从成年大鼠中枢神经系统不同区域分离NG2蛋白聚糖阳性神经祖细胞
?论 著?
从成年大鼠中枢神经系统不同区域分离NG2蛋白聚糖阳性神经祖细胞
于秀军 李震中 郭 力 林義孝
【摘要】 目的 探索从成年大鼠中枢神经系统(C NS )不同区域是否能分离培养出NG2蛋白聚糖阳性神经祖细胞(NG2细胞)。方法 从成年雌性大鼠解剖出CNS 的9个不同区域,分别经木瓜蛋白酶消化和
Op ti p rep 不连续梯度离心,从离心产生的组织细胞密集带,用含B27添加剂和碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)的Neur obasal A 培养液,分离培养出增殖性细胞,再以免疫荧光双重染色法鉴定细胞性质。结果 应
用上述方法,可从成年大鼠CNS 的9个不同区域分离出具神经干细胞(NSCs )潜能的NG2细胞。结论 成年大鼠CNS 的非神经发生区域同样存在NSCs 样细胞,且可通过适当方法体外培养。
【关键词】 成体神经发生;中枢神经系统;原代培养;NG2蛋白聚糖;神经祖细胞
中图分类号:R329.2 文献标识码:A 文章编号:1006-351X (2009)02-0093-04
Isol a ti on of NG 2proteoglycan expressi n g progen itor cells fro m the d i fferen t reg i on s i n the cen tra l nervous syste m of adult ra t YU X iu 2jun,L I Zhen 2zhong ,G UO L i,TA TEBA YASH I Yoshitaka .Depart m ent of Neur ol ogy,the Second Hos p ital,HebeiM edical University,Shijiazhuang 050000,China
【Abstract 】 O bjecti ve T o exp l ore that if NG2p r oteoglycan exp ressing p r ogenit or cells (NG2cells )can be
separated fr om different regi ons of the adult rat central nervous system (CNS ).M ethods N ine different regi ons were dissected out fr om the C NS in adult fe male rats .The tissues were digested with papain and centrifuged by Op ti 2p rep step density gradient .Fr om the resulting maj or fracti on,the p r oliferating cells were is olated and cultured in Neu 2r obasal A containing B27supp le ment and basic fibr oblast gr owth fact or 2(bFGF2),and then the nature of the cells were identified by double i m munofluorescence stain .Results U sing the above method,the neural ste m cells (NSCs )like NG2cells could be is olated fr om nine different regi ons in the C NS of adult rat .Conclusi on The NSCs like cells als o exist in the non 2neur ogenesis regi on in the CNS of adult rat,and can be cultured in vitr o .
【Key words 】 Adult neur ogenesis;
Central nervous syste m;Pri m ary culture;NG2p r oteoglycan;
Neural p regenit or cells
基金项目:日本文部科学省科学研究费补助金资助项目(18390324)作者单位:050000石家庄,河北医科大学第二医院神经内科(于秀军、李震中、郭力);日本东京都精神医学综合研究所抑郁症项目组( 林義孝)
神经发生在出生后脊椎动物脑的海马齿状回和脑室下层等限定区域继续并贯穿整个成年期,但成体
NSCs 被发现也存在于嗅球等非神经发生的脑区[1,2]
。本实验室已建立由成年大鼠海马分离培养NG2细胞
的方法[3,4]
,本实验则着重尝试从非神经发生脑区分离培养神经祖细胞并研究其特点。
材料和方法
一、实验动物与试剂
实验动物选用健康成年(3～6个月龄)雌性S D
大鼠。休眠液(H ibernate A +2%B27+0.5mmol/L 谷氨酰胺)、基础培养液(Neur obasal A +2%B27+0.5
mmol/L 谷氨酰胺+100I U /m l 青霉素+100
μg/m l 链霉素)成分及Op ti p rep 、bFGF2购自Gibco 公司;二次抗体和T O -p r o -3碘购自Molecular p r obes 公司;除特殊说明,一次抗体均购自Che m icon 公司。
二、实验方法
1.从大鼠CNS 不同区域分离神经祖细胞:根据本实验室建立的从成年大鼠海马原代培养NG2细胞的方案[3,4]
,从非神经发生脑区分离培养神经祖细胞。分离培养过程中严格遵守无菌操作。简述步骤如下:大鼠麻醉处死后,以Paxinos 和W ats on 的大鼠脑立体定位图谱(1998)为指导,于冰上迅速解剖分离出海马
(Hp)、杏仁核(Am)、皮质(Co)、嗅球(Ob)、纹状体(St)、丘脑中脑(T m)、脑干延髓(Mo)、小脑(Ce)和脊髓(Sc),称重后分别暂时浸泡保存于4℃休眠液。将不同区域脑组织分别切碎,移入预先备好的消化液(2mg/m l木瓜蛋白酶的休眠液溶液,Worthingt on公司),在往复振荡器中以170r pm、30℃振荡消化30m in。用于海马的消化液量为2m l,以海马为标准,其他部位脑组织的消化液用量与组织重量成正比。经洗涤、吹打、静置的组织消化液上清,经不连续密度梯度离心液(浓度分别为7,9.4,11.7和16.4%的Op ti p rep的休眠液溶液,各1m l)于室温800g离心15m in。各自在11.7%处分离出密集的组织细胞层,分别收集此层组织细胞悬液,以适当密度接种在预涂0.01%多聚赖氨酸(P DL;Sig ma公司)的直径35mm培养皿中,于5% CO2孵育箱(37℃,饱和湿度)孵育1h。然后以温热基础培养液轻轻冲洗1～2次,以除去未贴壁细胞和组织碎片。以基础培养液加10ng/m l bFGF2培养细胞,每2～3天更换半量培养液,并加全量bFGF2,细胞增殖至70%～90%饱和状态时传代。
2.免疫组化:为免疫荧光双重染色,将细胞播种培养在8孔B i ocoat LabTek Cha mber(BD B i osciences公司)。细胞经固定、可渗透化处理和封闭,用一次抗体(1:1000)在4℃孵育过夜。本实验使用的一次抗体有:小鼠抗NG2、巢蛋白(Nestin)、微管相关蛋白2a+ 2b(MAP2a/b,Sig ma公司)和兔抗NG2、P DGF2α2受体(P DGF2R,Santa Cruz生物技术公司)。经洗涤,再用荧光二次抗体(1:1000)在室温避光孵育1h。本实验使用的二次抗体有:A lexa Fluor488和568山羊抗兔和抗小鼠I gG抗体。为核复染色,加入T o2p r o23碘(642/661;1:1000)与二次抗体共同孵育。用共聚焦激光扫描显微镜(LS M5P ASCAL,ZE I SS公司)观察被标记细胞,并用Adobe Phot oshop(Adobe Syste m s)编辑彩色图像。
三、统计学处理
每组随机选择20个完整视野,计数NG2细胞占所有细胞的百分比,用SPSS软件分析,结果以均数±标准差表示。
结 果
1.从大鼠CNS不同区域分离神经祖细胞:根据本实验室建立的从成年大鼠海马原代培养NG2细胞的方案[3,4],从非神经发生脑区同样分离培养出神经祖细胞。应用Op ti p rep不连续梯度离心,分离经木瓜蛋白酶消化的不同脑区组织细胞悬液,各自在浓度11.7%(密度1.029g/m l)的部分得到一个组织碎片和细胞的密集带。利用含有B27添加剂和bFGF2的基础培养液从上述组分可分离培养出神经祖细胞(图1)
。
a.离心后得到的组织细胞密集带;
b.原代培养第2天的单个祖细胞;
c.原代培养第14天,祖细胞增殖形成群落。
图1 神经祖细胞的分离培养方法
获得的细胞数以海马为最多,其次依次为嗅球、杏仁核、纹状体、大脑皮质、脑干延髓和小脑,在脊髓和丘脑中脑最少。获得细胞的数量看起来与离心后所得组织细胞悬液中组织细胞碎片的量成反比(表)。
表 不同脑区获得的神经祖细胞量及NG2阳性比例脑区细胞量碎片量NG2%
海马(Hp)+++++9315±413
嗅球(Ob)++++++8717±910
杏仁核(Am)++++++9212±510
纹状体(St)+++++8314±1317
大脑皮质(Co)+++++8815±615
脑干延髓(Mo)++++++7814±2318
小脑(Ce)++++++8413±314
丘脑中脑(T m)++++++8514±1318
脊髓(Sc)++++++9117±1414
2.从不同脑区分离的神经祖细胞均有NG2表达:以基础培养液体外培养五天后,用NG2抗体分别染色取自不同脑区的细胞。虽然在不同脑区获得细胞的数量有所不同,但在包括海马在内的9个脑区均发现NG2细胞,且原代培养第5天,尽管NG2细胞比例因脑区而不同,但都在70%以上(表)。
3.NG2细胞表现NSCs特征:为进一步明确来自不同脑区的NG2细胞的性质,原代培养第5天的不同脑区的细胞分别以不同抗体行免疫荧光双重染色,发现从不同脑区获得的成体NG2细胞的形态学和免疫化学特征相似。这些NG2细胞同时表达P DGF2α2受体(标识OPCs)和MAP2a/b(标识神经元)阳性,说明其具有能分化成神经元和胶质细胞的潜能,NG2细胞大多还表达Nestin(标记NSCs或初期前体细胞)阳性,
也表现其NSCs 特征(图2)
。
红色:NG2,蓝色:To 2p r o3,绿色:a 2c .MAP2,d 2f .P DGF 2R,g 2i .Nestin 。
图2 不同脑区获得的NG2细胞的形态学和免疫化学特征
B27添加剂和bFGF2培养条件下各脑区神经祖
细胞增殖迅速并可传代。各脑区NG2细胞的纯度经传代逐渐上升,经223次传代后均上升至90%左右,且至少超过20次传代仍保持90%以上,表明NG2细胞充分的自我更新能力。
讨 论
NG2细胞在发育过程中持续存在,并且是成熟CNS 中最大的增殖细胞群体。虽然NG2细胞被认为
主要是少突胶质细胞前体细胞(OPCs ),但最近研究表明,NG2细胞有多潜能,在一定条件下可以分化成神经元[5,6]
。NG2细胞有多种功能,除参与少突胶质细
胞和神经发生
[7]
,对神经元和突触信号提供生理支
持
[8,9]
,还被认为在脑修复和再生中发挥关键作用,是
对CNS 损伤的主要响应神经细胞类型[10]
。因此,成
功培养NG2细胞,特别是从发展完善的成体大脑,对
神经科学的实验研究至关重要。
本实验室已建立从成年大鼠海马分离高纯度NG2细胞的简便方法,并证明此细胞在体外有NSCs
潜能
[3,4]
。本研究证明,除海马外应用同样方法从成
年大鼠CNS 的嗅球、杏仁核、纹状体、大脑皮质、丘脑中脑、脑干延髓、小脑和脊髓等非神经发生区域同样可分离出NG2细胞,说明神经祖细胞存在于包括非神经发生区域在内的整个成熟CNS 中。这个祖细胞群似乎作为早期多能祖细胞或干细胞存在
[11]
,因为这些细
胞分化成神经元的能力不是其固有的,而是在外源性
环境诱导影响下获得的(如去除体内环境和应用高浓度bFGF2等)。
从不同脑区获得细胞的数量不同,且看起来与离心后所得组织细胞悬液中组织细胞碎片的量成反比,考虑除不同脑区潜在的祖细胞数量可能不同外,还可能是悬液中的大量组织细胞碎片在播种后妨碍祖细胞贴壁,继而在之后的冲洗、换液等步骤会损失一定量祖细胞。
原代培养5天免疫荧光双重染色发现,不同脑区
的NG2细胞均同时表达P DGF 2α2受体阳性,表明其确
实是OPCs;MAP2a /b 阳性,表明其同时有分化成神经元的潜力;Nestin 阳性,则显示其NSCs 特性。同时说明不同脑区获得的成体NG2细胞的密度、形态学和免疫化学特征比较相似,它们之间的详细差异还有待进
一步研究。
原代培养中NG2细胞比例因脑区而不同,说明不同脑区存在多种不同类型增殖性细胞;而随传代进行,各脑区NG2细胞纯度逐渐上升并保持在90%以上,说明本实验室的培养条件很适合NG2细胞的培养。迄今为止,各脑区NG2细胞已在体外培养10个月,至少超过20代,仍保持90%以上纯度,表明NG2细胞充分的自我更新能力。该细胞可以被冻结、解冻和再播种,可很方便地用于在体外研究其增殖和分化的调节机制。
从出生到衰老,大脑可能存在由干细胞样细胞保留的持续的发育可塑性,以不同方式对不同环境做出反应。这种可塑性可能逐渐衰减,但在一定程度保持一生。干细胞样细胞可能对遍及整个成熟脑的持续的胶质细胞发生发挥积极的作用。产生神经元的潜在可能性,在大脑的神经发生区域以外可能永远不被唤醒,但在特定条件下也可能被激活。在本研究,被高浓度bFGF2激活的多潜能NG2细胞可能代表成熟脑的神经元和神经胶质祖细胞的一种共同前体细胞。总之,本研究室建立的从成年大鼠海马分离和培养高纯度NG2阳性神经祖细胞的方法同样适用于海马以外的非神经发生脑区,进一步改进了成体NG2细胞的原代培养技术,为在体外研究控制其活性的调节机制及脑损伤的修复、再生和脑细胞移植研究提供了新途径。
参 考 文 献
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(2008-04-10收稿)
(上接第92页)
死于中枢性呼吸、循环衰竭2例(6.25%);痊愈后无任何后遗症28例(87.5%);遗留有不同程度的后遗症状(一侧肢体无力、构音不清等)3例(9.3%)。存活病例平均随访13个月无复发。
讨 论
脑干脑炎的诊断名称是由B ickerstaff于1957年正式提出的[1]。近年来国内陆续有报道。其病因尚未清楚,但多认为与病毒感染后诱发的免疫反应性脱髓鞘有关。本组30%的患者发病前有上呼吸道感染史,全部患者激素治疗有效,说明本病与病毒感染后的自身免疫有关。本组32例仅6例脑脊液病毒中和抗体检测阳性。
本组以青壮年居多,平均年龄39±2.3岁。男女之比1.66:1,与文献报道一致[2]。以单个或多个颅神经损害为首发症状,继而可出现锥体束征(60.0%)或感觉长束征(35.6%)。单侧颅神经损害多见(67.2%)。本组病例根据颅神经损害临床定位病灶单发10例,多发15例。脑干脑炎患者脑脊液及MR I 异常率均较低。本组21例行脑脊液检查者仅5例压力高于正常,2例细胞数稍高,脑脊液1例蛋白升高。临床定位损伤波及中脑有8例,桥脑18例,延髓9例,但通过MR I检查证实有中脑损伤的仅3例,桥脑8例,延髓5例,说明MR I与临床的符合率较低。
脑干脑炎的诊断一般是在没有病原学的条件下依据临床做出的诊断[3]。诊断依据主要以下几点:(1)发病以青壮年居多;
(2)急性或亚急性起病,病前多有感染史;(3)脑脊液可正常或轻度异常;(4)有一侧或双侧脑干受损的症状及体征;(5)激素治疗有效,预后较好;(6)应排除多发性硬化、脑干梗死等疾病。脑干脑炎MR I的异常率虽低,却有助于鉴别诊断。本组所有病例的病灶相对局限,说明脑干脑炎并不是多发性硬化的首次发作。脑干脑炎与脑干梗死在MR I均可显示长T
1
、长T
2
信号。且以桥脑多发,都可同时伴有大脑半球的病灶,增强扫描均较少强化。
早期应用激素和无环鸟苷一直被认为是治疗本病、控制预后的关键。本组32例均早期应用激素及无环鸟苷和/或病毒唑,30例存活。4例同时应用大剂量丙种球蛋白者全部存活,其中2例以意识障碍起病,病情凶险,经治疗后意识转轻,出院时无任何后遗症。我们认为早期应用大剂量丙种球蛋白同样是改善预后的治疗措施。另外,本病的预后取决于病变的程度和部位,能否及时控制感染防止免疫损伤和并发症等因素关系密切。一般来说,脑干脑炎预后较好,呈单相良性病程,但当炎症不能及时控制时,病变波及整个脑干,则预后差,甚至危机生命。
参 考 文 献
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(2008-02-10收稿)