FlowJo 中文实用手册

FlowJo中文实用手册

（软件版本：FlowJo7.6.5 2012/06/20 更新）

第一章 FlowJo简介 (1)

一、FlowJo对电脑配置的要求 (1)

二、FlowJo的安装过程(Windows) (1)

三、FlowJo的工作台 (5)

第二章 FlowJo分析单标样本 (6)

一、由原始数据生成单参数直方图的过程 (6)

二、图形的输出和保存 (10)

第三章 FlowJo分析多色标记样本 (13)

一、由原始数据生成二维点图的过程 (13)

二、二维点图的设门原则 (16)

三、多色标记分析说明 (16)

第四章 FlowJo软件荧光补偿 (18)

一、用FlowJo做荧光补偿并进行数据分析的步骤 (18)

二、FlowJo荧光补偿的具体步骤 (18)

三、双指数转换 (24)

第五章 FlowJo的批处理功能 (27)

一、设门分析的批处理 (27)

二、表格分析的批处理 (32)

三、图形分析的批处理 (35)

第六章 FlowJo分析细胞凋亡样本 (43)

一、细胞凋亡概述 (43)

二、FlowJo分析凋亡数据的过程 (44)

三、凋亡数据结果分析 (45)

第七章 FlowJo软件分析细胞周期样本 (47)

一、细胞周期分析概述 (47)

二、FlowJo分析细胞周期数据的过程 (48)

三、细胞周期拟合的调整方法和步骤 (51)

四、细胞周期结果分析 (53)

第一章 FlowJo简介

FlowJo是美国斯坦福大学Leonard Herzenberg（FACS机器的发明者）实验室在90年代研发的一款流式数据分析软件。FlowJo由于功能强大，简单易用，已经被领域内的科学家、实验室广泛引用；同时FlowJo也是各高影响力核心期刊引用最多的流式数据分析软件。

一、FlowJo对电脑配置的要求

1. PC电脑：

操作系统：Windows XP，Vista，Windows7

内存：512MB及以上

网络连接：使用试用序列号及联网序列号必需要有网络连接；

加密狗无需网络

2. 苹果电脑：

操作系统：OSX10.3或者更高版本

内存：512MB及以上

网络连接：使用试用序列号及联网序列号必需要有网络连接加；

密狗无需网络

二、FlowJo的安装过程(Windows)

?请到我们的网站上下载最新版本：

https://www.wendangku.net/doc/bb13902565.html,/content/download

在此，我们下载V7.6.5 为例

https://www.wendangku.net/doc/bb13902565.html,/sites/default/files/7.6.5_X32.exe 将文件下载到桌面之后，就可以看到FlowJo安装程序图标。

?双击FlowJo安装程序

?屏幕上出现解压进程窗口：

?解压完成后出现安装窗口：

?选择“NEXT”

?选择“NEXT”

?选择“NEXT”

?选择“Install”软件自动安装。

?软件安装完成后显示

?选择“Done”进入软件版权信息窗口

?根据不同软件的授权方法，进行以下操作：

a.购买的加密狗：先在电脑上插入加密狗（Dongle），然后启动FlowJo。

b.购买的序列号：在序列号栏输入序列号（Serial Number），然后点击Use

Serial Number按钮。

c.如果是初次试用，需要申请序列号：点击 Get Trial License按钮，在FlowJo

官方网站申请试用序列号。收到注册邮箱里的序列号之后，将试用序列号输入序列号栏，点击Use Serial Number按钮。

d.使用Demo模式：如果试用序列号已经过期，而且需要继续学习FlowJo，点

击Run in Demo Mode按钮，在Demo模式下使用FlowJo提供的Demo数据进行数据分析。

三、FlowJo的工作台

双击桌面FlowJo软件图标，进入软件工作台。

或者

软件工作台由菜单栏、常用工具栏、组空间和样本空间组成。

第二章 FlowJo分析单标样本

单标记样本数据常用的显示方式是单参数直方图。单参数直方图是一维数据用的最多的图形显示形式，既可以用于定性分析，又可以用于定量分析。横坐标可以是线性标度或对数标度，单位用“通道数”或者“道数”来表示，在流式检测中的含义是代表所检测的荧光或散射光的强度。纵坐标表示的是横坐标某一特定荧光强度的细胞数，有时也用相对百分比来表现。

一、由原始数据生成单参数直方图的过程

原始数据：手册中提到的演示数据,可以在flowjochina的网站上下载

https://www.wendangku.net/doc/bb13902565.html,/sites/default/files/demodata.rar

选择3 color comp文件夹中的Cy5PE comp.fcs进行分析演示。将此文件夹存放到桌面。

1.双击桌面FlowJo软件图标，进入软件工作台。

2.把“3 color comp”数据文件夹从桌面上拖入FlowJo。

?在组空间中单击选中“3 color comp”组，此时在样本空间里显示“3 color comp”组中的所有样本。

?在样本空间中双击“Cy5PE comp.fcs”，出现图形窗口。

图形窗口显示为二维点图。

1)X轴选择SSC（侧向散射，侧向散射的含义：它对细胞膜、细胞质和

核膜的折射更为敏感，其散射强度几乎与细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系，也就是说，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大；反之则越小）

2)Y轴选择FSC（前向散射，前向散射的含义：该值的大小与细胞的直

径近似直线关系，也就说，对于不同的细胞，细胞越大，其FSC就越大；反之则越小）

3)然后选择设门工具（矩形门、椭圆门、多边形门、自动门

）中任意一个，在二维点图中选中淋巴细胞。

如下图所示: 图中用圆圈所选中区域为淋巴细胞

?在图形窗口中双击选中的淋巴细胞，生成新的图形窗口。

1)在X轴选择Cy5PE:CD4，Y轴选择Histogram，

2)选择设门工具（区域门、双分门）中任意一个，在单参数直方

图中设门。

a.双分门设门如下图所示：

左边区域为CD4阴性细胞，右边区域为CD4阳性细胞

b.区域门设门如下图所示：

左边区域为CD4阴性细胞，右边区域为CD阳性细胞

二、图形的输出和保存

a.在单参数图上点击鼠标右键选择复制图片，可以把图片粘贴到

WORD或PPT中。

b.在图形分析窗口菜单栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另

存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及保存的文件类型（SVG、

PNG、EMF、JPG）。

c.在FlowJo工作台单击打开布局编辑器。

d.在样本空间中，把淋巴细胞的节点拖入到布局编辑器中。

淋巴细胞节点如下图所示：

布局编辑器显示的单参数直方图如下图所示：

e.在布局编辑器中点击保存按钮，在弹出的对话框中选择保存的

路径，更改保存的图片名称以及图片格式。

备注：

①可以在图片名称后面直接输入需要保存的格式，比如命名并保存

为：data001.JPG。可以保存的图片格式有：JPG, PNG, GIF, EMF, SVG, PDF。

② FlowJo默认的图片格式为PNG格式

f.更改布局编辑器输出的默认图片格式的步骤：

①到工作台的菜单栏中点击“编辑”菜单，在下拉列表中选择“偏好设

置”，在偏好设置对话框中选择“文件格式”

②点击在布局编辑器项目下拉按钮，选择需要的图片格式：

第三章 FlowJo分析多色标记样本

多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。多色标记样本分析的原则是把多色标记简化为单标记或双标记。多色标记样本在采集或数据处理过程中需要做荧光补偿。在FlowJo中的数据显示方式是二维点图。二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上的每一个点表示具有相应坐标值的细胞。一般来说可以由一个二维点图得到两个一维直方图，但是由于多个细胞具有相同二维坐标现象的存在，所以二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。二维点图在设十字门之后被分成四个区域，实验目的不同，各个区域所代表的含义不同。本手册提供参考的是三标记样本的分析步骤。只要灵活掌握分析技巧，根据实验需求学会把多色分析简化，这样就可以做到事半功倍的效果。

一、由原始数据生成二维点图的过程

原始数据：为FlowJo演示数据，选择3-color-experiment文件夹中的931115-

B02-Sample01.FCS进行分析演示。

1.打开软件，将“3-color-experiment”文件夹拖入FlowJo工作台。

2.在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形窗口，显示

为二维点图。X轴选择FSC，Y轴选择SSC。然后选择多边形设门工具，在二维点图中选中淋巴细胞。如下图所示：

3.双击淋巴细胞门，出现图形窗口，X轴选择Fluor::CD3，Y轴选择FSC。使

用矩形设门工具选中CD3阳性细胞，设门并命名为T细胞

4.双击T细胞门，出现图形窗口，在X轴选择Cy5PE::CD4，Y轴选择

PhyEry::CD8，使用十字门工具设门，如下图所示：

Q1：CD8单阳性细胞，为CD8+ T细胞

Q2：双阳性细胞

Q3：CD4单阳性细胞，为CD4+ T细胞

Q4：双阴性细胞

四分门更改门位置的方法：

单击四分门“十字”的交点选中这个四分门，如下图所示。拖动鼠标将四分门移到目标位置。

二、二维点图的设门原则

二维点图常用四分门来设门，四分门设门要根据阴性对照界定阴性区。根据细胞分群的趋势，四分门的界定线可设在阴性、阳性细胞的分群处。

三、多色标记分析说明

多色样本分析在实验中具有重要的地位，很多用户对多色分析感觉无从下手。其实，流式分析中结果的显示一般都是一维和二维的。因此，在流式分析中无论是几色标记的样本，只要把多色的分析简化为单标记和双标记的分析，问题就会迎刃而解。

比如：检测TREG需要标记CD4/CD25/FOXP3，可以用SSC vs. CD4的二维点图，把CD4+的细胞圈出来。然后用CD25 vs. FOXP3的二维点图，把

CD25+/FOXP3+的细胞表示出来。这样就可以把CD4+/CD25+/FOXP3+的TREG细胞辨别出来。上面的实例就是把三标记的样本转化为两个二维的点图进行分析。