实验一dna提取

实验一DNA的小量制备

小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）

1 实验目的：

随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。

2 实验原理

细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。

关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：

1．CTAB 法：

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。

2．SDS 法：

利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。

几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA 处于溶解状态时，尽

量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。

3材料和试剂：

长春花叶片

试剂

（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （），20 mmol/L EDTA-Na2，LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入%（V/V）的β-巯基乙醇。

表1 CTAB提取缓冲液配制

用HCl 调pH 值。

（2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（）。

（3）氯仿/异戊醇：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

4 仪器设备

离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。

5 方法与步骤：

在提取过程中用到的吸头，提取缓冲液等先高压灭菌（121℃，20min），取出后待用；

取大约指甲盖大小的植物叶片，放入的EP管中, 加入液氮，用钢珠研磨成粉末状，再加入600μL的CTAB提取缓冲液，；

65℃水浴锅中水浴40min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，颠倒几次，乳化1min。4℃，11,000rpm离心10min；

吸上清到新离心管中（约400μl），加入等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃放置20min沉淀DNA；

5000 rpm常温离心15min，倒掉上清液；

用75%乙醇（900μl）洗沉淀，11,000rpm离心2min，倒掉乙醇，再用乙醇同样处理一次；

置于干燥仪干燥10min，将水分蒸干；

加入50μL去离子水，融解DNA，同时加入RNA酶(按每50μL DNA加入1μL RNase)，37℃30min；

利用分光光度计检测OD260,同时进行1％凝胶电泳检测；

琼脂糖电泳检测DNA：制作1%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液5μL电泳检测；

-20℃保存DNA备用；

提取的DNA的浓度检测：取少量待测DNA样品，用蒸馏水稀释1,000倍；用蒸馏水做空白，分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值。

【注意事项】

1. 叶片磨得越细越好。

2. 注意移液器的正确使用。

3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA 降解。

6. 思考题

1．制备的DNA 在什么溶液中较稳定

2．为了保证植物DNA 的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么

7 实验结果：

结果计算

式中OD260nm 为260nm 处的光密度；L 为比色杯光径（cm）；为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。DNA 的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA 溶液适当稀释后，在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 和OD280nm。如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过％。

8 实验分析：

传统DNA提取方法

CTAB 法、SDS 法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE 溶解DNA 备用。

CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( > 0. 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB - 核酸复合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。

SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温(55～65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS 法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。

基因组DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康。

DNA提取新方法

近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA 。

已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA 的报道。马小军等将CTAB 液提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过Wizard 纯化系统纯化得到的DNA ,RAPD 扩增效果良好,产率达2 250μg/ g 。

张博等用硅珠(SiO2) 颗粒吸附DNA 纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的 DNA 样品。

黄椰林等对常规CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN 的APCR 产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料。

袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA。

目前国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高

效, DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少。

著名的国外的试剂盒生产厂家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、Whatman 等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。

国内的生物公司发展迅速,如上海生工、北京天为、北京博奥等也开发了系列试剂盒,质量与国外厂家相当,价格较低。

除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。

DNA 试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA 提取—扩增 PCR 试剂盒,将DNA 提取和PCR 扩增结合起来,极大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。

另外,还有高通量的DNA 提取产品,如高通量组织细胞研磨仪MM301 ,在常温和冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可以多达48 个甚至192 个。美国应用生物系统公司6100 型核酸提取仪,可用于RNA、DNA 的提取纯化,可自编程序, 可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不同来源的样品中同时提取96 个样品。

质粒DNA的提取及检测实验报告

题目：质粒DNA的提取及检测 一．实验目的: 1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法； 2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 二．实验原理 1. 质粒 (Plasmid)： 一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。 2.载体(Vector)： 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。 3.分离质粒DNA： （1）培养细菌使质粒扩增； （2）收集和碱裂解细菌； （3）分离和纯化质粒DNA。 4.碱裂解法 （1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解

（2）溶液Ⅱ：L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制 作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性 （3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸，双蒸水 作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。 5.电泳 带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线 性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 6.提取质粒 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、 闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉 开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料 含量有关。 三．实验材料及设备 1.实验材料： （1）含质粒pUC18大肠杆菌，塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）； （2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：

实验一-DNA提取

实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

质粒DNA的提取和纯化实验报告

质粒DNA的提取和纯化实验报告

实验一、质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。 二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体

dna粗提取的实验步骤

实验步骤——以洋葱为实验材料： 1、称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L 的氯化钠溶液，充分研磨。 洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。 2、研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。 3、向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。 此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。 实例: 用鸡血细胞液粗提取DNA 并鉴定步骤 1、提取鸡血细将制备好的鸡血细胞液(已在课前配好) 5~10mL，注入到50ml 烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL 的烧杯中，取其滤液。图示胞的细胞核物质 2、溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液40 mL 加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA 在溶液中呈溶解状态。 3、析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。 4、滤取含DNA的粘稠物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL 的烧杯中。取纱布上的黏稠物。 5、将DNA 的粘稠物再溶解取一个50 mL 烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl 溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。 6、过滤含DNA的氯化钠溶液取一个100 mL 烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液(DNA 溶于滤液中)。 7、提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95% 的酒精溶液50 mL(加入时动作要慢)，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20 mL 的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol/ L 的NaCl 溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

实验 __DNA的粗提取与鉴定

实验 DNA 的粗提取与鉴定 教学目的 1． 初步掌握DNA 粗提取和鉴定的方法。 2． 观察提取出来的DNA 物质。 实验原理 1． DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是随NaCl 的浓度变化而改变的。DNA 在0．14mol/L 的NaCl 溶液中的溶解度最低，据此可使DNA 充分溶解而使杂质沉淀或DNA 沉淀而杂质溶解。 2． DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA 。 3． DNA 对蛋白酶、高温和洗涤剂（可以溶解细胞的细胞膜，除去脂质和蛋白质，而对DNA 没 有影响）都具有较好的耐性。 4． DNA ＋二苯胺?? →?沸水浴 蓝色（用于DNA 的鉴定） 实验材料： 鸡血细胞液（5-10ml ），体积分数为95%的酒精溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml 的柠檬酸钠溶液(抗凝剂)，物质的量浓度分别为2mol/l 和0.015mol/l 的氯化钠溶液，二苯胺试剂 实验步骤 1．材料制备 0.1g/ml 柠檬酸钠100ml 置于500ml 烧杯内→玻璃棒搅拌→1000r/min 离心2min →吸去上清 液→即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡 血细胞自行沉淀） 活鸡血180ml

[思考]为什么要除去血液中的上清液？ 2．方法步骤 取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速 搅拌，使血细胞加速破裂，纱布过滤，滤液中含DNA和 其他核物质，如蛋白质 （1）提取鸡血细胞的细胞核物质 原理：血细胞吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞 破裂 （2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌 （3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现 丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液 相当于稀释到0．14mol/L） （4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上 （5）DNA粘稠物再溶解：在50ml的烧杯中注入20ml 2mol/L的NaCl溶液，缓慢搅拌3 min 使上述粘稠物尽量多的溶解在溶液中。 （6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋冷却的95%的酒精50ml，缓慢搅拌，出现乳白色丝状 物，用玻璃棒将丝装物卷起。 （8）DNA鉴定：

实验6 动物肝脏中DNA的提取

实验六：动物肝脏中DNA的提取及定量测定 一、实验目的 1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。 2、了解常见生化组分提取技术。 3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 二、实验原理 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA 主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS 或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl)，但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。 DNA(脱氧戊糖基) [H+]HO-CH2-C(=O)-CH2-CH2-CHO 二苯胺蓝色化合物 在DNA浓度为20~200μg/ml范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。 三、实验器材 猪肝，分光光度计（595nm），比色杯，匀浆器，量筒（50ml、10ml），离心机(5000r/min)，离心管，试管及试管架，移液管（1.0ml、2.0ml、5.0ml），恒温水浴锅 四、实验试剂 氯化钠，柠檬酸钠，95%乙醇，SDS，氯仿，异戊醇，二苯胺试剂，DNA标准溶液（200μg/m1），二苯胺试剂等。 五、实验操作 1、配制溶液： 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（2.925g氯化钠，20.85g柠檬酸钠，溶解于500mL 蒸馏水）。 氯仿-异戊醇混合液：按照体积比20:1配制500mL。 5％SDS溶液：10g SDS溶于200ml水中。 二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在70％乙醇中重结晶2次）5克溶于500ml 分析纯的冰醋酸中，再加入50ml过氯酸(A.R，60％以上)，混匀待用。当所用药品纯净时，配得试剂应为无色。临用前加入5ml 1.6％乙醛溶液(乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用)，贮于棕色瓶。 2、称取猪肝2g，用匀浆器磨碎(冰浴)，加入4ml的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min，弃上清；沉淀中再加入6ml缓冲液，于4000r/min离心10min；取沉淀。

dna提取实验步棸

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入5ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。 （2）转入2ml 离心管中（转2管或4管），每管转入1ml，用台式离心机以12000 rpm 离心5min,弃上清收集沉淀。 （3）加入300ul 10×TE缓冲液悬浮沉淀 （4）加入100μl 200mg/ml的溶菌酶，37℃水浴1h； （4）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml蛋白酶K在50℃恒温水浴锅中水浴3h ,间歇振荡数次。 （4）加入100μl 5mol/L NaCl，65℃水浴10min （5）加等量（570ul）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心12000 rpm，10min。 （6）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离心12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。 （7）加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀20min ，12000 rpm离心,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 （8）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。 （11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。 （12）Nanophotometer仪测定DNA浓度及OD值。 （13）-20℃保存备用。 1.3.2菌群16S rRNA基因V3高变区PCR扩增 （1）16S rRNA基因V3高变区通用引物： V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ V3R：5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’ 其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G为GC 夹。

实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告

实验一、质粒DNA的提取及检测 【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 3、学会PCR操作的基本技术 第一部分质粒DNA的提取 一、实验原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 二、仪器与试剂 1、仪器恒温摇床、台式离心机 2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿 三、实验步骤 1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19 质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。 3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。 5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。 6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。 7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。 8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min， 将上清转移到另一离心管中。 9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。12000r/min，离心5min。 倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10、用1mL70℅乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干 燥。 11、加20μLTE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。

实验一 DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

提取质粒实验学习整理

1.菌液OD值越高，质粒产量越高 2.大肠杆菌OD值越高，提取的质粒的浓度就越高吗？？？还要看质粒纯度，纯度一般 在1.8-1.9最适合，再高了就是蛋白污染 3.一般而言gene导入原核细胞称转化，导入真核细胞称转染。 4.用QIANGEN质粒提取试剂盒提取质粒，我没有提不出来的经历，有以下几点要注意， 从细胞、试剂盒及操作三个方面考虑： 1..确定细菌是阳性转化子，应该含有你的质粒，过夜摇菌已足够，记得加抗生素。 2.关于试剂。溶液2中是否浑浊，SDS在低温产生结晶，使用前用37度水浴。溶液3 中的醋酸钾可能产生结晶，使用前应该温水溶解。确认洗脱液1中的乙醇没有挥发，闻一闻就知道了。洗脱液2是否在使用前已加乙醇，加乙醇后在盖子上打钩，以免与没加的混淆。 3.抽提过程中，加溶液1（放4度保存）后应该充分悬浮菌体，以便裂解充分；加溶液 2和3应该快，加溶液2后打开盖有丝状物，加溶液3出现絮状沉淀，离心要充分。 请严格按说明书操作。 如果你觉得以上几点你都做的很好，试剂盒是新的，换含其它质粒的菌株试一试，如pUC18的转化子。如果试剂和是用过的，放置太久，换其它试剂盒吧，要不换土法试试！ 5.Qiagen我卖这么多个，到目前还是零投诉。不过出现问题基本如下： 1。如果是质粒超纯试剂盒，得率偏低，因为Qiagen自己得专利树脂填料，对纯度得要求比对得率得要求高，在超纯质粒的抽提过程中，得率比同类产品要低些，不过OD 得比值很好，就是纯度很高。 2。如果是质粒小提，快速提取等，基本不出什么问题。 有些操作要注意， 1。Solution2,3有没有沉淀。 2。细菌培养过程中，有没有抗生素选择压力，不然质粒丢失。 4。收获细菌有没有测OD值，有些仅凭目测，呵呵，又差异得。 不过，有个建议，质粒小提，快速提取，就不要用Qiagen得了，偏贵。 6.从你跑的电泳来看，你的质粒不是很多，差不多就是300ng,可能你的小片段太少，所 以你的小片断那就看不出来了，不知道你大片段分子是小片段的多少倍，一般跑电泳能看到在50ng左右,标准的MARK是每条带是50ng,如果你即使切下来了，但你的小片段太小，也是什么都看不到的，这里有一个大约估计量的公式，小片段的纳克数等于大片段纳克数乘他们分子量的比值 7.提取质粒失败的可能的原因：1：克隆有问题；2：提质粒时裂解时间过长；3：质粒提 取试剂盒的溶液有问题；4：有点可能本身拷贝数就比较低，可换感受态重新转化后提质粒

简单DNA提取实验

实验材料 透明杯子、筷子、盐、洗洁精、冰箱冷藏的白酒、冰块、隐形眼镜护理液、蒸馏水、牙签等 实验步骤 1.获取口腔上皮细胞。含一口蒸馏水，开始漱口，试着用自己的舌头舔口腔内壁，大约2分钟； 2.用透明的杯子收回口腔中的液体； 3.在杯中加入半勺盐，缓慢搅拌10圈，记住动作要慢哦； 4.在杯中加入洗洁精5~6滴，均匀慢速地搅拌3分钟，切记越慢越好； 5.加入5滴隐形眼镜清洗液，继续缓慢搅拌10圈，加入冰块静置5分钟； 6.再次搅拌10圈，从冰箱拿出冷藏的白酒，缓慢倒入杯中，于是酒精便自然分层游离在唾液上方，唾液则沉淀在杯底； 7.由于DNA不溶于酒精，此时在上清下浑的酒精和唾液分层中间，能看到固态絮状的DNA。用筷子轻轻搅拌，将DNA缠绕起来，缓缓拉出水面，就能目睹DNA的真容了。这就是你的DNA哦！ 8.将DNA放入小瓶中，也可加入一些精油或酒精。这样，一条兼具观赏价值与特殊含义的精油项链就做好了。 实验原理：

DNA主要存在于真核生物的细胞核中，动物、植物都属于真核生物。在高温的条件下，DNA会变性(被破坏)，而在常温和低温条件下，则可以保存。由于哺乳动物成熟的红细胞不含有细胞核，因此人类的血液当中含有的DNA是比较少的，如果想要在非实验室环境下提取自己的DNA，建议选择其他容易获得的细胞，比如口腔的上皮细胞等。 下面我们就对具体操作步骤中涉及的原理进行解释 1.获取细胞：用漱口的方式，获取的是口腔的上皮细胞。 2.盐的作用：在漱口时细胞已经破碎，加盐可吸附DNA。带正电的钠离子会和DNA分子中带负电的区域发生反应，可使DNA分子聚到一起。 3.洗洁精的作用：洗洁精中含有十二烷基硫酸钠，它可以破坏细胞膜，这样就可以将细胞内的物质溶解于溶液当中，从而释放DNA，也可用牙膏、洗发香波等来代替。 4.缓慢搅拌：防止用力太大，速度太快会使DNA断裂。 5.隐形眼镜清洗液的作用：去除镜片上的蛋白质，主要是依靠清洗液中含有的蛋白酶，蛋白酶可以分解溶液中的蛋白质。加入隐形眼镜清洗液，其中蛋白酶的成分就可去除溶液中蛋白质的干扰，使DNA 更容易被提取出来，也可用菠萝或嫩肉粉来代替。 6.冰块和冷藏酒：在低温环境下，由于DNA不溶于酒精，因此可以析出DNA。 如果是植物细胞，就先要加洗洁精，然后再加盐。因为植物细胞有细胞壁，清水中不能吸水胀破。所以要先去除细胞壁。另外，在实验室提取DNA的过程中，会进行多次的氯化钠(NaCl)浓度调节，并且

质粒DNA的提取实验

实验六质粒DNA的提取 一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒 二、实验原理 质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS （十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。 三、实验材料与试剂 1、实验材料大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T） 2、实验试剂 (1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L； (2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)； (3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml； (4) 氯仿－异戊醇（24：1）； (5) 异丙醇、70%乙醇； 四、实验步骤 （一）提取质粒 1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成） 2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。 3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm 离心1min。 4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。

质粒DNA的提取实验报告

质粒DNA的提取 一、实验方法 碱裂解法抽提质粒DNA 二、实验原理 基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。 三、实验步骤 1）质粒提取 1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。 2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。 3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟 4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。 5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。 6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA 7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟 8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇 9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA 2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳 灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I) 加样：质粒+上样缓冲液→混匀 电泳 结果观察：UV灯下 四、实验结果 五、实验分析 裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质 1、防止DNA裂解：Solution 1 1）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解 2）、所含EDTA抑制酶活性 2、溶解与变性：Solution2 1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性

DNA提取实验报告

生物学大实验（二） 实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验 实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生 物学基本技术的理解和掌握。 实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、 磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。 实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的 培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质 粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合 于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。当对 提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的 泳动速度快。 实验步骤： 一质粒扩增 （1）普通lb固体培养基制备： 制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。 （2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分) 二质粒dna的提取(碱法) 1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中， 12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到 较多的细菌沉淀； 2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。 3、加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。 4、加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免 dna断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。 5、加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀 地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。 6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10 倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。 7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的 1ml 70％乙醇。 8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置dna干燥5～10分钟。 9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 10 、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水（ph8.0）中，储于-20℃冰箱中 三dna酶切反应 1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入 dna（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶 液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操 作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱 的时间，以免活性降低。 2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）， 37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。 3、每管加入2υl0.1mol/l edta（ph8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。 四 dna的琼脂糖凝胶电泳 1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。

实验一 质粒DNA的提取及定量分析

实验一质粒DNA的提取及定量分析 一、实验原理与步骤 1.实验原理：碱裂解法抽提质粒DNA 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA 的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 2.质粒DNA提取的方法步骤 ①收集菌体：取1.5ml培养液至Ep管中，12000rpm离心1min，弃上清，取沉淀。 ②溶解菌体：将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，强裂振荡混匀。 ③变性：加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒5-6次以混匀内容物，冰上放置5分钟。 ④复性：加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 ⑤12000rpm 离心５分钟，取上清移到１个新的Ep管中。 ⑥取上清（≈ 420ul），分别加入1/2体积酚(210ul)，和1/2体积氯仿/异戊醇（24:１） (210ul) ，涡旋震荡混匀溶液。 ⑦12000rpm、离心5分钟。小心移取上清液（≈ 400μl)至另一个新1.5mlEp 管中。

⑧上清液加入２倍体积（≈ 800ul ）预冷无水乙醇，混匀，于 -20℃中静置 0.5h。 ⑨12000rpm, 离心5分钟。弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000rpm 离心10分钟。 10.干燥DNA：用移液器小心吸走上清液，然后瞬时离心，再将残余的少量液体移走，用温和的电吹风吹干DNA沉淀（以看不到液滴为准）。 11．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA，-20℃下保存备用。 二、结果与分析 1.质粒DNA的浓度 经测定，本组的质粒DNA浓度如下：GST-T的为142.7μg/ml，OD260/280=1.99；ProB的为196.5μg/ml，OD260/280=1.94。 分析：本次提取的质粒DNA浓度较高，OD260/280值在1.8-2.0之间，说明这次提取的质粒DNA比较纯。（OD260/280值的参考值为：DNA: 1.8 (RNA: 2.0)比值<1.8：蛋白质污染；比值>2.0: RNA污染。）其原因可能为，取了两次菌液共3ml，菌体数量较多，其携带的质粒DNA也较多，故提取的质粒DNA浓度较高。溶液P1中加入了RNase A，降解了RNA，排除了RNA的污染；溶液P2中含有蛋白变性剂，使蛋白变性沉淀下来，通过离心被除去，且在提取的过程中加入了去蛋白液PD，进一步去除样品中的蛋白质，故提取的质粒DNA比较纯。 2.关于电泳条带：

DNA 提取过程及原理

DNA 提取过程及原理 一、实验原理 从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。 盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于 0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开。 分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内，吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。另外，生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。 核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNA分子污染。 操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4-10；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。 提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类分子，去除RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。 二、仪器设备 高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱 三、试剂 EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2mlβEDTA、0.2% -巯基乙醇，加双蒸水(ddH2O)定容到100ml；β①2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L -巯基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g ②氯仿:异戊醇(24:1) ③洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙醇和0.077g乙酸铵，加双蒸水定容到100ml； ④无水乙醇、70%乙醇； ⑤TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0 四、操作步骤 ①将材料在液氮中研磨成粉，迅速分装于Eppendorf 管中，加入0.7ml 60℃水浴中预热的2×CTAB提取液和20ul b-巯基乙醇，轻轻转动使之混匀； ②样品于60℃温浴45min，每5min将Eppendorf管上下颠倒混匀；

实验四植物DNA的提取

实验四植物DNA的提取 一、实验目的 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。 二、实验原理 1、核酸提取的基本原理 核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。 吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。 SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。