plat-e病毒包装细胞文献
Gene Therapy (2000)7,1063–1066
?2000Macmillan Publishers Ltd All rights reserved 0969-7128/00$https://www.wendangku.net/doc/b813236593.html,/gt
VIRAL TRANSFER TECHNOLOGY BRIEF COMMUNICATION
Plat-E:an ef?cient and stable system for transient packaging of retroviruses
S Morita,T Kojima and T Kitamura
Department of Hematopoietic Factors,Institute of Medical Science,University of Tokyo,4-6-1Shirokanedai Minato-ku,Tokyo 108-8639,Japan
A potent retrovirus packaging cell line named Platinum-E (Plat-E)was generated based on the 293T cell line.Plat-E is superior to existing packaging cell lines regarding ef?ciency,stability and safety.The novel packaging constructs utilized in establishment of Plat-E ensure high and stable expression of viral structural proteins.Conventional packaging con-structs made use of the promoter of MuLV-LTR for expression of viral structural genes gag-pol and env,while our packaging constructs utilized the EF1?promoter,which is 100-fold more potent than the MuLV-LTR in 293T cells in combination with the Kozak’s consensus sequence upstream of the initiation codon resulting in high expression Keywords:packaging cell;retroviruses;ecotropic;EF1?promoter
Retroviral vectors and packaging cells are important tools for gene transfer applications.Introduction of retroviral vectors containing the gene of interest into suitable pack-aging cells enables production of infectious retroviruses,and these particles can infect target cells and stably trans-mit the gene of interest into chromosomes.In conven-tional strategies,stable high producers of a retrovirus vector harboring a gene of interest were established by transducing the retrovirus construct into NIH3T3-based packaging cells such as PA317,1and 2–3months were usually needed to acquire high producers.Pear et al 2developed a unique packaging system by which high titer retroviruses can be obtained in 3days by transient transfection.The expression of viral structural genes was driven by the MuLV LTR in Bosc23cells.For transient transfection,the combination of Bosc23cells and the pMX-neo vector 3produced 1–3×106/ml viruses,assessed based on the number of neomycin resistant col-onies of the infected NIH3T3cells (data not shown).Since Bosc23cells carry the large T antigen,we attempted to increase titers of the retroviruses by introducing the SV40origin to the pMX vector for ampli?cation of the vector.However,this proved unfeasible (data not shown),sug-gesting that the limiting factor was the expression level of the viral structural proteins in the packaging cells.Bosc23was obtained by cotransfection of the plasmid encoding gag-pol together with the plasmid encoding the hygromycin-resistant gene and the plasmid encoding env
Correspondence:T Kitamura
Received 3November 1999;accepted 3March 2000of virus structural proteins in Plat-E cells.To maintain the high titers of retroviruses under drug selection pressure,we inserted the IRES (internal ribosome entry site)sequence between the gene encoding gag-pol or env,and the gene encoding a selectable marker in the packaging constructs.Plat-E cells can stably produce retroviruses with an average titer of 1×107/ml for at least 4months.In addition,as we used only the coding sequences of viral structural genes to avoid inclusion of unnecessary retrovirus sequences in the packaging constructs,the probability of generating the repli-cation competent retroviruses (RCR)by recombination can virtually be ruled out.Gene Therapy (2000)7,1063–1066.
together with the plasmid encoding another selection gene GPT (guanine phosphoribosyl transferase),one after the other.Therefore,expression of selectable markers did not guarantee the expression of gag-pol or env genes,which may account for the instability of the cells in producing high-titer retroviruses.
A similar packaging cell line Phoenix-E 4has also been developed.In Phoenix-E cells,the plasmids encoding the gag-pol and env genes were cotransfected with selection markers,which did not warrant the stable expression of the gag-pol and env genes in the selection drug,hygromy-cin and diphtheria toxin,respectively.There were several improvements in the Phoenix-E cells when compared with Bosc23cells.First,the RSV and CMV promoters,which are much stronger than MuLV-LTR in 293T cells,were used to express the gag-pol and env genes,respect-ively.Second,the internal ribosome entry site (IRES 5)sequence was used to express gag-pol and a cell surface marker CD8simultaneously which enables sorting of high expressers of the gag-pol gene.However,one needs to sort cells from time to time to maintain the expression levels of the gag-pol gene.
To design a packaging cell line which can stably pro-duce retroviruses with high titer,we searched for a strong promoter to drive expression of viral structural proteins in 293T cells using the FACS-GAL assay.6Among seven promoters tested,the EF1?and CMV pro-moters induced high expression of lacZ (Figure 1).The activities driven by these promoters were 100-fold higher than those by LTR utilized in Bosc23cells,and even exceeded those by SV40and SR ?promoters,which enable ampli?cation of vectors in 293T cells expressing
Plat-E:a system for transient packaging of retroviruses
S Morita et al
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Therapy
Figure1Activities of various promoters in293T cells.The activities of
the seven promoters,SV40,SR?,EF1?,RSV,TK,MuLV LTR and CMV
were evaluated by expression of lacZ under the control of each promoter in
293T7cells by the FACS-GAL assay as described.6Brie?y,cells(1×106)
transfected with each promoter construct were suspended in50?l of phos-
phate buffered saline(PBS),then incubated for5min at37°C.FDG
(?uorescein di-?-d-galactopyranoside;Molecular Probes,Eugene,OR,
USA)was dissolved in distilled water,warmed at37°C and50?l of2
m m FDG solution was added to50?l of cell suspension.After1min of
incubation at37°C,1ml of PBS was added followed by incubation on ice
for2h.To stop the reaction,20?l of50m m PETG(phenylethyl-?-d-
thiogalactoside;Sigma,St Louis,MO,USA)was added,and the prep-
aration was placed on ice until being subjected to FACS analysis.
the SV40large T antigen.Because we thought that the
promoters of housekeeping genes were more suitable
than the viral promoters for driving stable gene
expression in mammalian cells,we used the EF1?pro-
moter to express the viral structural proteins in293T cells
(Figure2).In addition,IRES was inserted between the
gag-pol or env gene and the selection marker in the pack-
aging constructs described here.Therefore,expression of
the selection marker is a direct re?ection of gag-pol or env
expression in the same cells.
Packaging constructs pEnv-IRES-puro r and pGag-pol-
IRES-bs r,which were constructed as described above,
were sequentially transfected into293T cells and50sub-
clones resistant to both puromycin and blasticidin were
isolated.Among50subclones,clone1named Platinum-
E(Plat-E)produced the retrovirus which had the highest
infection ef?ciency and was used for further analysis.The
titer of the retroviruses was about1×107/ml when tested
on NIH3T3cells,using serially diluted virus super-
natants of Plat-E cells transfected with pMX-lacZ(data
not shown).We next compared early passages of Plat-E
cells with those of Bosc23cells and Phoenix-E cells with
regards to long-term stability to produce high-titer retro-
viruses by transient transfection(Figure3).Culture con-
ditions of the three packaging cell lines were as follows:
Bosc23cells were grown in DMEM with10%fetal bovine
serum containing the GPT selection reagents as indicated
by the manufacturer(Specialty Media,Lavallette,NJ,
USA).Phoenix-E cells were sorted by FACS for
expression of CD8and maintained in DMEM with
10%
Figure2Schematic diagrams of packaging constructs.The packaging
constructs used for development of Plat-E are shown.The fragment carry-
ing the selectable marker,the blasticidin resistant gene(bs r)or the puro-
mycin resistant gene(puro r),was obtained by PCR using a pair of oligo-
nucleotides(for bs r:5?-AAAACATTTAACATTTCTCAACAAG-3?,5?-
ACGCGTCGACTTAATTTCGGGTATATTTGAGTG-3?,for puro r:5?-
ACCGAGTACAAGCCCACG-3?,5?-ACGCAGATCTTCAGGCACCG
GGCTTG-3?),and were inserted in the NcoI and SalI site(for bs r),or in
the NcoI and BglII site(for puro r)of pMX-IRES-EGFP.8The fragments
containing the IRES sequence and either of bs r and puro r were excised
from the vector by NotI and SalI for bs r,or NotI and BglII for puro r,
respectively.The viral structural genes,gag-pol and env were ampli?ed
by PCR,using the MoMuLV genome as a template,and the oligonucleo-
tide primers were used as follows.Each primer contains either the EcoRI
site or the NotI site(underlined)and the5?primers also contain a Kozak’s
consensus sequence GCCGCCACC located upstream of the initiation
codon.gag-pol:5?-CGAATTCGCCGCCACCATGGGCCAGACTGTT
ACCACTCCCTTAA-3?;5?-TACGCGGCCGCTCTGAGCATCAGAA
GAA-3?;env:5?-cGAATTCGCCGCCACCATGGCGCGTTCAACGCT
CTCAAAA-3?;5?-TACGCGGCCGCTATGGCTCGTACTCTAT-3?.The
resulting PCR fragments were digested with the EcoRI and the NotI frag-
ment.Finally,the fragment containing the viral structural genes,and the
fragment containing the IRES sequence and the selection marker were
inserted downstream of the EF1?promoter in the pCHO vector,a deriva-
tive of pEF-BOS.9For construction of the pGag-pol-IRES-bs r,pCHO was
digested with BamHI,and converted to a blunt end by Klenow reaction,
and then ligated with SalI linker(Stratagene,La Jolla,CA,USA).The
EcoRI–NotI fragment of gag-pol,and the NotI–SalI fragment of IRES-bs r
were inserted into the EcoRI and the SalI site of pCHO by triple ligation.
To construct pEnv-IRES-puro r,pCHO was digested with EcoRI and
BamHI,and the EcoRI–NotI fragment of env,and the NotI–SalI fragment
of IRES-puro r were inserted into the EcoRI and the BamHI sites of pCHO.
Packaging constructs pEnv-IRES-puro r and pGag-pol-IRES-bs r were
sequentially transfected into293T cells using Fugene(Boehringer
Mannheim,Germany)according to the manufactuer’s recommendations.
One day after transfection with pEnv-IRES-puro r,293T cells were selected
in DMEM containing1?g/ml puromycin.The selected cells were then
transfected with the pGag-pol-IRES-bs r vector,and subcloned in the pres-
ence of puromycin and blasticidin(10?g/ml).The selected clones were
tested for their potential to produce retroviruses.EF1?,EF1?promoter;
IRES,internal ribosome entry site;bs r,blasticidin resistant gene;puro r,
puromycin resistant gene.
fetal bovine serum containing hygromycin(300?g/ml)
and diphtheria toxin(1?g/ml)for1week,then cells
were transferred to DMEM with10%fetal bovine serum
without hygromycin and diphtheria toxin.Plat-E cells
were always maintained in DMEM with10%fetal bovine
serum containing blasticidin(10?g/ml)and puromycin
(1?g/ml).On one hand,infection ef?ciency of retro-
viruses produced from Bosc23was decreased within3
months,and that of retroviruses produced from the Pho-
enix-E cells also decreased in time(Figure3).On the
other hand,Plat-E produced retroviruses with an infec-
tion ef?ciency greater than75%with a titer of about
1×107/ml for at least4months under drug selection
pressure.
To compare the expression level of gag-pol and env
mRNA in Plat-E,Bosc23and Phoenix-E packaging cell
Plat-E:a system for transient packaging of retroviruses S Morita et al
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Figure3Long-term stability of Plat-E in producing high titer retro-
viruses.The infection ef?ciencies of Ba/F3cells using retroviruses derived
from pMX-GFP produced by Plat-E,Bosc23and Phoenix E were exam-
ined at the indicated times.pMX-GFP was constructed as follows.The
GFP fragment was excised from the pEGFP-N1vector(Clontech,Palo
Alto,CA,USA)by EcoRI and NotI,and was inserted into the EcoRI–
NotI site of the pMX vector.3Transfection and infection were performed
as described10except that we used Fugene(Boehringer Mannheim)instead
of LipofectAmine(Gibco-BRL,Rockville,MD,USA).
lines,Northern blot analysis was done using the cells cul-
tured for3weeks.The expression levels of gag-pol and
env mRNA was four-fold and10-fold higher,respect-
ively,in Plat-E cells than in the other packaging cell lines
(Figure4a).The RT activity in the cell lysate was also
analyzed.Plat-E produced at least twice more RT activity
when compared with Bosc23and Phoenix-E cells(Figure
4b).In addition,the expression level of env protein was
much greater than that of Bosc23and Phoenix-E(Figure
4c)when evaluated by antibody staining raised against
the env gene product.
As the retroviral structural genes were encoded on the
two different plasmids,three recombination events are
necessary to generate the replication competent retro-
viruses(RCR).In addition,the probability of recombi-
nation was minimized by using only the coding sequence
of gag-pol and env genes isolated by PCR from MuLV gen-
ome in the packaging constructs.In fact,production of
RCR was tested by the XC plaque assay,13and no RCR
was detected from Plat-E cells after transfection of pMX-
GFP.As for a positive control,a supernatant of
MoMuLV-infected C3H2K cells(a gift from Dr Hoshino)
was used after serial dilutions,and the viral titer of the
wild-type MoMuLV produced from C3H2K cells was
estimated as1×104/ml.
In conclusion,we report here a stable retrovirus pack-
aging cell line Plat-E which has several advantages over
the existing packaging cell lines.First,the EF1?promoter
in the packaging constructs,in combination with the
Kozak’s consensus sequence,allows production of retro-
viruses with a titer of1×107/ml.Second,a bicistronic
vector carrying the IRES sequence was used in the pack-
aging constructs to ensure stable expression of the viral
structural genes under the drug selection pressure,which
Gene
Therapy
Figure4Comparison of gag-pol and env expression in Bosc23,Phoenix-
E and Plat-E.(a)Northern hybridization of gag-pol and env.Expression
of gag-pol and env in Plat-E(3)was compared with that in Bosc23(1)
and Phoenix-E(2)by Northern hybridization.The probes used were the
EcoRI–NotI fragment of pGag-pol-IRES-bs r and pEnv-IRES-puro r.(b)RT
assay of cell lysate of Bosc23,Phoenix-E and Plat-E.Cell lysate of293T
cells was used as a negative control(1),1ng of HIV RT was mixed with
the cell lysate of293T cells(2),and was used as a positive control.RT
activities derived from Bosc23(3),Phoenix-E(4),Plat-E(5)were meas-
ured as described.11(c)Expression of env in Bosc23,Phoenix E and Plat-
E cells.The expression of env was determined by cell surface?uorescence
of Bosc23,Phoenix-E and Plat-E using the rat monoclonal antibody raised
against the env proteins termed83A25.12Staining procedure was perfor-
med as described12and then subjected to FACS analysis.As a control,
these cells were stained only with the second antibody(FITC-conjugated
goat anti-rat IgG as second antibody).
Plat-E:a system for transient packaging of retroviruses
S Morita et al
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Gene Therapy
makes it possible to maintain the titer of retroviruses derived from the Plat-E cells by simply culturing the cells in the presence of selection drugs.Finally,to lessen the possibility of generation of RCR,the minimum virus sequences were used in the packaging constructs.Thus,Plat-E cells can stably produce helper-free retroviruses at high titers for a long time.
Using retroviruses produced by Plat-E cells,we can ef?ciently transfer genes to many different cells including cells in primary culture such as T cells and mast cells (data not shown).Recently,it has been reported that by introducing the coding region of the polyomavirus early gene into the packaging cell lines,the titers of recombi-nant retrovirus produced by these cell lines were 10–100times higher than those produced by the parent cell line.14Introduction of the polyomavirus early region into Plat-E may lead to more ef?cient production of retro-viruses with high titer.Plat-E is an ecotropic packaging cell line and generation of its amphotropic counterpart,the Plat-A cell line should prove useful in human gene therapy.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hiroo Hoshino (Department of Hygiene and Virology,Gunma University School of Medicine)for his kind gift of MoMuLV-infected C3H2K cells,and Dr Leonard H Evans (Laboratory of Persistent Viral Disease,National Institute of Allergy and Infectious Disease)for anti-Env antibody,and Dr Kunitada Shimo-tohno (Department of Viral Oncology,Institute for Virus Research,Kyoto University)for his valuable discussions.We also thank Ms Mariko Ohara for her providing langu-age assistance.This work was supported in part by grant-in-aid from the Ministry of Education,Science,Sports,and Culture and the Ministry of Health and Welfare of
Japan.The Department of Hematopoietic Factors is supported by Chugai Pharmaceutical Company Ltd.
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慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T 细胞的培养 一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。 三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下 只供学习与交流
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天 2、加入2ml全培养基DMEM 3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基
慢病毒(过表达)包装步骤
. 慢病毒（过表达）包装步骤 秦超 1.转染 复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。 转染步骤：（以10cm培养皿为例） ⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。 ⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀 ⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min ⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min ⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。 2.收毒(36-48h) 收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。 ⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。 ⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。4000rpm离心至所需体积。 ⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。 3.接毒 接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml 细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。 4.检测及培养细胞系(48h) 如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系，可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 精品
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
慢病毒包装体系使用说明
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.wendangku.net/doc/b813236593.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.wendangku.net/doc/b813236593.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.wendangku.net/doc/b813236593.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.wendangku.net/doc/b813236593.html,/
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片
第二代和第三代慢病毒包装系统定稿版
第二代和第三代慢病毒包装系统精编W O R D 版 IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】
第二代和第三代慢病毒包装系统 将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的 HIV-1顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV-G蛋白代替，应用 VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。3质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白 (VSV 2G)，应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因( 绿色荧光蛋白 GFP) 。 在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第二代系统中5’LTR 634bp，3' LTR 634bp，5’LTR前不需要强启动子。4质粒系统。 第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了U3区的3’LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
脂质体转染实验原理与操作步骤总
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：
pLVX-Puro慢病毒载体使用说明
pLVX-Puro pLVX-Puro载体基本信息： 载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8102 bp 5' 测序引物及序列 : CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: 嘌呤霉素 备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体稳定性: / 组成型: -- 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-Puro载体简介： Description pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest. pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria. Use pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4). pLVX-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程 一、材料 1 细胞培养试剂 试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen 胎牛血清10%Invitrogen/Gibco 丙酮酸钠1mM Invitrogen DMSO（冻存用）10% 2 慢病毒包装试剂 试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000Invitrogen Opti-MEM基础培养基Invitrogen PEG6000溶液50%Wako NaCl溶液40 mM HBSS溶液Invitrogen 3 耗材 50 mL离心管 15 mL离心管 10 cm细胞培养皿 μm过滤器 2 mL EP管 二、操作流程
1细胞培养 1.1293T/293FT细胞的复苏 1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。在超净台内，用吸管吸取6~7mL 完全培养液至15 mL离心管中； 2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不 要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化； 3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的 完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO 对细胞造成的毒性作用）。 4)在室温条件下，250 g离心4分钟。 5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液， 再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和 湿度培养箱内培养。（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的 培养容器。） 6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。 7) 1.2293T/293FT细胞传代 1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细 胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰 酶的抑制因子）； 2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。在显微镜下观察，可看 到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞 仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间； 3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。用吸管
慢病毒包装操作说明
Clontech-Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明 A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。 所有的Xfect?转染成份，量和条件最好用Lenti-XVectors，Lenti-XHTX包装混合物，Lenti-X293T细胞。 用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。 所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。 包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。 6 1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞，添加10ml的生长培养基。 在37℃，5%CO2℃条件下过夜。 在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。 2.充分混均Xfect Polymer。 3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557μlXfectReaction Buffer 592.5μl Xfect ReactionBuffer36μl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5μl Xfect Polymer7μl Lenti-X Vector DNA(1μg/μl)600μl 总量600μl 总量注意： Xfect Polymer不要在室温下搁置长于30min
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒 令狐采学 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env 基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，
4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃ 第二天 1、配管 A+B混合室温静置20min
病毒感染细胞实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
病毒感染细胞实验整体流程及原理参考(仅供参照)
病毒感染细胞实验整体流程及原理 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于 并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
2、构建目的基因到载体 2.1 构建手段 2.2质粒载体 2.2.1概念 能够进行自主复制的环状DNA 双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶2.2.2特征 质粒称为附加体(episome)们可以把一些目的DNA 片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。(为了扩增DNA) 3、质粒DNA 在大肠杆菌里转化 连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质