耐甲氧西林葡萄球菌PBP2a的质粒克隆与构建
【收稿日期】2010-12-27
【基金项目】重庆市卫生局医学科学技术研究项目（2009-2-185）【作者简介】聂红（1969-），女，本科，主管技师，从事微生物学研究，
Email ：nhljl3537@qq．com ；陈维贤，通讯作者，Email ：re-adm@sina．com
文章编号：1005-
376X （2011）05-0407-03【论
著】
耐甲氧西林葡萄球菌PBP2a 的质粒克隆与构建
聂红，王云英，陈维贤
（重庆医科大学附属第二医院检验科，重庆400010）
【摘要】目的
克隆并构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA ）青霉素结合蛋白2a （PBP2a ）全长及转肽酶
区的原核表达质粒。方法
登录基因文库查找获得mec A 基因的编码序列，应用PCR 技术扩增获得DNA 片段，将
此基因片段插入PET-32a 载体，同时酶切鉴定阳性克隆，DNA 序列测定验证序列正确性。结果PCR 扩增获得了
mec A 基因全长及转肽酶区DNA 片段，成功插入到原核表达载体PET32a ，双酶切鉴定及DNA 序列测定证实插入片
段正确。结论
成功构建了PBP2a 全长及转肽酶区片段表达质粒，为该蛋白的纯化表达和疫苗研究奠定了基础。
【关键词】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；青霉素结合蛋白2a ；转肽酶区；mec A 基因
【中图分类号】R378．11
【文献标识码】A
Clone and construction of prokaryotic expression plasmid of MRSA-PBP 2a
NIE Hong ，WANG Yun-ying ，CHEN Wei-xian
（Department of Clinical Laboratory ，the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University ，Chongqing 400010，China ）
【Abstract 】Objective
To clone and construct the prokaryotic expression plasmid of penicillin binding protein 2a
（PBP2a ）of methicillin resistant Staphylococcus aureus （MRSA ）．Method
According to the sequence of mec A gene pub-lished in GenBank ，the target gene fragments were amplified by PCR ，and then inserted into PET-32a plasmid．The recom-bined plasmids were identified by enzyme digestion and the inserted fragments were further confirmed by DNA sequencing．Result
The corresponding prokaryotic expression plasmids of PBP2a had been successfully constructed．Conclusion The
full length of PBP2a and its transpeptidase domain expressing plasmid are successfully constructed ，which establishes the foundation for its purification ，identification and application．
【Key words 】Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ；Penicillin binding protein2a ；Transpeptidase domain ；
mec A gene
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus ，MRSA ）感染约占全部金黄色葡萄球菌感染的60% 80%，
是院内外感染的重要病原菌之一，也是世界范围内耐药性监测的重点对象
［1］
。MRSA 不但对常用的包括甲氧西林在内的所
有β-内酰胺类抗生素耐药，而且表现出对氨基糖苷类、
大环内酯类等多种抗生素广泛耐药，故其临床治疗非常棘手，主动免疫的疫苗开发或者被动免疫的抗体治疗策略是值得重点关注的热点之一。PBP2a 蛋白是MRSA 耐受β-内酰胺类抗生素的耐药决定主要因子，由mec A 基因编码产生［2］，是MRSA 共有的特
征性蛋白，
可作为疫苗开发的靶抗原。本研究利用PCR 技术从MRSA 基因组DNA 中扩增获得编码PBP2a 全长及转肽酶区的DNA 片段，将此目的基因片段克隆至原核表达载体上，
希望为进一步获得纯化的蛋白抗原，并运用于疫苗研究奠定基础。1材料与方法1．1材料
1．1．1菌株和质粒
MRSA 临床分离株、大肠埃希
菌JM109和质粒PET32a 均为本室保存。
1．1．2
试剂及仪器设备
pfu DNA 聚合酶、dNTP 、
DNA 标准品、限制性内切酶BamH I 、Hind Ⅲ以及T4DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；PCR 扩增仪为Biome-tra 公司产品，质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒为O-mega 公司产品；其他常用试剂为本室自行配制。1．2方法
1．2．1
PCR 扩增目的基因片段
PCR 寡核苷酸引
物由北京三德生物技术有限公司合成，引物序列见表1。挑取临床分离并表型确诊的MRSA 菌株，以蒸馏水调成1个麦氏单位浓度，作为扩增模板，PCR 反应体系为25μL ，模板2μL ，dNTP 2μL ，上下游引物各10pmol ，10?buffer 2．5μL ，pfu 聚合酶1U ，蒸馏水补足至25μL 。PCR 扩增条件：94?10min 预变性；94?30s 、56?50s 、72?2min ，循环35个循环；72?10min 延伸。用PCR 产物纯化试剂盒纯化
7
04中国微生态学杂志2011年5月第23卷第5期
回收PCR产物。
表1引物序列
目的基因引物链序列（5'-3'）
PBP2a全长（2000bp）Sense GCGGATCCATGAAAAAGATAAAAATTG
Anitsense GCTAAGCTTGTTCATCTATATCGTATTT 转肽酶区（1000bp）Sense GCGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTC
Anitsense GCTAAGCTTGTTCATCTATATCGTATTT
1．2．2PCR产物和pET32a载体酶切处理PCR产物及pET32a载体分别用BamH I、HindⅢ酶切。酶切体系为40μL，其中DNA片段或载体质粒32μL，BamH I和HindⅢ各2μL，10?K buffer4μL。37?恒温水浴2h，用PCR产物纯化试剂盒纯化酶切产物。
1．2．3连接连接体系总量10μL，其中酶切后的PCR产物6．5μL，酶切处理的载体片段1．5μL，T4 DNA连接酶1μL，连接buffer1μL。置于4?过夜。1．2．4连接产物的转化从LB平板上挑取单个大肠埃希菌JM109菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37?300r/min振摇培养过夜，次日将该菌悬液以1︰100比例转接种于新鲜的LB培养基中，37?300r/min培养2．5 3h，将培养液转入1．5mL EP 管中4000r/min离心10min，弃去上清液，每支EP 管中加入200μL预冷却的0．1mol/L CaCl
2
溶液，混匀后冰浴2h，即获得感受态细菌。将连接产物加入100μL感受态细菌中，轻轻混匀，冰浴30min，42?水浴中热激2min，冰浴2min，加入400μL LB液体培养基，37?180r/min振荡40min，1000r/min离心2min，弃去300μL上清液，将细菌沉淀混匀于剩余的培养液中，均匀涂布于含AMP100μg/mL的LA 平板上，37?孵箱培养过夜。
1．2．5阳性克隆初筛实验挑取LA平板上生长的单个菌落至3mL LA液体培养基，300r/min振摇培养18h，取1mL菌液离心收集菌体（保留约30μL培养液），加入50μL苯酚/氯仿/异戊醇（25︰24︰1）混合液，充分混匀后10000r/min离心2min，取5μL上清液1%琼脂糖凝胶电泳。观察质粒条带，泳动速度较空载体对照慢者为初筛阳性。
1．2．6阳性克隆的酶切及DNA序列测定鉴定挑选初筛阳性的菌株，小量提取质粒，以BamH I和HindⅢ进行双酶切鉴定。酶切体系10μL，其中质粒8μL，BamH I和HindⅢ各0．5μL，10?K buffer 1μL，37?恒温水浴2h，1%琼脂糖凝胶电泳并照相；同时挑选酶切鉴定阳性的质粒进行DNA序列测定。
2结果2．1PCR结果PCR扩增的最终产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见扩增条带分别出现在约1000bp和2000bp附近（图1），与目的片段预期分子量大小一致；显示临床分离的MRSA菌株带有由mec A基因编码产生的PBP2a蛋白
。
1：PBP2a全长菌株扩增带；2：转肽酶区菌株扩增带；3：Marker。
图1PCR产物电泳图
2．2质粒初筛结果连接产物转化后，挑取细菌进行质粒初筛鉴定实验，结果如图2。其中第一泳道为DNA标准，第二泳道为空载体对照，三、四泳道为PBP2a转肽酶区段连接转化后的细菌，五、六为全长PBP2a连接转化后的细菌。从图2可以看出，第三、六泳道质粒带泳动速度较对照慢，且第六泳道泳动速度更慢于第三泳道，可能分别为PBP2a全长和转肽酶区PBP2a阳性克隆，而第四、五泳道质粒带与空载体对照无明显差异，为自连产物
。
1：DNA Marker；2：空载体对照；3、4：PBP2a转肽酶区段连接转化后细菌扩增带；5、6：全长PBP2a连接转化后的细菌扩增带。
图2阳性克隆初筛电泳图
804Chinese Journal of Microecology，May.2011，Vol.23No.5
2．3重组质粒的酶切鉴定和测序挑取初筛阳性第三、六泳道对应的细菌，提取质粒，采用BamH I和HindⅢ双酶切鉴定，结果如图3。与DNA标准带比较，可见第一、二泳道质粒双酶切后分别出现约2000bp和1000bp的插入DNA片段，而自连产物（第三泳道）及空载体对照（第四泳道）均只有载体DNA大片段。证明目的片段成功插入了载体pET32a中，构建成功PBP2a全长及转肽酶区质粒；同时，北京三德生物技术有限公司DNA测序结果为初筛阳性质粒与目的基因片段序列［PBP2a（Y14051）］仅有少量不一致，核苷酸同源性为99．4%，也进一步证实了插入片段的正确性
。
1：PBP2a全长质粒；2：PBP2a转肽酶区质粒；3：自连产物；4：空载体对照；5：Marker。
图3重组质粒的酶切鉴定电泳图
3讨论
PBPs是细菌细胞壁主要结构成分粘肽合成过程中所必需的转肽酶，各种内酰胺类抗生素通过与PB-Ps结合从而抑制PBPs的酶活性，阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌细胞壁缺损，菌体膨胀崩解［3］。对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）产生4种PBPs：PBP1、PBP2、PBP3、PBP4。而MRSA产生了一种特殊的PBP2a，该蛋白由668个氨基酸组成，相对分子质量为76．1kD，对所有β-内酰胺类抗生素亲和力低［4］。由于PBP2a蛋白对β-内酰胺类抗生素亲和力很低，因而很少或不与该类抗生素结合。当β-内酰胺类抗生素破坏高亲和力PBPs时，PBP2a仍能维持细菌的生长和繁殖，表现出耐药性。因此，PBP2a是MRSA的耐药决定因子，受到研究者的重视。
针对金黄色葡萄球菌的疫苗设计工作主要是对该微生物的几个已知的毒力因子。这些因子主要包括金葡菌表面蛋白，荚膜多糖，外膜蛋白和从该病原菌中提取的毒素。虽然相当多的抗原在动物实验中能够对MRSA的感染有保护作为，但迄今为止尚未有能够对免疫人群提供长期保护作用的疫苗产生。PBP2a蛋白是一种跨膜蛋白，其转肽酶区暴露于细胞膜表面，能够与相应抗体充分接触，使其可能成为MRSA疫苗的理想的靶抗原［5］。PBP2a转肽酶区是PBP2a的主要功能区，也是其抗原决定簇分布较多的区段，较全长PBP2a分子量更小，更利于原核表达。
在本实验中，采用对临床分离且通过表型鉴定的MRSA菌株，直接经PCR扩增，产物经凝胶电泳结果如图1显示，扩增条带出在约1000bp和2000bp附近，与预期PBP2a转肽酶区和全长蛋白分子量结果一致，证实所分离菌株均带有PBP2a基因，表明本研究引物设计具有特异性，方法切实可行。
如图2所示，通过采用连接转化、酶切等技术，转化成功后的质粒因带有目的基因片段，分子量较大，泳动速度与对照组比较相对较慢，与预期结果一致，且初筛阳性质粒经酶切鉴定，电泳后结果如图3显示，出现约2000bp和1000bp的插入DNA片段，证明PBP2a全长及转肽酶区基因片段被成功插入载体pET32a中，同时，DNA序列测定结果与目的基因的碱基仅有少量差异，核苷酸同源性大于99．4%，提示通过本研究所建立的方法能有效构建PBP2a全长和转肽酶区质粒，表明本研究所建立方法具有良好的可行性。
综上所述，本研究成功运用PCR扩增及酶切等技术，同时在实验中对目的基因片段选取和实验条件进行优化基础上，克隆了PBP2a全长及转肽酶区片段，将获得的基因片段连接于质粒载体上，成功构建了MRSA PBP2a全长及转肽酶区质粒，为进一步进行PBP2a纯化蛋白的表达指明方向，同时也为制备对抗耐甲氧西林的葡萄球菌疫苗奠定基础。
【参考文献】
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中国微生态学杂志2011年5月第23卷第5期
三种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的比较
三种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的比较 赵自云牟晓峰江秀爱 (山东省青岛市中心医院，青岛266042) 【摘要l目的比较苯唑西林纸片扩散法、微量琼脂稀释法(M I C)和聚合酶链反应(t K I R)法检测甲氧西林耐药金黄色葡萄球茵(M磁滤)的差异。方法用上述3种方法同时检测86株临床分离的金黄色葡萄球茼。结果3种方法同时辁测出53株M R SA和33株甲氧西林敏感金黄色葡萄球茵，一致性为100％。结论三种方法都适于临床实验室准确检测M R SA，尤其是纸片扩散法和M I C法可作为不同级别临床常规实验室确证M R SA检测方法。 【关键词】金黄色葡萄球茵；甲氧西林；苯唑西林纸片扩散法；微量琼脂稀释法；聚合酶链反应 C om par e t hr ee m e t hods t o de t ect l V l R SA Z b．a o zi yun，M u X m of ezl g，扭l ng xi t塘i(Q i D gc ho cen t r al h盎pi t al，Q m gdao，266042) 【A b st m et】O bj ec啦ve T o co m p ar e t he di f fer ences of t he ox aci ll i n dis k dif fus ion m e t hod，m i cr o—agar di l ut i on(m c)and r m l ym er ase chai n r ea ct i on(P CR)t o det ect i on t he m ethi ei l li n—res i s t ant St aphyr l ococcm aul-el l8(M R SA)。M e t hods t hr ee m e t h ods w eFe per f or m ed t o al i a． 1y ze86c l i ni cal i sol a t es of St aphyl o coccus al al℃1．t S．Ih爆咄s53M R SAa nd33m et hi ci U i n—s ens i t i ve St aphyl ococcus aun吣w e陀det ect ed by t he t hr ee m et hod s，s peci fi ci t y w a d00％，s em d t i v i t y w as l oo％。C ondus i on T h ese m ethods勰s ui tabl e f or c li nic al l abor ator ies t o a ee tt r at el y det ect M RSA．es peci al l y t he dis k dif f usi on m et hod a nd M I C coul d be us ed f or di ff e rent l eve ls0【f m u l i n e c l i ni cal l ab or at o r y con f i r m ed M1t SAdet ec t ion．【K ey words]St aphyl赫'ns aureus；M et hiei l li n；T he ox aci ll i n di sk dif fus ion4m et h od；M i er e—agar di l u t i on；P ol ym eras e chai n r eact ion 金葡菌是临床最常见的病原菌之一，在临床分离菌中分离率位居前列，其中以m et hi ei l l i n—r esi st ant St a phyl ococc us aur eus(M R SA)临床意义尤为重要。由于其多重耐药性和易造成医院感染的暴发流行，已成为临床抗感染治疗的一大难题Ll。2J。M R SA对抗生素的耐药性日趋严重且对多种抗生素耐药，因此M R SA引起的医院感染一旦发生，常难以控制。为了解我院医院感染的M R SA耐药表型与基因型之间的关系，进一步加强对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速、及时检出，有效控制M R S A造成的感染，指导临床用药，限制其传播，本文对我院目前常用的检测方法进行了比较。 I材料与方法 1．1菌株来源黄色葡萄球菌标准株(A TC C25923)、金黄色葡萄球菌A T C C43300、大肠埃希菌标准株(A T C C25922)为本室保存；m ecA基因阳性标准M R SA菌株(SA0129)由美国Pf i zer公司研究所提供。临床标本由青岛大学医学院第二附属医院检验科提供，共86株，包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(M SSA)和株M R S A。标本主要来源于创面分离物、引流液、痰、血、中段尿等送检标本。 1．2试剂和仪器基因组D N A提取试剂盒购自美国Pr om ega公司；PC R试剂(Taq D N A聚合酶、4X dN TPs、10×buff er等)购自加拿大M B I公司；D N A M ar ker购自大连T akar a公司；利用D N A S t ar软件设计的引物由上海生工公司合成。苯唑西林为英国O xoi d公司产品。4800型D N A扩增仪为美国PE R K IN公司产品；M i cr os can半自动细菌鉴定仪为美国D at e B蛐公司生产。 1．2实验方法 1．2．1纸片扩散法 1．2．1．1将待测细菌用0．45％N aC I溶液制成0．5麦氏单位(1．5×10C FU／m1)的菌悬液。用接种环将茵悬液划种在和M ul l er—H i nt on平板，然后贴苯唑西林纸片，将种好的平板放入37℃培养箱孵育24小时。金黄色葡萄球菌A TC C25923作为苯唑西林阴性质控菌株、金黄色葡萄球菌A TC C43300作为苯唑西林阳性质控菌株。 1．2．1．2结果判断标准：苯唑西林纸片扩散试验抑菌圈直径≤11m m为耐药；抑菌圈≥12r am为敏感。1．2．2微量琼脂稀释法：用M i er os ea n细菌鉴定仪测定苯唑西林M I C，判断标准遵循临床实验室标准一
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的预防与控制
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的预防与控制措施 一、预防 1、合理应用抗菌药物，在选择抗菌药物时应慎重，以免产生MRSA菌株。 2、早期检出带菌者。加强对其他医院转入者及MRSA易感者的主动监测，尤其是高危人群。细菌室应选用准确的检测方法，发现MRSA，及时向临床报告，以便控制感染和隔离治疗。 3、落实消毒隔离措施，医务人员诊疗每一位病人前后洗手和手消毒。采取标准预防的措施，医务人员做好防护，正确使用手套、隔离衣、口罩、帽子，防止医院感染。 二、报告 1、发现MRSA病人首先要向科主任、护士长报告，及时隔离病人。 2、如果是医院感染病例，必须在24小时之内通过网络报告医院感染管理科。 三、感染控制措施 （一）患者的安置 1、病人的隔离：住院期间尽可能单间隔离，如果为同种病原体感染可同室，但床间距应≥1m，并拉上床边的围帘。 2、设置蓝色隔离标识：ICU放置在床头卡处。普通病房粘贴在病历夹内侧。（二）医护人员的防护 1、洗手和手消毒：诊查和护理病人前后、脱手套后、处理污染物品后、接触伤口前后、接触病人的血液、体液、分泌物、排泄物、黏膜、破损的皮肤或伤口敷料后必须洗手和手消毒。 2、手套、隔离衣：不论是接触患者完整的皮肤或环境表面，例如：医疗设备、床栏杆，都应在进入房间时戴手套。进入房间时应穿隔离衣，并于离开患者医疗环境前脱掉隔离衣及执行手卫生。脱掉隔离衣后，应确保衣服及皮肤不接触污染的环境表面。 3、加强防护：当进行细痰、雾化治疗、纤维支气管镜检查和气管切开等有可能产生气溶胶的操作时，要戴外科口罩和护目镜。 （三）环境的消毒 病房环境表面，尤其是频繁接触的物体表面，如床栏杆、床旁桌、卫生间、门把手以及患者周围的物体表面，应经常清洁消毒，每班至少一次。出现或疑似有多重耐药菌感染暴发时，应增加清洁消毒频次。被患者血液、体液污染之处应立即消毒，1000mg/L健之素擦拭。 （四）医疗器械、设备等用品的消毒 1、遵循标准预防的原则处理相应医疗器械、设备和用品。 2、一般诊疗用品，如血压计和听诊器：尽量专用，不能专用的应在每位病人使用前后进行清洁和消毒。听诊器用75%酒精擦拭，血压计的袖带500mg/L健之素浸泡30分钟。体温计：隔离病人专用，专用的容器进行消毒，每日500mg/L健之素浸泡30分钟。 3、呼吸机等仪器设备专用，用后清洁灭菌。
基因工程原理讲义：基因克隆的质粒载体
第六讲基因克隆的质粒载体 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
基因克隆的质粒载体 一、导言 1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体 其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。2．质粒的类型多种多样 F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的 寄主受体细胞中去。 R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒 的适宜的受体细胞中去。 Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 3．质粒载体 70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。
二、质粒的一般特性 1．质粒DNA(细菌质粒定义) *1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖 于寄主提供核酸酶及蛋白质。 *2.质粒DNA分子大小 文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD *3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系 一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状
耐甲氧西林的葡萄球菌(MRS)检测
耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）检测 1、苯唑西林琼脂筛选试验 培养基：MH琼脂+4﹪ΝαCL和苯唑西林（6ug/ml）倾注成平板。方法：对琼脂可进行“点”接种，或者用棉拭子蘸取相当于0.5麦氏单位的菌悬液进行“划线”接种。 35℃孵育24小时，为最好地从凝固酶阴性葡萄球菌中检测耐甲氧西林菌株，需要奖平板35℃孵育48小时。 结果判断：任何生长即为MRS 质控菌株：金黄色葡萄球菌A TCC29213——敏感株 2、纸片扩散法（K-B法） 苯唑西林和头孢西丁检测mecA基因介导的葡萄球菌耐药性解释标准 菌种头孢西丁纸片法（mm）苯唑西林纸片法（mm） S I R S I R 金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌≥22 －≤21 ≥13 11﹣12 ≤10 凝固酶阴性葡萄球菌≥25 －≤24 注：1、用透射光观察苯唑西林抑菌圈内如有任何可见的生长，都表示苯唑 西林耐药，而头孢西丁用反射光观察抑菌圈内如有任何可见的生长，都表示头孢西丁耐药。 2、根据此解释标准耐药者既为耐甲氧西林的葡萄球菌
药敏实验纸片扩散法的操作流程 于纯培养平板上挑取相同的菌落4-5个放入2ml无菌生理盐水中稀释呈0.5麦氏单位。 用无菌棉签蘸取菌液在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，涂布整个MH平板表面，反复数次，每次旋转平板60度，使整个平板涂布均匀。 涂布后的平板于室温中干燥3-5分钟，用无菌镊子取药敏纸片贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm，90mm 的平板上宜贴6张药敏纸片。 将贴好纸片的平板置35o孵育18-24小时后取出判断结果。 判断结果：根据（CLSI规则）抑菌环的大小，判断为敏感（S）、耐药（R）、或中度敏感（I）。
2014年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的控制措施
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的控制措施 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种流行范围广、治病力强、发病率和死亡率高的病原菌。人体一旦感染，特别是抵抗力降低的患者如住重症监护室的患者、应用免疫抑制剂者、较长时间应用光谱抗菌药物的患者和老年人，可引起败血症、肺炎和毒血症等，延长患者住院时间，如治疗不及时，可危及患者的生命。 一、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的临床表现： 发热，精神差，局部感染症状，而最常见的是肺部感染，其他如皮肤、泌尿道、产妇生殖道感染，重者为败血症。 二、建立和完善对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的监测和报告： 微生物实验室发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）和多重耐药菌的鲍曼不动杆菌等耐药菌时应第一时间报告医院感控办和病人所在的科室。做到早发现、早诊治、早隔离、早治疗。 三、加强抗菌药物的合理应用 认真落实《抗菌药物临床应用的基本原则》和《卫生部办公厅关于进一步加强抗菌药物临床应用管理的知识》要求，严格执行抗菌药物临床应用的基本原则，正确、合理的实施抗菌药物的给药方案，加强抗菌药物临床合理应用的管理，减少或者延缓耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的产生。 四、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的控制措施 1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染带菌患者集中隔离，设置隔离病房，专人管理。 2、进入隔离病房必须穿隔离衣，戴帽子、口罩，患者专人护理。 3、严格遵守手卫生规范，每次诊疗操作结束后必须用抗菌肥皂液洗手或用快速手消毒剂擦手。 4、该病人周围物品、环境和医疗器械，需每天清洁消毒。（用1000mg/L含氯消毒剂擦拭） 5、一般医疗器械如听诊器、体温表或血压计等应专用。 6、隔离病房用后织物，用臭氧初消后封装好，送洗衣房，再用2000mg/L含氯消毒剂处理后方可清洗。 7、连续3个标本（每次间隔＞24h）均未培养出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），方可解除隔离。 8、如有任何疑问，请随时与感控办联系。
英国耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的预防和治疗指南.
英国耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的预防和治疗指南经广泛查阅耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的预防和治疗相关文献综述，并进一步参考英国MRSA抗生素敏感性资料而制定本指南。对由MRSA引起的普通感染的治疗，携带点（carriage sites）MRSA的根除，外科病房感染的预防提出了一些建议。处理此类问题适用的现有几种抗生素以及将来可能适用的新情况。 内容： 1. 基本情况介绍 2. 英国耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）抗生素耐药性的普遍性 3. 糖肽类的使用 4. 皮肤和软组织感染 4.1 脓包和疖 4.2 溃疡和肿痛（sores） 4.3 蜂窝织炎和外科病房感染 4.4 静脉灌注点 5. 尿道感染 6. 骨骼和关节感染 7. 菌血症和心内膜炎 8. 呼吸道感染 9. 眼睛和中枢神经系统感染 10. 携带菌的根除 11. 外科手术感染的预防 12. 总结 注意：所述药物剂量均为成人剂量而非儿童剂量
1. 基本情况介绍 英国MRSA感染控制指南曾经由英国抗菌化疗学会和医院感染学会在1986年和1990年联合出版，并在1998年联合感染控制护理协会出版一次。随着更新的抗生素，例如新糖肽类抗耐药菌抗生素替考拉宁（teicoplanin）、奎宁环基硫甲基普那霉素/二乙氨乙基-磺酰基普那霉素IA(quinupristin/dalfopristin)和利奈唑胺（linezolid）等授权使用，抗生素耐药性健康特别顾问委员会(Health’s Special Advisory Committee on Antimicrobial Resistance，SACAR)要求三家专业机构修订该指南。工作组尽可能地对三期临床试验中的非授权化学物纳入考虑范围。SACAR 要求指南不能像以前的指南那样只专注于MRSA感染的预防和控制，而应扩大范围涵盖MRSA的实验室诊断和易感性试验。英国并不缺乏治疗MRSA的有效抗生素。本指南着眼于解决医院和社区内成年人和儿童MRSA感染的预防和治疗（MRSA的实验室诊断和易感性试验发表在December 2005 issue of JAC and guidelines for the control and prevention of MRSA in hospitals are due to be published in the Journal of hospital Infection)。 文献检索从1998年到2003年，使用MEDLINE和EMBASE在线检索，设限范围人类研究和英文出版。…… 本指南的建议附有分类分级以标定支持该建议证据的水平和力度。分类采用SACAR和CDC的证据评级。每一建议根据现有的科学资料、理论原理、适用性和经济影响来分类，分类如下： IA. 强烈建议执行，有设计良好的试验、临床或者流行病学研究强烈支持； IB. 强烈建议执行，有一定的试验、临床或者流行病学研究支持，并有坚实的理论原理支持； IC. 应邀执行，只有在联邦或州的规则或标准授权下执行，或者代表制定的协会标准； II. 建议执行，有建议性的（非权威性的）临床或流行病学研究支持，或有某理论原理支持； 未解决问题，没有可供建议，没有一致意见或功效没有足够证据。 因为通常没有充足的证据支持哪一种抗生素可供选用，对于过敏或者耐受性较
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的预防与控制措施
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的预防与控制措施 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种流行范围广、致病力强、发病率和死亡率高的病原菌。人体一旦感染，特别是抵抗力降低的患者如住重症监护室的患者、应用免疫抑制剂者、较长时间应用光谱抗菌药物的患者和老年人，可引起败血症、肺炎和毒血症等，延长患者住院时间，如治疗不及时，可危及患者的生命。 一、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的临床表现 发热，精神差，局部感染症状，而最常见的是肺部感染，其他如皮肤、泌尿道、产妇生殖道感染，重者为败血症。 二、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的监测和报告 1、微生物实验室发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）时应按危急值报告要求向所在临床科室、院感科报告。做到早发现、早诊治、早隔离、早治疗。 2、经管医生如确诊为医院感染病例，必须在24 小时内填卡上报院感科。 三、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）预防 ①合理使用抗生素。认真落实《抗菌药物临床应用的基本原则》和《卫生部办公厅关于进一步加强抗菌药物临床应用管理的知识》要求，严格执行抗菌药物临床应用的基本原则，正确、合理的实施抗菌药物的给药方案，加强抗菌药物临床合理应用的管理，减少或者延缓耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的产生。 ②早期检出带菌者。加强对从其他医院转入者及MRSA易感者的检查，重点筛查高危人群，提高病原学监测送检率。同时微生物室应选用准确的检测手段，发现MRSA，及时向临床和院感科报告，以便控制感染和隔离治疗。 ③加强消毒与环境保洁。医护人员检查病人前后要严格洗手消毒，应用一次性口罩、帽子、手套，医疗用品要固定，以防交叉感染。每天按要求对环境及物体表面进行清洁与消毒。 四、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的控制措施 1、微生物实验室负责耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的监测，一旦发现MRSA 耐药模式，立即通知患者所在临床科室和院感科。 2、临床科室接到检验科报告后，立即报告科主任、护士长，并采取相应的预防控制措施。 ⑴立即将感染或定植患者隔离于单间或同种病原同室隔离。 ⑵在患者病床床头、病历夹、病人一栏表上张贴隔离标识（蓝色为接触隔离）。 ⑶尽量减少与MRSA感染或定植者接触的医务人员数量；最好限制每班诊疗患者为医生、护士各一人，所有诊疗尽可能由他们完成，包括标本的采集。 ⑷严格执行手卫生，有可能接触患者的伤口、溃烂面、黏膜、体液、引流液、分泌物、排泄物时，应当戴手套。
社区获得甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌
?综述? 社区获得甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 汪 复 关键词: 耐甲氧西林金葡菌; 葡萄球菌基因盒染色体; 杀白细胞素; 脉冲场电泳中图分类号:R978.11 文献标识码:A 文章编号:100927708(2005)0620376205 Community 2acquired methicillin 2resistant St a phylococcus aureus W A N G Fu.(I nstit ute of A ntibiotics ,H uas han Hos pit al ,S hang hai 200040,Chi na ) 作者单位:复旦大学附属华山医院抗生素研究所,上海 200040。 作者简介:汪复,女,教授。 通讯作者:汪复。 金葡菌是引起感染性疾病的重要致病菌,侵袭性金葡菌感染常可导致患者死亡。上世纪40年代青霉素应用于临床后患者的预后获显著改善,但不久便出现产青霉素酶的耐药菌株,甲氧西林等耐酶青霉素能有效抑制该耐药株。随后迅即出现遍布世界各地医院的耐甲氧西林金葡菌(MRSA ),该菌对所有β内酰胺类抗生素耐药,但迄今MRSA 在社区中仍很少发现[124]。 早在1982年国外已有社区发生MRSA 感染爆发流行的报道[324],但通常被认为系由1株医院获得MRSA (HA 2MRSA )在社区播散所致。直至20世 纪90年代后期,美国和澳大利亚先后报道社区获得(或社区相关)MRSA (CA 2MRSA )感染,多数患者 临床表现为皮肤软组织感染,但也有少数严重侵袭性感染的报道。1999年美国CDC 报道4例儿童患者死于CA 2MRSA 引起的脓毒症,其中3例合并坏死性肺炎和(或)脓胸 [5] ,由此引起临床的高度关注。 此后许多国家地区都有CA 2MRSA 感染逐渐增多的报道,包括英国、法国、加拿大、芬兰、沙特阿拉伯、新西兰、日本和我国台湾等 [6] 。 一、CA 2MRSA 发生率 目前关于CA 2MRSA 菌株和CA 2MRSA 感染还缺乏统一的定义,因此尚无法获知CA 2MRSA 的确切发生率。有作者荟萃分析1996年1月至2002 年2月间已发表的关于CA 2MRSA 文献发现,不同作者对于CA 2MRSA 至少采用了8种不同的定义[7]。一般认为CA 2MRSA 应是自社区发生的感染患者,或在其入院48h 内分离所得的MRSA 菌株,并且该患者以往身体健康,无发生HA 2MRSA 感染的危险因素,近期亦无医疗保健机构接触史[8]。但实际情况远非如此简单,这是因为:①HA 2MRSA 感染患者出院后,其中部分患者仍可带菌达数月至数年之久(有报道最长可达40个月),这些带菌者可能在社区中播散HA 2MRSA ;②CA 2MRSA 感染的患者虽然绝大部分临床表现为皮肤软组织感染,但个别严重病例(例如表现为脓毒症或坏死性肺炎)可能需住院治疗。已有医院内CA 2MRSA 感染爆发流行的报道。因此有的学者建议CA 2MRSA 应改为社区发病(community onset )MRSA (CO 2MR 2SA )更为确切,说明系在社区中发病,但病原菌不一 定从社区获得;因而使CA 2MRSA 与HA 2MRSA 难以区分。最近CDC 建议鉴别两者的标准为:CA 2MRSA 应是:①自患者在门诊或入院48h 以内分离 的菌株;②该患者1年内无住院或与托儿所、护理院、收容所等机构接触史;③无留置导管或人工医疗装置[8]。 1996年1月至2002年2月有关CA 2MRSA 的 文献荟萃分析,重点分析:①住院患者MRSA 分离株中CA 2MRSA 的百分率;②社区人群中MRSA 的带菌率。结论是:①医院MRSA 分离株中CA 2MRSA 占30.2%(回顾性分析)和37.3%(前瞻性 分析);②8350名社区人群中分离获得MRSA 者占
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌治疗指南
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染治疗指南 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是对一线抗生素普遍耐药的一类金黄色葡萄球菌，是院内感染的重要病因之一。近15年来，社区MRSA（CA-MRSA）感染逐渐增多，日益成为严重的健康问题，尤其侵入性感染危害严重。据统计，2005年，美国共发生 94360例侵入性MRSA感染，超过18000例死亡，其中多数为院内感染，约1/7为社区MRSA感染。 2011年1月4日，美国感染性疾病学会（IDSA）首次发布MRSA 感染患者的循证治疗指南，对多种MRSA感染相关临床综合征的治疗进行了探讨，包括皮肤和软组织感染（SSTI）、菌血症和心内膜炎、肺炎、骨和关节感染及中枢神经系统感染。推荐内容涉及万古霉素剂量和监测、万古霉素低敏感性 MRSA菌株感染的治疗及万古霉素治疗失败后的替代治疗等，具有较高的临床指导价值。 该指南的主要编写者之一，美国加州大学凯瑟琳〃刘（Catherine Liu）说，MRSA已日益成为一个重要的公共卫生问题，医生在诊疗过程中常遇到困难。本指南为皮肤和各种侵入性真菌感染治疗建立了框架，其内容包含了最新的治疗信息，且推荐使用的抗生素在临床上应用广泛。
在此，本报选取部分内容进行介绍，并邀请浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室肖永红教授进行要点分析及评论。 指南推荐 CA-MRSA SSTI ●对于化脓性蜂窝织炎门诊患者，在培养结果得出前，推荐针对CA-MRSA行经验性治疗5~10天（A-Ⅱ）。 ●对于非化脓性蜂窝织炎门诊患者，推荐针对B族溶血性链球菌感染行经验性治疗（A-Ⅱ）。对于β-内酰胺类药物反应不佳及伴全身毒性反应患者，建议对CA-MRSA进行经验性覆盖。推荐治疗5~10天。 ●对于SSTI门诊患者的CA-MRSA经验性覆盖治疗，可选口服抗生素包括：克林霉素、复方磺胺甲唑（TMP-SMX）、四环素类和利奈唑胺（A-Ⅱ）。在必要时，可同时覆盖B族溶血性链球菌和CA-MRSA，可选药物包括：克林霉素（单用）、TMP-SMX或四环素类药物联合β-内酰胺类药物及利奈唑胺（A-Ⅱ）。 ●目前不推荐用利福平（单药或联合）治疗SSTI（A-Ⅲ）。 ●对于复杂性SSTI住院患者，除手术清创和应用广谱抗生素外，应在培养结果得出前进行MRSA经验性治疗7~14天。 ●上述治疗均应根据患者临床反应进行个体化调整。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制及检测
#综述#耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制及检测 朱以军综述李向阳审校 =摘要>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA)是医院内感染和社区感染的重要病原菌之一,其 检出率逐年增高,耐药性不断增强,对临床治疗提出严峻挑战。阐明M R SA的耐药机制以及快速准 确地检测M RSA是预防和控制M RSA感染的基础和重要环节,也是当前M RSA研究的热点。现就 M RSA的耐药机制及其检测方法的研究进展作一综述。 =关键词>甲氧西林抗药性;葡萄球菌,金黄色;基因,细菌;抗药性,微生物 自从1961年Jevons首次分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylo coccus au-r eus,MRSA)以来,MRSA在世界各地感染率和分离率不断增加,已成为目前医院内感染的重要病原菌之一。在美国,M RSA占院内感染分离的金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)的比率从1987年的14.3%上升到1997年的39.7%[1]。李家泰等[2]监测表明,我国MRSA检出率为27.55%,而医院内感染(ho spital in-fections,H I)患者中M RSA检出率显著高于社区感染(co mmunity-acquired infections,CAI)患者。1996年日本首先发现对万古霉素敏感性降低的金黄色葡萄球菌(vancom ycin intermediate staphylo coccus au-r eus,V ISA)。随后,美国、英国、德国、意大利等国也陆续报道了VISA,给M RSA感染的临床治疗带来严峻挑战。目前,M RSA感染与乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)同时列为世界上最难解决的三大感染性顽症。因此,从基因水平阐明MRSA的耐药机制,快速准确地检测M RSA对其感染的控制有重要意义。现就M RSA的耐药机制及检测方法作一简要综述。 M RSA的耐药机制 1.MRSA的耐药决定因子)))m ec基因:MR-SA的染色体上携带有一个甲氧西林敏感金葡菌(M SSA)所不具备的甲氧西林耐药决定因子)))m ec 基因,其大小为30~50kb,为一段外源性的插入片段,通常位于pur-nov-his基因群附近。m ec基因包括mecA基因、mecI和mecR1基因以及mec相关基因。mecA基因长约 2.13kb,编码产生78@103的青霉素结合蛋白(penicillin-binding protein,PBP)2a,其基因序列具有细胞壁合成转肽酶基因结构特征。 mecI和mecR1是调控m ecA转录的一对调节基因,位于mecA启动子上游。通常情况下,mecI编码产生的M ecI蛋白结合在m ec基因的启动子部位,使mecA基因不能被转录。当诱导物存在时,m ecR1基因编码产生的MecR1蛋白能够去除MecI蛋白对mecA的阻遏作用,去阻遏的mecA经RNA多聚酶转录、翻译产生PBP2a。mecI和m ecR1的结构、功能和调节机制与B-内酰胺酶调控组件(blaI和blaR1)相似。BlaI是阻遏B-内酰胺酶基因转录的DNA结合蛋白,BlaRI则在B-内酰胺类抗生素存在时诱导B-内酰胺酶基因转录,产生B-内酰胺酶。有学者提出,mecA 基因是PBP基因和B-内酰胺酶基因的同源性重组产物[3]。因此,m ecA可受B-内酰胺酶调控组件blaI和blaR1的共同调节。但m ecR1-mecI对mecA的调节作用比blaR1-blaI强。 mecA、mecR1和mecI整合在20~45kb的mec 相关基因中,这些基因包括IS431、T n554、pUB110和pT181等。它们编码产生对非B-内酰胺类抗生素的耐药因子,导致MRSA的多重性耐药。其中T n554位于m ecA的5c端,包含编码红霉素耐药的ermA基因。IS431则位于m ecA的3c端,由于缺失、重排、重组的发生,它与mecA基因间的距离变化很大,IS431是葡萄球菌染色体和质粒极普遍的插入序列,与四环素耐药有关[4]。 mec基因的起源尚未完全阐明,有证据表明,金葡菌的SCC m ec基因(staphylococcal chro mosome cassette m ec)可能来源于凝固酶阴性的葡萄球菌,如松鼠葡萄球菌携带的m ecA基因[5]。目前,关于MR-SA的起源有两种假说[6]:一种是单克隆假说,该假说是在对早期MRSA的m ecA基因和T n554基因进行的限制性片段长度多态性分析的基础上提出的,认为mecA是很偶然地进入金葡菌并以单一的M RSA克隆形式在世界各地蔓延;但有不少学者对该学说提出质疑,因为有资料表明mecA基因能反复地水平传播给8种以上金葡菌家系,在抗生素的选择压力下有更多的耐药克隆被传播。第二种假说通过多位点酶电泳分型检测mecA,认为M RSA的mecA基因是经过水平传播、长时间的演变而进入不同种系的MSSA 中,使用DNA芯片技术已检测出至少5种以上的分 作者单位:325027浙江,温州医学院附属第二医院检验科
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的预防与控制措施知识分享
而寸甲氧西林金黄色葡萄球菌的预防与控制 措施
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的预防与控制措施 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA是一种流行范围广、致病力强、发病率和死亡率高的病原菌。人体一旦感染，特别是抵抗力降低的患者如住重症监护室的患者、应用免疫抑制剂者、较长时间应用光谱抗菌药物的患者和老年人，可引起败血症、肺炎和毒血症等，延长患者住院时间，如治疗不及时，可危及患者的生命。 一、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRS）感染的临床表现 发热，精神差，局部感染症状，而最常见的是肺部感染，其他如皮肤、泌尿道、产妇生殖道感染，重者为败血症。 二、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRS）的监测和报告 1、微生物实验室发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA时应按危急值报告要求向所在临床科室、院感科报告。做到早发现、早诊治、早隔离、早治 疗。 2、经管医生如确诊为医院感染病例，必须在24小时内填卡上报院感科。 三、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRS）预防 ①合理使用抗生素。认真落实《抗菌药物临床应用的基本原则》和《卫生 部办公厅关于进一步加强抗菌药物临床应用管理的知识》要求，严格执行抗菌药物临床应用的基本原则，正确、合理的实施抗菌药物的给药方案，加强抗菌药物临床合理应用的管理，减少或者延缓耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA 的产生。 ②早期检出带菌者。加强对从其他医院转入者及MRSA易感者的检查，重点筛查高危人群，提高病原学监测送检率。同时微生物室应选用准确的检测手 段，发现MRSA及时向临床和院感科报告，以便控制感染和隔离治疗。 ③加强消毒与环境保洁。医护人员检查病人前后要严格洗手消毒，应用一次性口罩、帽子、手套，医疗用品要固定，以防交叉感染。每天按要求对环境 及物体表面进行清洁与消毒。 四、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRS）的控制措施 1、微生物实验室负责耐甲氧西林金葡菌（MRSA的监测，一旦发现MRSA 耐药模式，立即通知患者所在临床科室和院感科。 2、临床科室接到检验科报告后，立即报告科主任、护士长，并采取相应的预防控制措施。 ⑴立即将感染或定植患者隔离于单间或同种病原同室隔离。 ⑵在患者病床床头、病历夹、病人一栏表上张贴隔离标识（蓝色为接触隔离）。
综述 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究进展
综述 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究进展随着抗生素产品使用的次数越来越频繁，同时新研制的广谱抗生素药品也在持续出现，结果导致细菌的耐药性能越来越强大，逐渐形成了国内外专家都极为重视的公共领域的卫生健康专题。在医院期间受到感染的基本病源菌－耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)很容易在临床上发生感染现象，而且因为这种病原菌的表现是多重耐药( multi drug resistance，MDR)，容易导致感染现象的突然出现和传染，也成为了在医院临床的医治阶段十分不容易处理的一个难度较大的问题以及分析研究的重要领域[1]。MRSA在医院中的感染情况较为普遍，社区获得性 MRSA的感染情况因此会出现升高的迹象因此得到了广大医务人员的重视。同时在世界各地都发现了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌( vancomycin resistant Staphylococous aureus，VRSA)，VRSA的发现可以说完全突破了各国医学上对于MRSA进行防御的较为关键的领域，所以也被人们当成了沉默的杀手( Sillent killer)以及超级细菌( Superbug)，目前对于MRSA的医院中感染情况的分析实验情况以及防御和质量进行了相关表述[2]。 1 .耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的历史研究 有专家在上世纪六十年代第一次在英国研究并且介绍了全球第一例的MRSA[3]，不久以后，不少发达国家也都陆续介绍了MRSA的感染情况，在上世纪八十年代之后，伴随着抗生素的类型持续拓展以及在医院临床上的大量采用，MRSA导致病人出现恶劣感染情况的发病概率在世界各国也以很高速度在提高，因为MRSA的异质性以及多重的耐药特性，病人的身体出现感染以后的病死几率可以达到了百分之五十以上，并且根据专家的介绍，在英国的四十个检测机构对于MRSA的检查发现概率超过百分之五十[4]。美国的疾病预控机构对于整个美国重症监护房间内部的感染病人进行了相关统计，MRSA的感染率也超过了百分之五十，不过MRSA在部分地区的检查发现概率不算高，比如在瑞典仅仅为0.2%，在丹麦只有0.2%。现在全球很多地区MRSA的感染概率不断提升，很多亚洲地区MRSA的感染可能性已经超过了百分之八十[5]。在我国很多省市的医疗机构中金黄
基因克隆的质粒载体
基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表 达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一 个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们 是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由 3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往 在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是 用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体 :具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌研究进展
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌研究进展 本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！ 金黄色葡萄球菌是造成医院和社区获得血流感染、皮肤及软组织感染的主要致病菌。自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)检出以来，其耐药范围的扩大和耐药程度的曰益加重，给临床治疗带来较大困难，被称为“超级细菌”。了解MRSA现状可更好治疗和避免传播。本文对MRSA的流行病学、危险因素、耐药机制等研究进展综述如下。 1MRSA概念 根据2014年CLSI诊断标准，“耐甲氧西林”或“耐苯唑西林”指表达mec或对青霉素酶耐药，当头孢西丁对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径4 mg/L时可将其判定对苯唑西林耐药。近年来，随着抗生素的广泛应用，逐渐出现了对万古霉素中介或耐药MRSA，分别称为VISA(vancomycirr intermediate Staphylococcus aureus )和VRSA (vancomycin—resistant Staphylococcus aureus )。VISA和VRSA定义为金黄色葡萄球菌对万古霉素的最低抑菌浓度分别为4?8
mg/L和> 16 mg/L。MRSA具有毒性强、耐药谱广和耐药机制复杂及传播速度快的特点，可分为社区获得性MRSA (community-acquired MRSA，CA-MRSA)和医院获得性MRSA(hospital-acquired MRSA，HA-MRSA)。CA-MRSA是患者院外无感染MRSA 危险因素和入院72 h 内获得MRSA[1]。CA-MRSA 是与HA- MRSA不同的表型和基因型一种病原体[2]。HA- MRSA指在接触过医疗机构的个体间相互传播的MRSA菌株，HA-MRSA感染可在医院内发病，也可在社区内发病。 2流行病学 1961年Jevone在英国首次发现MRSA。自首次检出MRSA，其感染率不断上升，1985年开始爆发流行，已成为医院感染重要的致病菌。20世纪90年代MRSA检出率为50%以上。90年代后世界各地有关MRSA流行研究的报道明显增加，1975年美国MRSA 的分离率为2. 4% , 2002年已上升至50% ；1999年JAC[]报道，欧洲不同国家MRSA发生率最低不足1%，最高可达80%。在东欧MRSA非暴发流行地区，患病率仍高达20% ,2011年欧洲部分地区耐药性监测研究结果显示MRSA检出率平均为31%，从9%(瑞典）?60. 2% (葡萄牙）[]。我国自1998年开始细菌