也希望能帮助您走出困惑! 专家为我们讲解:利用冷冻技术将胚胎和配子从生理温度降至低温并贮存,需要时,再从低温状态解冻至生理温度。为增加胚胎和配子对冻融过程的耐受,增加存活率,必须选择合适的物质作为冷冻保护剂。 专家讲到:胚胎不同与配子,所以须选用不同的冷冻保护剂和冷冻方法进行冷冻,但它们都是活的细胞,对耐受冷冻与融解过程有相似的机理,以下以胚胎为例说明。 一、常用冷冻保护剂 1.渗透性保护剂如丙二醇(PROH),二甲基亚砜(DMSO),甘油(glycerol)等小分子化学物质,容易渗透入细胞,也称为细胞内冷冻

保护剂。 2.非渗透性保护剂包括单糖如葡萄糖、果糖,双糖如蔗糖、麦芽糖等,它们不能进入细胞,利用它增高细胞外溶液的渗透压而引起非特异保护作用,又称细胞外冷冻保护剂。 二、冷冻保护剂对胚胎的影响及机制 (一)毒性作用 为证明其毒性,将胚胎置于不同的冷冻保护剂一定时间,却不将其冻融,再继续观察胚胎的发育,发现在22℃时,停留在PROH的胚胎失活率高于DM的,而在4℃时,暴露于此两种冷冻保护剂几乎未发现其对胚胎有不良影响。但经冻融过程后,存活率却明显下降,除其毒性作用外,引起冻融后胚胎失活的因素主要有: (二)细胞内冰晶形成 细胞的冷冻实际上是一个脱水过程,如果在投入液氮前胚胎能充分脱水,避免形成细胞内冰晶,是胚胎冻融后能存活的主要因素。 相信仔细看过以上讲解的您一定收益匪浅吧,希望我的分享能给您带来福音!

宜兴胚胎诉讼案

宜兴胚胎诉讼案 一审 5月15日下午,宜兴法院一审审结一起争夺冷冻胚胎处置权引发的继承纠纷案。 原告沈某某诉称,原告之子沈某与儿媳刘某因自然生育存在困难,在依法取得准生证后,于2012年2月至鼓楼医院生殖医学中心采用人工辅助生育技术繁育后代。医院确定于2013年3月25日进行胚胎移植手术,但在前一天,沈某与刘某因车祸死亡。双方父母因处理冷冻胚胎事宜发生争执。原告认为根据法律规定和风俗习惯,死者双方遗留的冷冻胚胎处置权作为原告生命延续的标志应当由原告来监管和处置。故原告起诉至法院,要求判令沈某与刘某存放于鼓楼医院生殖医学中心的受精胚胎(四支)归原告监管处置。审理中,原告向法院明确提出,所谓监管处置即将胚胎从医院取出,由原告自行保管。 被告刘某某、胡某某辩称,胚胎系他们的女儿留下的唯一东西,要求处置权归其夫妻所有。 第三人鼓楼医院辩称,冷冻胚胎不具有财产的属性,原被告双方都无法继承;沈某夫妻生前已签署手术同意书,同意将过期胚胎丢弃;胚胎的作用为生育,现沈某夫妻已去世,在原被告双方都不具备处置和监管胚胎条件的情况下,胚胎被取出后,唯一能使其存活的方式就是代孕,但该行为违法,原被告双方也无权行使死者的生育权,故要求驳回原告的诉讼请求。 法院审理查明,沈某与刘某因婚后未能生育,要求在南京市鼓楼医院施行体外受精-胚胎移植助孕手术。鼓楼医院生殖中心在治疗过程中,冷冻保存了4枚受精胚胎。 2013年3月20日,沈某驾车途中车辆侧翻,撞到路边树木,造成沈某当日死亡,乘坐人刘某于同年3月25日死亡。 另查明,2012年3月5日,刘某与鼓楼医院签订《辅助生殖染色体诊断知情同意书》一份,刘某在该同意书中明确对染色体检查及相关事项已经了解清楚,同意进行该检查;愿意承担因该检查可能带来的各种风险;所取样本如有剩余,同意由诊断中心按国家相关法律、法规的要求代为处理等。2012年9月3日,沈某、刘某签订《配子、胚胎去向知情同意书》,载明刘某与沈某在鼓楼医院生殖医学中心实施了试管手术,获卵15枚,移植0枚,冷冻4枚,继续观察6枚胚胎。对于剩余配子(卵子、精子)、胚胎,刘某与沈某选择同意丢弃;对于继续观察的胚胎,如果发展成囊胚,刘某与沈某选择同意囊胚冷冻;同日,刘、沈二人签订《胚胎和囊胚冷冻、解冻及移植知情同意书》,鼓楼医院在该同意书中明确,胚胎不能无限期保存,目前该中心冷冻保存期限为一年,首次费用为三个月,如需继续冷冻,需补交费用,逾期不予保存。对于如果超过保存期,刘、沈二人选择同意将胚胎丢弃。 宜兴法院判决认为,公民的合法权益受法律保护。沈某与刘某因自身原因而无法自然生育,为实现生育目的,夫妻双方至鼓楼医院施行体外受精-胚胎移植手术。现夫妻双方已死亡,作为双方父母的原被告均遭受了巨大的痛苦,原告主张沈某与刘某夫妻手术过程中留下的胚胎作为其生命延续的标志,应由其负责保管。但施行体外受精-胚胎移植手术过程中产生的受精胚胎具有发展为生命的潜能,含有未来生命特征的特殊之物,不能像一般之物一样任意转让或继承,故其

胚胎冷冻保存技术

胚胎冷冻保存技术 摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制,从而达到提高胚胎移植效率的目的。研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。 关键词:胚胎冷冻保存 为便于长途运输和随时供移植使用,将那些6~7日龄已有20~30个细胞的新鲜活胚胎(或分割后的半胚胎、1/4胎)在-196℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的70%~80%,胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制,从而达到提高胚胎移植效率的目的。 现有的胚胎冷冻保存方法有四种: 一、常规冷冻法 常规冷冻法:也叫慢速冷冻法、逐步降温法。将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高,最终浓度1.4M),每种冷冻液中平衡5分钟,然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记,放入冷冻仪中进行冷冻。冷冻速率先以1~3~C/分下降至-6~-7℃,在此温度诱发结晶,平衡10分钟,然后,以0.3℃/分的速率降温至-35~_38℃,之后投入液氮中保存。胚胎解冻后,需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度,即从高到低浓度脱除冷冻保护剂,每步5分钟,最后置入含20%血清的PBS保护液中洗涤3次,彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放入0.5M(或1.0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟,再用上述PBS液洗涤3次。 二、一步冷冻法 一步冷冻法:也叫一步细管法。该方法是由慢速冷冻法改进而来,细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的,因此,在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂,从而利于在生产中推广应用。 三、程序冷冻法 程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。 程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂,如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO),使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内,平衡后,利用程序降温仪缓慢降温,最后投入液氮保存。程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂,对胚胎毒性损害小,解冻后存活率较高。但因其操作繁琐,降温速度慢,致使所需时间长,需要特殊的降温装置,在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。 通常在程序化慢冷的液体中,各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂,于室温下,在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡,然后放置在终浓度的冷冻液中。在冷冻仪内于预设的程序下降温标本,经过冷冻保护剂的处理后,胞内渗透压增高,意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自身的特性,

冷冻胚胎的法律性质及权利处置研究

冷冻胚胎的法律性质及权利归属研究 摘要:为了保障不能自然生育子女人群的生育权,诞生了人工辅助生殖技术,而冷冻胚胎技术就是在体外受精——冷冻胚胎移植技术应用过程中产生的,实践中出现了涉及冷冻胚胎的法律问题,包括冷冻胚胎的法律性质、权利归属及权利行使规则。首先,在我国没有明确界定前提下,厘清冷冻胚胎的法律性质是解决问题的前提。其次,在明确冷冻胚胎的法律性质后,需要解决夫妻双方对冷冻胚胎权利归属规则。本文就冷冻胚胎的法律性质、冷冻胚胎的权利归属、冷冻胚胎的权利行使规则,结合“无锡冷冻胚胎案”进行探讨,以期对相关立法、司法的完善有所助益。 关键字:冷冻胚胎法律性质权利归属 2014年9月17日,备受关注的中国首例人体冷冻胚胎监管、处置权纠纷案在无锡市中级人民法院二审落槌。“无锡冷冻胚胎案”1判决的问世,其裁判结果以及二审判决书富有人情味的、体现法官智慧的说理都引起法律界人士的高度关注和热议,并引发各界对冷冻胚胎的法律性质、权利归属及权利行使问题的研究。在冷冻胚胎的法律问题中,最核心的问题就是冷冻胚胎的法律性质的界定。 一、冷冻胚胎的法律性质 (一)国外关于冷冻胚胎的法律性质的学说 国外法学界对冷冻胚胎的法律性质界定主要有三种学说,即主体说、客体说、中介说。 1、主体说 1案情简介:作为独生子女的沈某与杨某车祸死亡后,双方父母就死者遗留下的四枚冷冻胚胎的 归属发生争议,诉至法院。2014年5月,法院一审宣判, 依法以冷冻胚胎不能成为继承的标的为由 判决驳回原告的诉讼请求。2014年9月,法院二审宣判,存放于鼓楼医院的4枚冷冻胚胎由双方父 母共同监管和处置。

主体说认为,“人的生命从受精之时开始”。从这一刻起,冷冻胚胎就具有生命,应受到法律保护。该观点还主张,受精卵及早期人类冷冻胚胎不得销毁、抛弃,人们应像对待人那样去尊重其权利。在美国,一些州的立法机关宣布冷冻胚胎为“法律上的拟制人”。并因此赋予冷冻胚胎与新生婴儿一样的法律权利。这些州承认人的生命开始于受孕,因此保证这些冷冻胚胎的安全就是保证未来自然人的利益。所以,在这种保护之下,冷冻胚胎不能被恶意的销毁并严禁将其捐赠给科研机构。美国路易斯安那州1986 年的《人类冷冻胚胎法》第121条规定了人类冷冻胚胎的定义,即指“具有法律授予权利、由一个或多个人体细胞与基因物质构成的试管受精的人类卵子,并于子宫内发育成为胎儿。”第126条还明确宣布冷冻胚胎为“生物学意义上的自然人,其并不是生育的中间媒介也不是医生的财产。”可见,受精的冷冻胚胎即使是极小的细胞团,也是人类的生命,具有法律主体地位。 2、客体说 客体说认为,该说主张冷冻胚胎仅为精子和卵子捐赠者的财产,将其作为民事法律关系中某种权利的客体对待,而不承认其为独立的潜在生命。该说分为财产说和夫妻私人利益说两种观点,财产说认为其属于财产即“物”,在夫妇之间属于共同财产。夫妻私人生活利益说则认为其不是单纯的物,应属于私生活权的客体。“财产说”把冷冻胚胎视为单纯的物,忽视冷冻胚胎的生命属性,由于过于物化,尚无国家立法予以承认,但在判例法国家的司法实践中曾被采用。如在美国,一些州更侧重于保护捐赠者的利益,关于该冷冻胚胎的处理方式,法律赋予捐赠者以完全的自主决定权。佛罗里达州立法承认受精卵的捐赠者对该枚受精卵的处理拥有共同的自治权。对该冷冻胚胎的“控制”权和决定权由捐赠者共同享有,如果一个捐赠者死亡,那么另外一个捐赠者就有完全的决定权。 3、中介说

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