病毒空斑纯化

病毒空斑纯化

病毒蚀斑如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。在细胞培养中做蚀斑是一种较精确的测定病毒感染的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1h，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。但由于琼脂的限制只能感染临近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化步着色，形成不染色区域。凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。

蚀斑技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常敏感的方法。此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。若目的是要提高病毒能力，应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数不得超过20-40个。

试验时，培养瓶应翻转培养，以防止水滴在琼脂面流动，以免各个蚀斑交叉融合，中性红应在蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。对那些生长缓慢的病毒蚀斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层1-2次。

蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗2-3次，而后用去离子水冲洗1-2次后，用Hanks液配制成3%浓度，煮沸1h 除菌备用。

有人在试验时补加25mmol的MgCl2或CaCl2及1mmol的半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。而MgCl2的加强作用最强。

流感病毒纯化（蔗糖梯度法）

概论

转头选择

密度梯度选用

一、概论

在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。

在速率一区带离心中混合样品的以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份"颗粒"在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形

成了数个含左第一级份颗粒的"区带"。离心过程在最垂"的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉殿前就停止了。样品在离心后与梯度液一起收集，用常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。

对于相类似的生物体组份常常形状也相似。在速率区带离心中我们常常使梯度液的最大密度不超过样品在该梯度中浮密度。利用这类生物组份在尺寸上的差异的形成的沉降速率的不同，选择某一特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停止离心即可以达到分离目的。

与速率一区带离心法不同的是，等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。最后一种方法依靠离心力来形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单一成份向它们自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。对于速率一区带离心，梯度液最大密度一般小于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；而等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。

密度梯度离心法的理论依据是（参考文献1）

每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：

V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r

式中V是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）

d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。非球形颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。

σ：样品颗粒的密度（克/厘米3）

s：密度梯度液的密度（克/厘米3）

η：密度梯度液的粘性系数（克/厘米·秒）

ω：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分

r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）

当

σ>S时V>0即样品顺离心力方向沉降

σ〈S时V〈0即样品逆离心力方向上浮

σ=S时V=0即样品停止沉降或上浮，"稳定"在这一位置

用这个公式可以很好地解释在速率一区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。

二、转头的选择：

1、离心转头分类：

转头类别使用的离心

机

发明时间、发明者或推广商

固定角式转

头

低、高、超速1943年，（英）Pickels

甩平转头低、高、超速1951年，（德）Kahler

垂直管转头高、超速1974-1975年，（美）Dupont公司

区带转头低、高、超速1964-1965年，（英）Anderson、（英）MSE公司近垂直管转超速1989年，（日）Hitachi Koki、（美）Beckman公司

头

连续离心转

低、高、超速1965年，（英）MSE公司

头

其他特种转头：分析转头，土壤脱水转头，细胞浮选转头，管式转头，血球比测定转头，细胞清洗转头等等。

2、各种转头用于密度梯度离心的比较：

（I）各种转头用于速率一区带（R-z）离心的优缺点分析：

固定角式转头：壁部放应影响很大，用于R-z离心回、收率低，纯度也受影响一般知用于差分离心和等密度离心，离心时间向较短。是各其离心机的最高速转头。

甩平转头：细长离心管用于R-z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部入在很少。25000rpm~30000rpm的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分离，而40000~42000rpm的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒草类物质内流的分离。离心时间较长。

垂直管转头：沉降距离最短，因而离心分离时间也是短。最大半径前几乎没有壁部放位，最大本径后右一定壁部效位，垂直剖面积较大，因而离心后纯样品区带的容量也较大。但在有沉殿的密度梯度离心中，沉淀和浮动区带方向转换之间存在干扰，可能影响纯样品区带的纯度。大部份R-z离心没有沉殿，垂直管转头很适合做R-z离心。

近垂直管转头：管轴线与旋转主轴之间倾角7度~9度（角式转头20度~45度）沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式，甩平转头都要短。由于右了倾角，沉殿可沿管壁滑向低部，因此基本上清除了沉殿与浮动区带转换之间的干扰，适合做R-z离心，特别适合做生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。

区带转头：没有壁部入应特别适合做大容量的病毒，亚细胞器，生物大分子的R-z离心，可用于研究，中试和少批量生产。分离纯度高，量大，但操作要求高，转头及整体价格昂贵。

连续流离心转头：工作原理的区带转头相似，可连续工作，分离量大，分离统纯度高，可用于各种生物体的差分，R-z等密度离心。近年来高速连续流转头常用于大量发酵液（大肠样菌、酝母菌）菌体的沉殿。

（II）各种转头用于等密度离心内优缺点分析：

固定角式转头：主要用于差分离心的角式转头，在速离心机上可以很好地用于等密度离心，尤其是DNA平衡等密度离心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的单管的容量为10~15ml,常用转速40000~60000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。

甩平转头：用作等密度离心时，壁部效应对分离效果影响较少，梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。缺点是沉降距离长，最高转速较低（由于结构层固此类转头最主转速一般在60000rpm以下）因而，离心时间很长，对某些长离心管，10~15ml容量的转头最高转速在40000~41000rpm，用作自形成CSCL梯度的质粒DNA离心往往需要

50~70小时。

垂直管转头：适合作等密度离心，沉降距离最短，在没有沉殿或沉殿非常坚实的情况下，对于现代可自由选择加速、减速时间的离心机，梯度转换得很好。

这类转头转进很高（目前最高转速可达100000rpm，70000xg）离心时间最短，分离纯度高，样品容量较大（垂直剖面积最大）。

近垂直转头：九十年代以后开始使用的新型转头，用作生物大分子（DNA，RNA，蛋白质等）的平衡等密度离心最佳，目前这类转头的最高转速已达90000rpm 近650000xg），离心时间相比垂直转头稍长。

区带转头：非常适合做大容量样品的等密度离心

连续流离心转头：高、低速连续流转头一般不用作密度梯度离心超速连续流转头适合做大容量样品的等密度离心分离。

（三）密度梯度--材料和梯度型式的选用

1、对于速率--区带密度梯度离心，梯心度选择要点

（I）概述：用速率一区带法下简移尺R-z法进行分离的主要原理是依靠不同样品在梯度中沉降速率的不同来分离（比化样品，因此希望样品在沉降能通过整个离心管长度的提高分辨率。作为最基本条件就是梯度液的最大密度必须少于样品颗粒的密度。

用有密度梯度的支持液作R-z离心有以下优点：

*当样品中不同组份分层进入梯度液时，梯度的较高密度支持着样品这样就使样品各个不同密度的层次以较窄（或较薄）的区带沉降从而得到期较高的分辨率（或较高的纯度）

*梯度液的密度一般是从离心管上部到底部逐渐增加，这样就可以稳定液栓，提示抗对和抗机械扰动的能力（接近离心过程结束时，纯样品区带和它的支持液的密度差较少）

*梯度液粘性系数逐渐增大也使纯样品区带变窄从而提示了分辨率而逐渐减缓的沉降速度使同一组份样品逐渐靠扰，提高了分离纯度。

（II）梯度、材料的选用

一个理想的梯液就具备：化学稳定性好；高溶合度；低渗透性；在溶剂中稳定性；较低的光吸收特性；价廉等。遗憾的是很难找到一种适合于各种R-z 离心的完美无缺的梯度液。

对于大参数R-z离心，蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度（>30% W/N）时粘性每数较大，但综合比较表明它可以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度时（即使是低密度时也如此）右较高的渗透性，分离一些对渗透性敏感的生物体组份时需要选择其他梯度材料，如由pharmacia公司开发的Ficoll等等。在大多数情况下，梯度液的PH值应与被分离时生物样品的生理PH值一致。

对密度梯度材料的基本要求：

a）能够配制所需要的密度范围

b）粘性系数较低

c）溶合度高

d）有密度与光折射率的对照资料

e）对被分离样品无损害

f）对被分离样品渗透很少

g）在离分离完成后很容易与生物样品分离

h）化学了性放稳定

i）对离心过程中所接触的转头材料，离心管，管盖及密材料，连续流及区带转头的管道等等无腐蚀作用

j）纯度高

k）毒性少

l）价格较低

m）已知该材料的某些物理、化学、热力学性能。

常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾、氯化铯、氯化铷、硫酸铷、三氯（耳苯酸钩、三氟醋酸铯、右旋糖苷，白蛋白、Ficoll,percoll,mettizamide,Nycodebnz,Ludox,Dextian 等等

（III）梯度形状的选择：

所谓梯度形状是指梯度介质没着离尽管长充方向的密度变化特征。

用于R-z离心密度梯度常用连续梯度也变是密度随着离心本径的增加而光滑地（不是实变化）增大，直线型的，光滑曲线型的（一般用凸指数或凹指数曲线，或凸凹指数曲线联用的）都属于连续梯度。不连续（阶梯型）梯度采用于等密度离心。

*线型：

在甩平转头中做R-z离心最常用线性梯度。

制各线性梯度时要注意：

（a）在甩平或垂直转头中制各线性梯度时，梯度液西的密度必须足支持样品，而底部密度必须少于被分离样品组份的密度。

（b）一般地说较大的梯度斜率可以得到较高分辨率

（c）蔗糖的常用线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V

（d）可以用梯度议制各线性梯度，也可以人工辅设整个价梯型梯度，离心管二静置一致时间后也可以形成近线性梯度。

*等运动梯度（等速梯度）（Isokinetic）

等运动梯度是指在某一恒定离心转速时，样品颗粒在梯度中以定常速度沉降。在做到等速沉降，必须使梯度和粘性力的增加与沿着离心本径方向的离心力增加相平衡，在这种梯度液中，颗粒的沉降距离与离心时间，离必力，以及颗粒本身的沉降多数成正比。因此如果已知某单一组份样品的沉降分数，就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。

在甩平转头中用等速沉降梯度时，从旋转中心算起的离心距离与沉降系数的关系应该是线性关系。

为了构造等速沉降梯度种慢必须注意到转头、离心管，梯度合质的密度，浓度和粘性系数在同一温度。

在甩平转头中作蛋白质分离常用5~20%（W/V）的蔗糖梯度在5摄氏度离心可以达到近似的等速沉降的效果，而10~30%（W/V）的甘油梯度在5摄氏度时分离DNA或RNA也可以达到近似等速沉降的目的其他大金数样品分离的等速沉降梯度是凸指数型曲线。

*凸型指数曲线与凹型指数曲线梯度：

为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度，我们常常望梯度曲线在近度面处有较陡的斜率，也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸指数曲线梯度，与比相反，如果液面处梯度液足以支持（托住）样品，故虑到某些样品在离心管中下部需要较慢的沉降率（在高密度区）才能得到理想的分辨率，那么凹型指数曲线型梯度变能满足这个要求。*复合型梯度：

如果用程序梯度仪来制备梯度，那么上节中的凸凹指数曲线梯度可以复合

在同一梯度液中，这样的复合梯度在它们各自的区域保持了它们各自的优点。当然也制备其他类型的复合梯度。一般说，复合梯度多用于区带离心。

（2）等密度离心，梯度要素的选择：

（I）梯度材料及梯度溶液选择：

所有的等密度离心都使用水溶性缓冲剂作溶剂，缓冲剂的组成及PH值取决于生物样品的性质。对细胞，亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离各有不同要求。

常用于等密度离心梯度材料有：

从上表可以看出，对R-z离心蔗糖是很好的梯度材料，而对于等密度离心，不同的生物样品对梯度材料的要求有较大差异。

（II）梯度型式选择：

离心时，溶液中各种组份都同时处在离心声中，被分离的组份及梯度材料的分子都在离心力作用下向离心管底部（甩平、角式）或外壁（垂直管、近垂直管、区带转头、连续流转头）沉降。对于梯度材料，如果它们的沉降速度在离心初始阶段远大于浓度扩散速度，那么就可以形成连续的密度梯度。这就是"自形成梯度"产生的基本原理。我们可以把被分离样品和梯度材料混合在一起离心，梯度材料去离心过程中形成密度梯度，而样品中不同组份则沉降（或上浮）到它们自己的等密度区。

另一种方法是预先制备好密度梯度，将样品铺在离心管（或区带转头）的某一部份（如离心管上部，下部或中部），离心，使样品中各种组份沉降（或上浮）到它们自己的等密度区前后，从而达到了我们所需要的"平衡"结果。

预先形成梯度可以是不连续的（阶梯型），也可以是连续梯度。阶梯型不连续梯度大多适用于从植物或动物组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯化。而连续梯度由于共密度平滑地变化，对于某些生物样品的多种成份组合的分离可以得到较低市制分辨率而得到了广泛的应用。

选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决于材料的性质。如果些胶体硅材料可在10000~20000xg的离心声中离心30分钟就可以自形成梯度（例如美国Du pont公司的的Ludox及瑞典pharmarcia公司的Percoll）。但对某一些材料，自形成梯度的时间很长，对离心力的要求也很高。如CSCL或Meterizamide 需要去50000~500000xg的离心声中离心数少时甚至数十小时才能自形成梯度（如用CSCL做质粒DNA分离，梯度液中加E.B.和Triton x-100，在490000xg 需要离心4小时，才能利用CSCL的自形成梯度分离出质粒DNA，染色体DNA，RNA 和蛋白质。）

预形成梯度的主要优点是离心时间较短，因为我们只要故虑样品中某个组份到达其等官度区所需要的时间。预形成梯度常被用来分离较大颗粒，如>100S 的样品。

预形成梯度的缺点是

*被分离样品的容量较少（与自形成梯度相比）

*对某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产生颗粒聚结从而减少了样品回收率至影响纯度。

*预先制备样度液需较长时间，亦较繁复。

与预形成梯度相比较，自形成梯度有较大样品容积（特别是使用垂直剖面积较大的垂直管或近垂直离心这个优点更突出）；可以简单地高速初始密度；离心过程中样品既右上浮又右沉降，也就是混在梯度液中的样品在离心过程中，在梯度材料自形成梯度的同量从离心力的正反二个方向向自己的等密度区靠扰，最后排列在自己的等密度区上下形成纯样品区带。从这个意义上说，样品是真正到达了自己的等密度区而具有很高制纯度。

自形成梯度的等密度离心又称均衡等密度离心（Eguilibrim-Isopycnic）（III）自形成梯度

综上所述，某些梯度材料能够在离心过程中形成密度梯度，Ludox,Percoll 中的胶体硅颗粒可以较快地向离心管靠低（如甩平转头）等或外侧（垂直管转头）而另一些材料如CSCL，CS2SO4，Metrizamide等则在沉降过程中爱到共反向浓度扩散的影响，达到平衡的时间就比较长。平衡后梯度曲线的形状不仅依赖于梯度材料本身，也取决于其他一些离心条件。自形成梯度的最基本条件是样品中需要分离的各种组份在分离后都就包含在梯度范围中。最佳的自形梯度形状还应该使被分离后都处在各自的较窄的纯样品区带内，只有这样才能得到较高的分辨率。但很多单一组份在尺寸和密度上都有差异。就使得同种样品区带离心后显得比较宽。为了提高分辨率变必须使梯度曲线变得陡一些，但要随心所欲做到这一点都很困难。

幸运的是对于所有梯度材料，计算自形成梯度的公（也就是自形成梯度曲线的形成原理）是一样的。由于用CSCL分离质粒DNA已有近30年历史，大多数定量分析工作集中于讨论CSCL梯度。

用下面的一些公式可以计算自形成梯度曲线的形状，可用于设计最合适的密度梯度。

*梯度曲线的斜率：

密度梯度曲线中某一点的最终斜率ds/dr可以用下式计算：

ω是角度（弧度/秒）γ：从旋转中心到计算点的距离（cm）

βo：梯度材料的密度梯度比例常数

βo的数值请参考①余兴明"质粒DNA的超速离心分离"

或②J.B.Martin"Biopolymers"9，1970，P597

用这个公式计算梯度曲线的中下部占3/4离心管中梯度高度的ds/dr值比较接近实际情况，对上部1/4长度与实际情况有些差别。

从上面公式可以看出，要质曲线变陡

a：降低βo

b：提高转速

c：加大离心半径

d：增大初始密度

以同等转速离心，甩平转头的r较大，在同等初始密度条件下，甩平转头

的密度梯度曲线比垂直管转头，近垂直转头或固定角式转头都要陡一些。（参见下图）

九十年代以前生物大分子离心分离实验多数是利用甩平转头，转速在60000rpm以下，某些实验一次要离心数十小时，使用的CSCL也较多（分析纯，价格高，且不能反覆使用）离心分离成本昂贵（如80年代初期，质粒DNA分离，CSCL初始密度为1.71g/cm3，33000rpm，20摄氏度甩平转头离心72小时，一次离心就用去了驱动部1.4亿转的的寿命，而当时的超速离心机驱动部的保用寿命才100亿转，虽然由于CSCL去离心后梯度曲线较陡而获得了很纯的质粒DNA和染色体DNA，但成本实在是太高了）。九十年初开始使用近垂直管（或秒少角度管）转头，在CSCL梯度中加入E.B.和Triton x-100，初始密度1.55g/cm378000rpm，20摄氏度离心4小时（用去驱动部寿命0.187转）或用垂直锭，同样的梯度100000rpm，20摄氏度2小时（用去驱动部寿命0.12亿转）都获得了满意的结果。（文献5）

*梯度的密度范围：

在不同距离处（r2,r1）密度差可以用下面公式表示：

从上式可以看出（S2-S1）值不得和转速的平方而且和距离的平方差成正比。

*转头选择对梯度曲线斜面率与梯度范围时影响：

从前面的曲线图可以看出对不同转头，梯度曲线的差异：

甩平转头离心时和复原（离心完成）后对于梯度来说，离心管中液面至管底距离保持不变。对固定角式，小角度转头及垂直管转头，离心头沉降距离很微短，而在离心后复原时这项距离明显拉长了，也就是说梯度曲线变得平缓了，这种距离的延伸右利于离心分辨率的提示。因此垂直管转头比NVT（近垂直管）转头，NVT转头比角式转头的距离延伸更大，分辨率也就更高。但与此相反，纯样品带的宽度都是甩平转头最窄，垂直管转头最宽。

*梯度中的最大和最少少密度：

计算前，首先要找到等密度点的位置等密度点：离心层密度与率心开始时初始密度相等的点。

对于甩平转头：设等密度点少rc

式中rt：梯度表面与旋转中心距离：

rb：离心管底与旋转中心距离

该公式可用于估算离心结束时（转头刚开始减速时）角式转头及垂直管转头的rc位置。

设梯度液初始密度（均匀）为Si，在求得rc后梯度中最大密度与最少密度可用下式计算：

如果已经设计好密度变化范围就可以计算所需要的离心转速：

DNA分离，CSCL梯度，初始密度1.70g/cm3，根据离心要求，理想的

最大密度为Sb=1.75g/cm3

最少密度为St=1.65g/cm3

用某甩平转头最高转速55000rpm，

rb=12cm，rt=6.7cm则N=45500rpm，

校核：由于密度>1.2g/cm3按规定这个转头的最高转速不能超过：

=46200rpm

46200rpm>45500rpm

所以，以上设计成立。

*离心时间计算：

计算例题中离心所需要的时间：

已知r平均=9.35cm，样品S20，w=15

*讨论

必须注意不能使CSCL在离心管底部最大密度超过1.90g/cm3120oC）否则CSCL将可能析出结晶，而CSCL的结晶密度为4g/cm3，很可能在结晶的局部损坏塑料离心管，从而造成CSCL泄漏而进一步腐蚀转头，（特别是铝合金转头）而造成转头在离心中炸裂的严重事故。为安全起见，生金属的梯度实验不要去铝合金转头或甩平转头中的铝合金吊桶中做。

（IV）预形成梯度：

*不连续（阶梯形）梯度：

分层铺设不连续梯度，样品铺在梯度液之上，离心时不同组份越过少于本身浮密度时梯度层次而最后达密度样品浮密度的梯度界面之前形成纯样品区带。一般设置三至五个层次。

*连续梯度

根据被分离样品的性质设计线性，凸指数，凹指数或凹凸复合指度曲线梯度。样品一般铺在梯度液上部离心分离，要注意的是某些梯度材料（如重金属器）预形成梯度在离心过程中由于离心力和浓度扩散的复合作用而可能改变形状。

我们也可以用离心来制备预形成梯度，如果形成的梯度曲线（近直线型）中点的密度和初始刻度相同则梯度的稳定时间（对CSCL）

若在3/4处（从液面算起）密度与初始密度相同则

当然这是用于估计形成不同CSCL梯度曲线所需要的时间的经验公式。它可用以实际离心操作。

（V）为了使实验人员对不同生物体组份在不同梯度材料中的浮密度右外初步认识，列下

图中

（a）在水或在0.25M蔗糖液中的推定浮密度

（b）在等密度蔗糖液中推定浮密度

（c）在等密度CS2SO4中推定浮密度

（d）在等密度CSCL中推定浮密度

序数符号表示为：

①细胞核②质膜③细胞质④细胞核⑤线粒体⑥溶酶体⑦线粒体⑧溶酶体⑨内质纲⑩病毒

(1)核蛋白体(2)核糖体(3)DNA(4)蔗糖温表(5)核糖体(6)DNA(7)RNA(8)RNA(9)RNA

附图各种生物体组份在不同梯度材料溶液中的浮浓度示意

流行性腮腺炎

流行性腮腺炎（epidemic parotitis，mumps，简称腮腺炎或流腮）是儿 童和青少年中常见的呼吸道传染病成人中也有发病。该病由腮腺炎病病毒所引起，该病毒主要侵犯腮腺但也可侵犯各种腺组织神经系统及肝、肾、心脏关节等几乎所有的器官。 编辑摘要 流行性腮腺炎简称流腮，亦称痄腮，俗称猪头疯，是春季常见，也是儿童和青少年中常见的呼吸道传染病，亦可见于成人。它是由腮腺炎病毒侵犯腮腺引起的急性呼吸传染病，并可侵犯各种腺组织或神经系统及肝、肾、心脏、关节等器官，病人是传染源，飞沫的吸入是主要传播途径，接触病人后2－3周发病。腮腺炎主要表现为一侧或两侧耳垂下肿大，肿大的腮腺常呈半球形，以耳垂为中心边缘不清，表面发热有角痛，张口或咀嚼时局部感到疼痛。 流行性腮腺炎是世界性疾病，病毒主要通过空气飞沫、直接接触等途径传播；全年均可发病，以冬、春季为主。发病以儿童和青少年为主，1岁以内少见。对流腮没有免疫力的成人也可感染发病。感染本病后可获终身免疫不再患“流腮”。 （一）传染源：早期病人和隐性感染者。病毒存在于患者唾液中的时间较长，腮肿前6天至腮肿后9天均可自病人唾液中分离出病毒，因此在这两周内有高度传染性。感染腮腺炎病毒后，无腮腺炎表现，而有其它器官如脑或睾丸等症状者，则唾液及尿亦可检出病毒。在大流行时约30～40%患者仅有上呼吸道感染的亚临床感染，是重要传染源。 （二）传播途径：本病毒在唾液中通过飞沫传播（唾液及污染的衣服亦可传染）其传染力较麻疹、水痘为弱。孕妇感染本病可通过胎盘传染胎儿，而导致胎儿畸形或死亡，流产的发生率也增加。 （三）易感性：普遍易感，其易感性随年龄的增加而下降。青春期后发病男多于女。病后可有持久免疫力。

病毒纯化

现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。 在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。 病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。现在我们讲解每个步骤的一些细节。 1.在大型装置中培养细菌。为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。每种病毒的培养都有不同的步骤。脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。 2.富含病毒培养液的去除。病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。低速离心除去大分子的细胞残骸。 3.通过沉淀将病毒物质浓缩。由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。 4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。在后者中，病毒在离心试管中成为一个分离带，这一过程与对DNA的分离相同，离心须要高速，即120000g,且要进行好几个小时，最好是一整夜。离心管中的液体通过试管底部的一点点滴出来，要检测每一滴的病毒滴度。在合适的离心条件下，所有的病毒分子都集聚在一或两个组分中，所以它们是非常纯的。结晶脊髓灰质炎病毒。如果能在合适的条件下浓缩大量且高纯度的病毒，就可以获得病毒晶体。这种晶体为化学分析提供了很好的材料，且易于通过X射线衍射技术进行结构分析。本章的部分讲到的脊髓灰质炎病毒的计算机拟合就是从这种高浓度脊髓灰质炎的病毒晶体获得的。

(推荐)病毒蚀斑技术

病毒蚀斑技术 1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法。 (一) 原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103 ，则病毒原 液的滴度为： 58÷0.2×2.5×103 ＝7.25×105 (PFU/ml) (二) 技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。 1.病毒生物学纯化 (Virus biological purification) 在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时, 有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒, 亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化, 必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm 都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。 2.蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test) 蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少 50％的血清

流行性腮腺炎教案

流行性腮腺炎培训教案 教学内容：病因及发病机制、护理、治疗及预防 教学目标：掌握：腮腺炎的病因、护理评估、护理诊断及护理措施；熟悉：腮腺炎的治疗和预后；了解：腮腺炎的发病机制。 概念：流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒引起的急性呼吸道传染病。主要表现为腮腺的非化脓性炎症性肿胀、疼痛、发热等。除此以外，常可累计其他腺体组织或脏器及神经系统，引起脑膜炎、脑膜脑炎、睾丸炎、卵巢炎、胰腺炎等。本病为自限性疾病，大多预后良好，极少死亡。 一、病源学腮腺炎病毒属副粘病毒科。单股RNA病毒。对腺体和神经组织有亲和性。本病毒抵抗力弱，不耐热，一般室温下，经2-3天其传染性消失。对紫外线及一般消毒剂敏感。强紫外线下仅活半分钟，甲醛溶液、30%来苏尔、75%乙醇等接触2～5分钟灭活，但耐寒。人是唯一的病毒宿主。 二、流行病学 1.传染源：早期病人和隐性感染者。腮肿前7天至腮肿后9天均可自病人唾液中分离出病毒，因此在这两周内有高度传染性。感染腮腺炎病毒后，无腮腺炎表现，仅有其它器官受累者，唾液及尿亦可检出病毒。 2.传播途径：本病毒在唾液、鼻咽分泌物中通过飞沫传播。亦可接触传播。孕妇感染本病可通过胎盘传染胎儿，而导致胎儿畸形或死亡，流产的发生率也增加。

3.易感人群：普遍易感。90%病例发生于1～15岁，尤其5～9岁的儿童。1岁以内婴儿很少患病。成人中80%曾患过显性或隐性感染。儿童患者无性别差异，青春期后发病男多于女。病后可有持久免疫力。 4.流行特征：本病分布全球，全年均可发病，但以冬、春为主。可呈流行或散发。在儿童集体机构、部队以及卫生条件不良的拥挤人群中易造成暴发流行。 三、发病机制 在腮腺肿胀前7天至肿胀出现后9天均有传染性。传播途径主要为通过唾液飞沫吸入，侵入口腔和鼻粘膜，在上呼吸道上皮组织内繁殖，形成病毒血症，再侵犯腮腺、颌下腺、舌下腺、胰腺、性腺等腺体，也可涉及神经组织及其他器官。 病理：为非化脓性炎症改变。腮腺腺体及其周围组织充血、肿胀及水肿，被膜上可见点狀出血，腺泡细胞呈混浊肿胀或坏死碎解，腺体间质有浆液纤维素性渗出物和淋巴细胞、单核细胞及少量中性粒细胞浸润。腮腺管水肿，管腔中有脱落的坏死上皮细胞堆积，阻碍了唾液的排出，使其滞留在腺体内，致使唾液内的淀粉酶经淋巴系统流入血液，故而血液中的淀粉酶含量增高，并从尿中排出。受病毒侵犯的睾丸曲细精管上皮充血、出血和淋巴细胞浸润，间质有水肿及浆液纤维蛋白性渗出物。胰腺充血、水肿，胰岛可见轻度退化及脂肪性坏死改变。脑部的病变白质较灰质为重，神经细胞变性等。 四、临床表现 （一）潜伏期14～25天，平均18天。多数无前驱症状，少数病

病毒的分离纯化

病毒的分离纯化 我设计了一套方案，请大家批评指正： 1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。 2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟 3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。 4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。 5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。 6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH 7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。 7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。 8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。 lf_12345

流行性腮腺炎题库

十五、流行性腮腺炎 一、填空 1.流行性腮腺炎(epidemic parotitis mumps)简称腮腺炎或流腮是儿童和青少年中常见的呼吸道传染病，由腮腺炎病毒引起。 2. 通常一侧腮腺肿胀后1～4天(偶尔1周后)累及对侧，双侧肿胀者约占75%。 3. 流行性腮腺炎的潜伏期为14至25天。 二、单选 1.流行性腮腺炎并发症说法，不正确的是（B） A.流行性腮腺炎病毒经常累及中枢神经系统。 B.脑膜炎、脑炎为常见的并发症，尤多见于儿童患者,女孩多于男孩。 C.偶有腮腺炎后1～3周出现多发性神经炎脊髓炎，预后多良好。 D.耳聋为听神经受累所致,发病率虽不高，但可成为永久性和完全性耳聋， 2.流行性腮腺炎并发症的处理，不正确的是（B） A.并发胰腺炎时应禁食，静脉输液加用抗生素。 B.并发心肌炎时可早期足量使用肾上腺皮质激素。 C.重症并发脑膜脑炎时主要采用对症治疗，伴有颅内压增高者。可用脱水疗法。 D.并发睾丸炎时可用棉花及丁字带将睾丸托起，局部冷敷以减轻疼痛。重症病例可短期用氢化可的松静点治疗。

三、多选 1.以下哪些人不可以接种流行性腮腺炎疫苗（ABCD） A.已知对该疫苗所含任何成分，包括辅料、抗生素过敏者。 B.患急性疾病、严重慢性病、慢性疾病的急性发作期和发热者。 C.妊娠期妇女。 D.患脑病、未控制的癫痫和其他进行性神经系统疾病者。 2. 感染流行性腮腺炎病毒后有哪些临床表现(ABD) A.首先出现的症状是头痛、食欲减退、低烧等。 B.最为人所知的症状是“腮腺炎” C.在感染病毒后，约有70%～80%的患者会出现腮腺炎 D.有一些人感染流行性腮腺炎病毒后没有出现症状或者症状比较轻微 3.流行性腮腺炎的传染特点，说法正确的是（AC） A.人是流行性腮腺炎病毒的唯一宿主 B.早期病人和隐性感染者都不会传播感染。 C.通常情况下，流行性腮腺炎病毒在人间通过飞沫传播 D.流行性腮腺炎比麻疹、水痘的传染性大。 四、判断 1.流行性腮腺炎的潜伏期为14～25天，平均18天。√ 2. 在感染流行性腮腺炎病毒后，约有70%～80%的患者会出现腮腺炎。× 3.青春期的女性可能会出现卵巢炎症或乳腺炎。√ 五、简答

病毒基础知识讲座(二)

三、病毒学的发展历程 病毒病害的病原研究阶段；病毒化学和结构研究阶段。 （一）病毒病害的病原研究阶段 自病毒发现直到上个世纪30年代初，病毒学研究主要集中在：分离和鉴定引起各种病毒性疾病的病毒；病毒对疾体所引起的特异性病理效应；病毒的传播方式和感染宿主范围；各种理化因子对病毒感染的影响等方面。 在病毒发现的那一年,1898年德国细菌学家勒夫勒和弗施（Loeffler和Frosch）证实了口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)的存在。1911年,劳斯(Rous)发现了引起鸡的恶性肿瘤的劳斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）。1915-1917年,托特和德爱莱尔（Twort和d′Herelle）分别发现了噬菌体。人们通过过滤性试验，相继发现了近百种病毒病害，包括流感、骨髓灰质炎、几种脑炎、狂犬病、兔的粘液瘤、马铃薯花叶病、卷叶病、和条斑病、黄瓜花叶病、小麦花叶病等。而且人们从解决病害观点出发，在机体水平上研究了病毒感染的症状、传播途径、传播介体以及病毒的繁殖特征。1899年古巴流行黄热病，细菌学家里德（Reed）证明罪犯确实是伊蚊。接着日本人高见（Takami）证明一种叶蝉会传水稻矮花病，蚜虫会传马铃薯退化病。300多年前（1619年）就知道的郁金香碎色病直到1929年才证明是蚜虫传的。这时期还发现了一些非常有趣的病毒生物学现象，如一种病毒通过变异，产生致病力强弱不等毒株。而且同一种病毒的不同毒株彼此间有拮抗，称干扰现象。还有人发现把病植株的汁液注入到动物体内后，动物的血清和病汁液起特异的反应。这些研究成果都对当时防治病毒病起了重要作用。

病毒空斑纯化步骤

猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案 (1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。 (2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。 (3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。 (4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。 (5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。 (6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。 (7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。 (8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。 (9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。 主要问题： 1、铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。48h之后有些孔的细胞基本上看 不清了，但是这都不是病毒造成的。（支原体的存在会不会导致这种情况） 2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层 琼脂糖层？ 3、使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？ 4、之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。看不出明显的染色 区域，只是有些红色的点点。 5、温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。就是不知道自己配制的液会 不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。 6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬 斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。

常规病毒学实验技术

常规病毒学实验技术 （一）病毒的培养 实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于： ①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验） ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 （一）条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。 （二）优点 组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。 （三）接种途径 1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚） 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1）方法一（造人工气室） ①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的 烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压， 使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的 小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。 2）方法二 ①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。 2．尿囊腔接种（10-11日龄） 用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）

腮腺炎预防知识

腮腺炎预防知识 A.什么是流行性腮腺炎（简称“流腮”）是由腮腺炎病毒引起的一种急性呼吸道传染病。易感人群以儿童和青少年，常在幼儿园和学校中流行。患者在腮腺明显肿胀前6、7日至肿胀后9日期间具有传染性。 B.流行性腮腺炎传播途径流腮可因说话、咳嗽、打喷嚏而通过飞沫进行传播，少数也可以通过被患者污染的物品（食物、食具和玩具）间接传播。 C.流行性腮腺炎症状该病潜伏期一般为14-25天，主要症状为一侧或双侧腮腺以耳垂为中心肿大，疼痛明显，吃酸性食物时疼痛加剧，伴有发热、头痛、咽喉疼痛、食欲不振等症状，可并发脑膜炎、脑膜脑炎、睾丸炎、卵巢炎、胰腺炎、肾炎、心肌炎等疾病。经治疗，症状10天左右可消失，并获得持久免疫力。 D．流行性腮腺炎的预防： 1、保持良好的个人及环境卫生，勤洗手，使用肥皂或洗手液并用流动水洗手，不用污浊的毛巾擦手。双手接触呼吸道分泌物后（如打喷嚏后）应立即洗手。 2、打喷嚏或咳嗽时应用手帕或纸巾掩住口鼻，避免飞沫污染他人。患者在家或外出时佩戴罩，以免传染他人。 3、均衡饮食、适量运动、充足休息，避免过度疲劳。 4、每天开窗通风数次（冬天要避免穿堂风），保持室内空气新鲜。 5、尽量不到人多拥挤、空气污浊的场所；不得已必须去时，最好戴口罩。 6、在流行季节前接种腮腺炎减毒活疫苗也可减少感染的机会或减轻症状。 7、一旦发生流行性腮腺炎，隔离患病同学直至腮肿完全消退为止，但至少要隔离14天。其生活用品、文具等煮沸或暴晒消毒，居室要勤通风换气，患者要注意卧床休息，多喝水以利于毒素排出，同时要注意口腔卫生，防止继发性感染。同时患病同学必须持医生开具的医学证明，经核查确实痊愈，方可返校。 8、注射腮腺炎减毒活疫苗是预防和控制流行性腮腺炎的有效措施。当班级出现流行性腮腺炎病例时，可应急接种疫苗，能有效终止流行性腮腺炎的继续传播，对处于潜伏期的被感染对象，也能减轻病情。 9、消毒可用84消毒液，配制比例1：50擦洗桌椅和学习用具。 资产与后勤管理处卫生所

腮腺炎的五大预防措施

腮腺炎的五大预防措施 何谓腮腺炎 流行性腮腺炎，俗称痄腮或大耳巴，是由腮腺炎病毒所致的急性传染病。腮腺发炎肿胀以耳垂部为起点，逐渐蔓延至颊部、颌部及颈部。这种病可由打嚏、咳嗽等由唾沫传染，也可由食具或玩具等污染后传染，传染性强。患病者以学龄前及学龄儿童为多见。 小儿腮腺炎的症状 流行性腮腺炎(以下称流腮)像流感、流脑一样都属于急性呼吸道传染病，发病的时候一般比较急，也没有什么征兆，潜伏期为14--24日，发病时一般有发热、害冷、头痛、咽痛、食欲不振、恶心、呕吐、全身疼痛等。 腮腺炎最早的症状是咀嚼和吞咽时疼痛，尤其是吞咽酸性液体如醋或柠檬汁时。随着腮腺炎进展，体温升至39.5-40℃。 流腮最具特征性的症状是腮腺部位肿胀，肿胀部位一般以耳垂为中心，向前、后、下发展，经过几个小时到几天，肿痛逐渐加重，体温也迅速上升，可达到39℃以上，说话进食可导致疼痛加剧，严重的患者腮腺周围组织明显水肿，有时会导致容貌变形，甚至出现吞咽困难。 不少父母以为：腮腺肿得越厉害病情就越重。但临床发现，部分患儿染上腮腺炎时，腮腺并没有肿大得出奇，少数孩子的病情还会隐匿，腮腺根本没有肿大。因此，孩子得了“大耳巴”时，父母需格外留个心眼，发现孩子出现持续高热不退、频繁呕吐、精神很差、易嗜睡等征兆时，即使腮腺不太肿，也要第一时间带他去医院就诊。 如何预防腮腺炎 幼儿园、学校人口密集，是腮腺炎发病聚集的主要场所。近年来腮腺 —1—

炎发病范围逐渐扩大，已逐步向社区蔓延。人群各年龄段均可感染腮腺炎病毒，儿童和青少年高发。做好以下几点，可有效预防流行性腮腺炎： 1、预防流行性腮腺炎最有效的方法是注射流行性腮腺炎减毒活疫苗，对容易感染的人群可注射麻疹-风疹-腮腺炎联合疫苗免疫预防。儿童应按时完成预防接种，1岁半接种一针，6岁接种一针。15岁以下儿童、流动人口若既往无腮腺炎疫苗接种史或接种未满2次应及时到当地预防接种门诊进行疫苗查漏补种。但腮腺炎减毒活疫苗不能用于孕妇、先天或获得性免疫低下者以及对鸡蛋白过敏者。 2、室内要注意通风，保持空气流通，家里可用0.2%过氧乙酸消毒。流行期间不要参加大型集体活动，减少到人员拥挤的公共场所；必须出门时，应戴口罩；若小孩有发热或出现上呼吸道症状时，应及时到医院就诊，有利于早期诊治呼吸道传染病。 3、药物预防，采用板蓝根30克或金银花9克煎服，每日1剂，连续6天。 4、一旦发现孩子患了腮腺炎，应立即与健康人隔离，防止传染他人。患儿的鼻咽分泌物要及时清理，毛巾、餐具等要消毒煮沸，并与其他人分开使用。病人隔离期一般从起病到腮肿完全消退为止，约三周左右。 5、儿患病后可终生免疫。 —2—

病毒纯化浓缩方法

病毒纯化浓缩方法 方法一超速离心沉淀法 1 仪器 超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管 2 方法步骤 （1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。 （2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。 （3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。

（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。 （5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。 （6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。 （7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。 （8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。 （9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。 （10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。 （11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。 （12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。 方法二 PEG-8000浓缩法

病毒蚀斑技术

病毒蚀斑技术 病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到1～2mm，大至3～4mm，这就是蚀斑。某些病毒在一般单层细胞培养内不形成CPE，但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。某些病毒，例如新城疫的某些变异株和SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有108个PFU……等等。 病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10×稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。例如在接种02ml病毒悬液的细胞瓶中出现36个蚀斑，则每ml病毒悬液的蚀斑形成单位就是1/02×36=180个，亦即180PFU/ml，当然也可写成36PFU/02ml。蚀斑技术主要用于病毒纯化，亦即挑选病毒克隆株(Clone)。由于病毒的遗传变异，一般所用的病毒悬液或所谓的病毒株，实际上都是由许多在特性上不尽一致的病毒粒子组成的混杂群体。应用蚀斑技术，也就是根据蚀斑的不同的性状、产斑条件和产斑时间等进行挑斑，可以从这类混杂群体中挑选出各个不同的纯化病毒，亦即克隆株。近年来，许多弱毒疫苗株就是通过蚀斑技术选育而成。我们实验室应用蚀斑技术从狂犬病弱毒株中，分离获得了免疫性显著优于其亲本株的SRV9克隆株。而在弱毒疫苗的生产中，也需经常地通过蚀斑技术选出克隆株，借以保证疫苗株稳定的免疫原性和弱毒特性。蚀斑技术还是测定病毒悬液中感染病毒含量的一个准确方法。因为组织

病毒学题库完整版本

病毒学题库 一.填空题（10分） 1.第一个提出病毒概念的是：贝杰林克（Martinus Beijerink）。（病毒学之父） 2.病毒的特点有：没有细胞结构、仅有一种类型的核酸、特殊的繁殖方式、缺乏完整的酶系统和能量合成系统，也没有核糖体、绝对的细胞内寄生。 3.病毒的对称性有：螺旋对称、二十面体对称、复合对称、复杂对称。 4.病毒的复制过程有：吸附、侵入、脱壳、病毒生物大分子的合成、装配和释放。 5.肝炎病毒有：甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。 6.昆虫病毒杀虫剂的缺点有：杀虫速度缓慢、病毒特异性强，寄主范围窄。 ★7.第一个发现病毒的人是：法国人Adolf Mayer 。 ★8.病毒的宿主有：微生物、植物、动物。 ★9.病毒的核酸类型有：双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）、双链RNA（dsRNA）、单链RNA（ssRNA）。 ★10.病毒突变体的种类有：条件致死突变体、蚀斑突变体、抗原突变体、共变体、适应新宿主突变体。 ★11.人畜共患的病毒有：流感病毒、狂犬病毒、朊病毒。 ★12.艾滋病病毒的主要传播途径有：性传播、血液传播、垂直传播。 ★13.昆虫病毒杀虫剂的优点有：对人畜（人体、畜禽、鱼虾等）安全无害，不会造成环境污染问题、病毒的宿主特异性高、昆虫病毒使用后效果明显。 二.判断改错题（少了大约11题左右，10对10错，共15分） 1.判断（描述）病毒的大小常用的单位是微米。（×，微米→nm或?） 2.病毒分类系统中“种”作为最小的分类单位。（√） 3.病毒的突变只是指自发突变。（×，病毒的突变可分为自发突变和诱发突变） 4.病毒的非增殖性感染有流产感染，限制性感染和潜伏感染。（√） 5.HIV核心为两条单链DNA构成的双体结构，并含有反转录酶。（×，DNA→RNA） 6.传染性非典型肺炎又称为严重急性呼吸综合症，是一种由冠状病毒感染所引起的急性呼吸道传染病。（√） 7.流感病毒的宿主限制性不是很严格，能跨越种属传播。（√） 8.流感病毒主要通过呼吸道传播，且病毒极易变异，往往造成世界性大流行，甚至爆发流行。（√） 9. 狂犬病只发生在犬和人身上，其他动物很少发生。（×，狂犬病病毒感染所有温血动物）★10.HBsAg阳性，乙肝。（） 三.名词解释（共5题，每题4分，共20分） 1.病毒基因重组：两种不同病毒感染同一细胞时，发生遗传物质（核酸）的交换，称为（病毒）基因重组，其子代称为重组体。 ★2.病毒隐码:描述病毒性质的一系列符号。包括核酸的类型、链数、分子量大小，病毒粒子的形状，宿主传播介质等。【有四对符号，包括核酸类型/核酸链数，核酸分子量（×106）/病毒粒子中含核酸的百分率，病毒粒子的外形/病毒被壳的外形，寄主种类/传播介体种类（或传播方式）】 3.缺损病毒：是指基因组上一个或多个病毒自我复制必需基因功能缺乏，它的复制需依赖其它病毒基因或基因组的辅助活性，否则在活的允许细胞内也不能完成复制。有些病毒因基因

病毒蚀斑减少中和试验

病毒蚀斑技术介绍 1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术（Virus plaque formation）成为许多病毒的滴定和研究方法。 1、原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm 的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位（PFU/ml）来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为 2.5%26times;103，则病毒原液的滴度为：58%26divide;0.2%26times;2.5%26times;103＝7.25%26times;105（PFU/ml） 2、技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆（无性繁殖纯系）、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。 （1）病毒生物学纯化（Virus biological purification）在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时, 有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒, 亦称%26ldquo;克隆株%26rdquo;。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化, 必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒

流行性腮腺炎防控知识

流行性腮腺炎防控知识 流行性腮腺炎是一种由腮腺炎病毒引起的急性呼吸道传染病，中医学称“痄腮”，具有较强的传染性，以5-15 岁发病最多。通过腮腺炎病人或病毒携带者的唾液或呼吸道飞沫经空气传播。常在托儿所、幼儿园、学校和新兵中爆发。腮腺炎在冬春季发病较多，但全年都可发生感染流行。潜伏期14—25天，平均18天。一次感染后可获得终身免疫，但个别抗体水平低下者，亦可再次感染。 临床表现：发病初可有发热，畏寒，头痛，食欲减退，全身不适等症状，1—2日后腮腺逐渐肿大，体温可达39℃以上。儿童患者症状较轻，可无明显前驱症状。腮腺肿大以耳垂为中心，向前、向后、向下发展，充塞于下颌骨和乳突之间。因腺管发炎部分阻塞，故进食酸性食物促使腺体分泌时疼痛加剧，颊黏膜处的腮腺管口早期可有红肿。有些病例1—4日后又可累及对侧，并可同时累及颌下腺、舌下腺。颌下腺肿大时颌下肿胀，可触及椭圆形肿大的腺体包块。舌下腺肿大可见颈前颁下肿胀，并出现吞咽困难，也可单独累及颌下腺、舌下腺。除腮腺肿大外，本病孕妇感染后，病毒可通过胎盘导致胎儿先天感染，从而引起胎儿畸症。青春期妇女受感染后，还可继发卵巢炎，引起月经紊乱和不孕病。青

春期男性患者，可并发睾丸炎。最严重的并发症是脑膜脑炎，还可并发胰腺炎、心肌炎、乳腺炎等。 诊断：1.病史：发病前2—3周有腮腺炎接触史。2.腮腺肿胀，或可伴颌下腺、舌下腺肿大，合并脑炎、胰腺炎、皋丸炎者可有相应临床表现。3.化验检查：血白细胞计数正常或减少，淋巴细胞相对增多，在发生脑炎或睾丸炎时白细胞可增高，血、尿淀粉酶增高，血清抗体测定早期抗s抗体增高，双份血清抗v抗体滴度1个月内升高4倍以上。 预防措施及注意事项； 1.如发现有上述临床表现中的症状，马上到医院去检查，以便及时进行隔离治疗。2.腮腺炎学生应隔离至腮腺肿胀完全消退方可上学，大约3周左右，以免传染给其他学生。3.感染腮腺炎的学生痊愈上学时需出示医院痊愈证明，否则不予入校。4.患病期间饮食宜清淡，以流质、半流质为主，不宜食用酸性食物，肥腻及油炸食品。 5.流行期间少去公共场所，可采用腮腺炎减毒活疫苗肌注预防，应用麻疹一风疹一腮腺炎三联疫苗，预防效果良好，保护力持久。也可采用板蓝根连服3—5天。 6.尽量让房间保持在通风状态下。 7.积极参加体育锻炼，增强自身抗病能力。

第十二章病毒的培养

第十二章病毒的培养 一、实验动物 二、鸡胚 三、组织培养 (一)组织（块）培养 (二)器官培养 (三)细胞培养 (四)组织和细胞的培养方法 (五)细胞克隆技术 (六)细胞的保存 四、病毒的组织培养 五、病毒蚀斑技术 病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。因此,实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞就成为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的先决条件。培养病毒最早应用的方法是实验动物和鸡胚,但从50年代简便适用的细胞培养广泛应用于病毒培养以来,前两种方法已降到次要地位,但至今仍有部分病毒的分离鉴定还离不开实验动物或鸡胚,特别是在免疫血清制备以及病毒致病性、免疫性、发病机理和药物效检等方面。在禽类病毒病和流感、副流感类等病毒病的研究方面,鸡胚(含其它禽胚)仍具有重要的应用价值。 一、实验动物 实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。但是后来发现,实验动物经常自身带有病毒,常常混淆试验结果,并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险,例如被某些致瘤病毒所污染等等。为了克服这个缺陷,目前已通过微生物控制手段,培育出无菌动物(Germ Free Animal, 简称GF)、已知菌动物或称悉生动物(Gnotobiotics, 简称GN)和无特定病原动物(Specific Pathogen Free Animal,简称SPF)。 GF动物体内和体外均检不出任何微生物、寄生虫或其它生命体。

GN是确知所带微生物的动物。只带一种菌的叫单菌动物,其次为双菌和三菌动物,四菌以上则称多菌动物。 SPF是指体内无特定微生物和寄生虫感染的动物。从微生物控制的程度讲,SPF动物虽是这三类中最低的,但它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究产生干扰的微生物,所以能满足病毒学一般实验的需要,比应用普通实验动物取得的结果更为科学与可靠。限于条件,某些实验室当前仍常应用普通实验动物,但也必须健康,并使用纯系品种。一次实验使用的动物,在年龄、体重和营养状态等方面要尽量一致。 国外实验动物科学发展迅速,我国已在部分大城市建立实验动物中心,专供应各种经过人工遗传控制和微生物控制而育成的纯系高品位实验动物。为了满足生物学、医学和兽医学研究的需要,国外按遗传控制标准已育成各类实验动物2600余种,其中小鼠就有1700余个品系,而且已经规范化、标准化,从而保证了研究工作的科学性和严密性。 虽然病毒学实验中应用实验动物的比重正在逐步降低,但是乳鼠至今仍是分离某些虫媒披膜病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒的主要工具。兽医学上除常应用家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠和鸡胚等进行病毒分离、驯化以及疫苗生产以外,还常直接应用自然易感动物,例如羊、猪、狗、鸡甚至马和牛等大动物作各该病毒的实验研究。 但如上述,普通实验动物经常自身带毒,甚至发生病毒病的流行。例如家兔常有乳头状瘤、多型瘤、疱疹、兔痘、脑脊髓炎和传染性口腔炎等病毒感染,小白鼠常有鼠痘(脱脚病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、病毒性肺炎、脑脊髓炎、白血病、乳腺瘤、鼠肝炎等病毒感染,仓鼠有唾腺炎等病毒感染,豚鼠有脑膜炎、唾腺炎等病毒感染,实验研究时必须注意。 实验动物主要用于: (1)分离病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒; (2)培养病毒,制造抗原和疫苗; (3)测定各毒株之间的抗原关系,例如应用实验动物作中和试验和交叉保护试验; (4)制备免疫血清和单克隆抗体; (5)作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定,建立病毒病动物模型等。进行动物实验时,首先考虑的是选择对目的病毒最敏感的实验动物品种和系,以及适宜的接种途径和剂量。至于实验动物的饲养管理、接种和采血、剖检等具体方法,请参阅微生物学实验指导或有关专著。 二、鸡胚 鸡胚(包括其它禽胚)是正在发育中的机体,多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代,并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低,又可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作简便易行。 应用鸡胚需要注意的首要问题是胚内可能污染细菌(如沙门氏菌等),尤其是经母鸡

流行性腮腺炎的发病机制

多认为该病毒首先侵入口腔粘膜和鼻粘膜，在上皮组织中大量增殖后进入血循环（第一次病毒血症），经血流累及腮腺及一些组织，并在其中增殖。再次进入血循环（第二次病毒血症），并侵犯上次未受波及的一些脏器。病程早期时，从口腔、呼吸道分泌物、血、尿、乳汁、脑脊液及其他组织中，可分离到腮腺炎病毒。有人分别人胎盘和胎儿体内分离出流行性腮腺炎毒。根据流行性腮腺炎患者在病程中可始终无腮腺肿胀，而脑膜脑炎、睾丸炎等可出现于腮腺肿胀之前等事实，也证明腮腺炎病毒首先侵入口鼻粘膜经血流累及各种器官组织的观点。也有人认为病毒对腮腺有特殊亲和性，因此入口腔后即经腮腺导管而侵入腮腺，在腺体内增殖后再进入血循环，形成病毒血症累及其他组织。各种腺组织如睾丸、卵巢、胰腺、肠浆液造酶腺、胸腺、甲状腺等均有受侵的机会，脑、脑膜、肝及心肌也常被累及，因此流行性腮腺炎的临床表现变化多端。脑膜脑炎是病毒直接侵犯中枢神经系统的后果，自脑脊液中可能分离出病原体。腮腺的非化脓性炎症为流行性腮腺炎的主要病变，腺体呈肿胀发红，有渗出物，出血性病灶和白细胞浸润。腮腺导管有卡他性炎症，导管周围及腺体间质中有浆液纤维蛋白性渗出及淋巴细胞浸润，管内充塞破碎细胞残余及少量中性粒细胞。腺上皮水肿、坏死、腺泡间血管有充血现象。腮腺思周显著水肿，附近淋巴结充血肿胀。唾液成分的改变不多，但分泌量则较正常减少。由于腮腺导管的部分阻塞，使唾液的排出受到阻碍，故摄食酸性饮食时可因唾液分泌增加、唾液潴留而感胀痛。唾液中含有淀粉酶可经淋巴系统而进入血循环，导致血中淀粉酶增高，并从尿中排出。胰腺和肠浆液造酶含量。流行性腮腺炎病毒易侵犯成熟的睾丸，幼年患者很少发生睾丸炎。睾丸曲精管的上皮显著充血，有出血斑点及淋巴细胞浸润，在间质中出现水肿及浆液纤维蛋白性渗出物。胰腺呈充血、水肿，胰岛有轻度退化及脂肪性坏死。（搜集）

病毒和病毒成份的提纯

第十四章病毒和病毒成份的提纯 一、病毒的提纯 (一)沉淀法 (二)层析法 (三)两相溶剂间分配系数法 (四)红细胞吸附法 (五)电泳法 (六)超速离心法 (七)超滤法 二、病毒蛋白亚单位的分离 三、病毒脂质的抽提 四、病毒糖类的抽提 一、病毒的提纯 所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。 病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。 1.物理均一性 测定病毒样品的物理均一性,是证明其纯度的常用方法,包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。 2.病毒滴度与蛋白含量的比例 测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。

3.免疫学反应 免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。 4.结晶形成 病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。 病毒提纯的主要依据和条件有: (1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖, 要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。 (2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。 (3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子,可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。 (一)沉淀法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法 病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2.聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG