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3.发酵生产谷氨酰胺转胺酶的摇瓶条件

3.发酵生产谷氨酰胺转胺酶的摇瓶条件
3.发酵生产谷氨酰胺转胺酶的摇瓶条件

 第18卷第3期

1999年9月

无锡轻工大学学报

Journal of Wuxi University of Light Industry

Vol.18,No.3 

 Sep.,1999

收稿日期:1998-11-15;修订日期:1999-05-21

作者简介:郑美英(1970年11月生),女,江苏泰州人,博士研究生.

 文章编号:1001-7453(1999)03-0037-05

发酵生产谷氨酰胺转胺酶的摇瓶条件

郑美英,堵国成,陈 坚

(无锡轻工大学生物工程学院,江苏无锡214036)

摘要:在摇瓶条件下,以淀粉为碳源,蛋白胨及酵母膏为氮源,对S trep tov er ticillium

mobar aens e生产谷氨酰胺转胺酶(M T G)的摇瓶发酵条件进行了探索.研究结果表明,发酵法

生产谷氨酰转胺酶的适宜初始pH值、淀粉质量浓度、接种量分别为6.1,2g/dL,10%;M T G

酶活最高可达1.83umol/(min m L).初始加入硫酸铵对菌体生长影响不大,但对M T G的合

成却产生抑制作用;初始加入纯氨基酸及胱氨酸母液不利于M T G酶活的提高.

关 键 词:茂原链轮丝菌;谷氨酰胺转胺酶;摇瓶发酵

中图分类号:T Q920.1 文献标识码:A

微生物谷氨酰胺转胺酶(m icrobial transg lutaminase,EC2.3.2.13,简称MT G)由于能催化许多食品中蛋白质的交联反应,改善各种蛋白质的功能性质,因而在食品工业领域具有广泛的应用潜力[1],引起了人们的极大兴趣.目前,商业化的谷氨酰胺转胺酶主要从动物组织中获取[2],但其价格昂贵.20世纪80年代末,Ando和M otoki等人首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶[3,4],其中Ando等人从筛选的5000多菌株中发现Strep toverticillium mobaraense等能够生产这种酶.近年来,国外加快了微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究,并使之应用于食品工业.国内有关这方面的研究目前尚未见报道.

作者以Strep tov erticillium mobaraense为出发菌株,以提高酶活为研究目标,对MT G 的摇瓶发酵条件,包括pH值、初始淀粉质量浓度、接种量等进行了研究,并对氨基酸的影响及发酵过程进行分析.

1 材料与方法

1.1 菌种

茂原链轮丝菌(Str ep tov erticillium mobaraense)WSH-Z2(本研究室保藏号)

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基 麦汁(10B0),琼脂(2g/dL);pH7.0.

1.2.2 氨基酸液 见文献[5].

1.2.3 胱氨酸母液中氨基酸含量 用氨基酸分析仪测得(g/L):天冬氨酸(Asp)1.54,苏氨

酸(Thr)2.26,丝氨酸(Ser)4.23,谷氨酸(Glu)1.60,甘氨酸(Gly)3.69,丙氨酸(Ala)4.05,缬氨酸(Val)2.05,甲硫氨酸(M et)1.46,异亮氨酸(Ile)1.62,亮氨酸(Leu)4.91,酪氨酸(T yr)1.64,苯丙氨酸(Phe)2.32,赖氨酸(Lys)2.21,组氨酸(His)1.45,精氨酸(Arg)4.06,脯氨酸(Pro)2.62.

1.2.4 种子培养基 组成(g/L):淀粉20,蛋白胨20,酵母膏2,硫酸镁1;磷酸二氢钾1;pH 7.0.

1.2.5 发酵培养基 同种子培养基.

1.3 培养方法

摇瓶培养:接一环生长良好的斜面培养物至装有75m L种子培养基的500mL容积三角瓶中培养,摇瓶转速200r/min,温度30℃.培养40h后,按10%的接种量接入发酵瓶中,500 mL的三角瓶装液量为50m L,摇瓶转速200r/m in,温度30℃.

1.4 分析方法

1.4.1 菌体细胞生长量测定 取发酵液5mL,6000r/min离心5min,蒸馏水水洗2次,105℃干燥至衡重后称重.

1.4.2 MT G酶活性测定 比色法[6].

1.4.3 残糖测定 改进蒽酮法[7].

1.4.4 氨基酸测定 氨基酸分析仪测定.

2 结果与讨论

2.1 M TG合成的摇瓶发酵条件

2.1.1 种子培养 为了获得数量较多、活力强盛的菌体细胞以缩短发酵延滞期,在发酵前期对种子进行预培养,以提高生产强度,获得生产菌生长优势,减少杂菌污染的可能性.适宜的种龄应是菌体处于生长的旺盛期,这时将种子培养物接入发酵液,可使细胞活力较高,又可在同等接种量的情况下获得较多的细胞数目.

笔者考察了茂原链轮丝菌WSH-Z2在加入和不加入氨基酸情况下的生长情况,从图1中可以看出,培养基中未加入纯氨基酸和胱氨酸母液的种子在20h后生长速率明显高于培养基中加入纯氨基酸或胱氨酸母液的种子,在44h后菌体干重(DCW)开始下降.显微镜观察培养30~44h后的种子发现,这时种子菌丝呈网状,且菌丝粗壮,细胞处于生长旺盛期.所以,以后的研究均取培养30~44h后的种子进行发酵.

图1 茂原链轮丝菌WSH-Z2的菌丝生长曲线 图2 M T G摇瓶发酵过程曲线

2.1.2 pH值对菌体生长和MT G合成的影响 通过采用不同初始pH值的培养基,比较

其对菌体生长和M T G合成的影响,结果见表1.在pH值6.1~7.3范围内,菌体生长和产物的合成均受pH值的影响,并且在自然pH值6.1时,细胞干重和M T G的酶活达到了最大值.由此可见,在上罐发酵过程中应控制较佳的pH

表1 pH对菌体生长和M T G酶活的影响

pH值DCW/(g/L)残糖/%酶活/ mol/(min mL) 6.114.60.24 1.86

6.311.30.15 1.47

6.512.00.19 1.55

6.711.60.18 1.50

7.012.30.20 1.60

7.311.00.17 1.43

值,使DCW和MT G的酶活都达到较高水平.

2.1.3 接种量对菌体生长和M TG合成的影响 接种量对菌体生长和M TG合成的影响见表2.随着接种量的增大,菌体生长量和M TG酶活均增加,残糖变化并不显著.当接种量

表2 接种量对菌体生长和M T G酶活的影响

接种量/%DC W/(g/L)残糖/%酶活/( mol/(m in mL)) 710.20.250.82

1011.60.18 1.54

1312.00.17 1.59

1612.80.15 1.66

2013.30.13 1.78从7%增大到10%,酶活增加近一倍;但当接种量从10%增大到20%,酶活及菌体干重增加并不显著.在实际上罐发酵时,过高的接种量,使实际操作较为困难,也增加了染菌的可能性,并且对设备的要求

更高.接种量过低,DCW和M TG酶活均较低,因此从表2可以看出,在实际上罐发酵时,较适宜的接种量为10%左右.

2.1.4 淀粉初始质量浓度对菌体生长及M TG酶活的影响 在未添加氨基酸液的条件下,比较了摇瓶发酵中不同初始淀粉质量浓度对MT G酶活的影响,从表3可见,初始淀粉质量

浓度为1g/dL时,DCW和M TG 酶活均较低.随着淀粉质量浓度的增高,DCW增加到12.3g/L后逐渐降低,M T G酶活达到1.65 mol/(m in mL)后也逐渐降低.由此说明过高的淀粉质量浓度,对菌体生长产生了一定的抑制作用,

表3 初始淀粉质量浓度对菌体生长和M T G酶活的影响淀粉/(g/dL)DCW/(g/L)酶活/( mol/(min mL))残糖/%

1 6.20.80

212.3 1.650.19

311.9 1.58 1.23

410.8 1.23 2.14

510.00.98 3.17

69.30.75 4.30

也不利于M T G的合成,故淀粉质量浓度以2g/dL较为适宜.

2.1.5 硫酸铵初始质量浓度对菌体生长及M T G酶活的影响 以淀粉为碳源,硫酸铵为无

机氮源,比较了不同起始硫酸铵质量浓度对菌体生长和MT G合成的影响,从表4可以看出,在发酵初始加入硫酸铵,细胞的生长量并未增加,但M TG的合成受到抑制,并且随着加入硫酸铵质量浓度的增加, M TG的酶活逐步下降;在发酵初

表4 初始碳酸铵质量浓度对M T G酶活的影响

硫酸铵/(g/dL)DCW/(g/L)残糖/%酶活/( mol/(min m L)) 012.30.31 1.60

0.212.60.1310.82

0.313.40.125 1.03

0.412.80.150 1.29

0.513.30.1370.93

0.612.90.1600.60

始未加入硫酸铵,酶活明显高于其它加入硫酸铵的发酵结果,达到1.60 mol/(min mL). 2.2 氨基酸对菌体生长及M TG酶活的影响

M TG是由331个氨基酸残基构成的单多肽链,各氨基酸组成见文献[8],其中Asp, Glu,Ser,Pro等8种氨基酸的序列达到20个以上,T hr,Gln,Val等7种氨基酸的序列在10~

20之间,剩下5种氨基酸的在10个以下,可见氨基酸在M T G的合成过程中起着重要的作用.因此为了确定在摇瓶过程中补加氨基酸能否提高酶活,作者采用了文献[5]报道的外加入纯氨基酸溶液以及富含氨基酸的胱氨酸母液的发酵培养基进行摇瓶培养.结果如表5所示.

从表5可以看出,发酵培养基中未添加氨基酸液时,M TG酶活高于添加氨基酸液或胱氨酸母液的情况,达到1.65 mol/(min mL),DCW亦最高,达12.5g/L.其中原因之一是表5 氨基酸对菌体生长及M T G酶活的影响

氮 源酶活/( mol/(m in mL))DCW/(g/L)

未添加氨基酸 1.6512.5

纯氨基酸液0.9912.0

胱氨酸母液 1%

2%

3%

0.46

0.57

0.38

7.3

8.7

7.1

在发酵最后阶段,发酵液中除了Ser、

M et外,其它游离氨基酸量均较少,如

表6、表7所示,尽管添加了一定组成的

氨基酸,但发酵液中T hr、Glu、Pro等

在M TG序列中占有重要比例的氨基

酸仍然缺乏;对胱氨酸母液,由于缺

乏T rp,表6、表7显示36h后也无Trp,而T rp在M TG中占有重要的比例,正是由于某些氨基酸的缺乏,阻碍了微生物的生长和M TG的合成.原因之二是由于M TG的交联性质,添加的游离氨基酸与蛋白质及水解蛋白质和多肽的酶之间发生交联的机会增多,所以阻碍了微生物对这些蛋白质的进一步利用,并且水解蛋白质及多肽的酶被交联后,不能继续将蛋白质和多肽水解成游离氨基酸(从表6、表7可以看出,发酵液中结合氨基酸较多,游离氨基酸较少,菌体不能利用这些结合氨基酸),所以添加了游离氨基酸后,菌体原有对蛋白质及多肽的利用率降低,影响了微生物的生长,阻碍了M TG的合成,所以酶活较低.

表6 摇瓶发酵过程结合氨基酸质量浓度的变化

(mg/L)

氨基酸

发酵时间/h 0122436486072

As p1306114312641294128412651273 T hr620530464450423403410 S er565406416457389417480 Glu2614204419401550135112501278 Gly1290111211151071965872885 Ala1258-776738649591604 Val751567439420380335331 M et464381275208171167179 Ile556427312303274239234 Leu1142778423399339314323 Tyr402341283139137132134 Ph e525425340223201180180 Lys1121932702629576526522 His273218178167152150157 Arg842407395350322300313 Pro822630656641572518538 Cys-976267737174

2.3 M TG合成的发酵过程曲线分析

表7 摇瓶发酵过程游离氨基酸质量浓度的变化

(mg/L)

氨基酸

发酵时间/h

0122436486072 Asp3678891920 T hr61551252--Ser66373724202528 Glu78--5---Gly392164221 A la16131104212 V al140116281871211 M et94854720131716 Ile1168916225126 Leu3202063394-5 T yr142135991191211 Phe137********--Lys1901644212667 His20165191--T rp25211518---Arg207301341-1 Pr o22388698 Cys--1218263637

为了对M TG摇瓶过程中基质的消耗、菌体的生长、产物的形成等各参数的变化进行较全面了解,以便对发酵过程进行较好的分析,实验时在摇瓶过程中不断取样,得到发酵过程曲线,见图2,氨基酸的变化情况见表6、表7.可以看出:1)在发酵前期(0~24h),淀粉质量浓度降低较快,菌体生长迅速,细胞合成需要大量的氨基酸,结合氨基酸质量浓度降低较快,氨基酸消耗的速度也很快(用于菌体的生长),因此游离氨基酸的质量浓度降低较快,M T G酶

活很低.2)第二阶段(24~48h),菌体生长速度趋于缓慢,淀粉质量浓度继续降低;此阶段大量进行MT G的合成,故M T G酶活增加迅速.3)第三阶段(48~60h),菌体生长停止,酶活继续增高但增加缓慢,至60h达到最大值1.83 mo l/(m in mL),发酵液中游离氨基酸、结合氨基酸以及淀粉消耗基本保持不变.4)第四阶段(60~72h),菌体生长量稍微降低,和前一阶段比较,MT G酶活不再增加,并有所降低,发酵结束.

参考文献:

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Shaking-Flask Conditions for the Production of Microbial Transglutaminase with Streptoverticillium morbaraense

ZHENG M ei-ying,DU Guo-cheng,CHEN Jian

(Scho ol of bio techno lo gy,W uxi U niver sity of L ig ht Industr y,Jiangsu Wux i214036)

Abstract:The conditions of shaking-flask cultur e for the M T G productio n w ere inv estig ated w ith Str ep tov erticillium mor baraense w ith star ch as car bon source,peptone and yeast ex tract as nitrg on so urce.The results indicated that the pr oper pH,the initial starch concentration and the size o f inoculum w ere6.05,2%,and10%respectiv ely.The effect of the initial concentr ation of am mom ium sulfate o n cell dry w eight w as not obvious, but the additio n of ammo nium sulfate inhibited the productio n of M TG.T he initial addition of free am ino acids and liquids of cy stamine had a bad effect on the pr oduction of M T G. The highest enayme activ ity reached1.83 mol/(min mL).

Key words:S trep tover ticillium mor baraense;tr ansglutam inase;shake-flask culture.

谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)试剂盒说明书

货号: QS1807 规格:50管/24样谷胺酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: GS(EC6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。 测定原理: GS在ATP和Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下与铁形成红色的络合物;该络合物在540nm处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。 自备实验用品及仪器: 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制: 提取液:30mL×1瓶,4℃保存。 试剂一:10mL×1瓶,-20℃保存。 试剂二:10mL×1瓶,-20℃保存。 试剂三:粉剂×2瓶,-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂四:10mL×1瓶,4℃避光保存。 样本测定的准备: 1、细菌、细胞或组织样品的制备: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 2、血清(浆)样品:直接检测。 测定步骤: 1、分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。 第1页,共2页

TG谷氨酰胺转胺酶性质及其在肉制品中的应用说明

谷氨酰胺转胺酶性质及其在肉制品中的应用说明 一、谷氨酰胺转胺酶(TGase )介绍 谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase ,简称TG 、TGase 、mTG 等),又称转谷氨酰胺酶,是一种酰基转移酶,能够促进蛋白质分子内交联、蛋白质分子间交联以及蛋白质和氨基酸之间的交联。TGase 能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应,形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键,改善蛋白质的功能性质,可以有效地提高蛋白性食品的弹性、持水能力、原料利用率、质地口感及营养价值等,现已广泛应用于肉制品、乳制品、鱼制品、面制品、豆制品等。 谷氨酰胺转胺酶广泛存在于自然界中,早期TGase 是从动物肝脏中提取,成本较高,应用受到限制。本公司采用现代生物工程发酵技术,利用微生物法发酵生产并精制提取而成,具有酶活高、催化效率高等特点。1.1TGase 的结构: 1.2TGase 的催化机理 TGase 利用肽链上的谷氨酰胺残基上的甲酰胺基为乙酰基供体,受体可以是蛋白质上的或游离氨基酸上的胺基、伯胺基、水。TGase 既可以催化蛋白分子间的交联,又可以催化分子内的交联反应。TGase 催化的主要反应 如下: 注: a 酰基转移反应 b 蛋白质Gln 残基和Lys 残基之间的交联反应 c 脱氨基化反应二、谷氨酰胺转胺酶(TGase )酶学性质 1.最适pH 2.pH 稳定性 活性中 心

*谷氨酰胺转胺酶在pH 5-8的范围内具有很高的活性,最适pH 为6-7,在一般的食品加工过程中不会发生酶失活问题。*谷氨酰胺转胺酶在pH 值5-8的范围内具有很好的稳定性,当pH 低于5时,酶活迅速降低,当pH 高于8小于9时,酶活下降缓慢。3.最适温度 *谷氨酰胺转胺酶可在5℃-60℃的温度条件下发挥作用,最佳使用温度为50℃,在45℃-55℃范围内均具有较好的活性。 4.温度稳定性 *谷氨酰胺转胺酶在温度低于40℃时保持稳定,50℃以上酶活稍有下降,当温度高于75℃时酶失去活性。 5.反应温度和时间关系 *在温度不高于最适温度50℃情况下,反应时间随反应温度的升高而降低。(不同温度下的反应时间均在pH6.0条件下测定) 6.香肠内部温度和失活时间关系 温度(℃) 时间652h 以上7015min 之内755min 之内80 1min 之内 *对直径为3cm 的香肠,酶失活所需要的加热时间,每根香肠达到指定温度用冰水迅速冷却。由上表检测结果可见,酶失活所需要的时间取决于内部中心的温度,内部温度越高,失活也越快。 三、谷氨酰胺转胺酶(TGase )的使用方法 掌握正确的TG 使用方法,对于TG 的作用发挥具有重要作用,根据TG 在催化蛋白质反应中的规律及TG 的酶学性质,谷氨酰胺转胺酶的使用方法主要有以下三种:1..溶液法 把1份谷氨酰胺转胺酶(TG )放入3~3.5倍的水中溶解后,将水溶液加到肉中、充分搅拌、装模成型,经过一段时间的酶反应,使肉块粘在一起,本品一旦与水溶解后,必须在20-30分钟内与肉块搅拌并成型。2.和盐水一起加入 肉制品能快速吸收盐水,谷氨酰胺转胺酶(TG )可先放到盐水溶液中,然后一起加入肉制品中,进行浸泡,充分混合,并在20-30分钟内成型。3.涂粉法 对于浸泡过的或已加入溶液的肉制品,谷氨酰胺转胺酶(TG )可以直接以干粉形态加入。加入时,必须搅拌或翻转,使所有肉制品表面涂粉均匀,加入至涂粉成型必须在20-30分钟内完成。四、谷氨酰胺转胺酶(TGase )的应用举例1.谷氨酰胺转胺酶(TG )在肉产品中的应用 谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰醛转移反应的酶,它能够通过形成蛋白质分子间共价键,催化蛋白质分子聚合和交联。TG 以肉制品蛋白质肽链上的谷氨酰胺残基中的甲肽氨基为供体,赖氨酸残基中的氨基为受体,催化转氨基反应,从而使蛋白质分子内或分子间发生交联。 TG 具有pH 稳定性好,热稳定性高,粘合性极强等特性,形成的共价键在非酶催化条件下(如冷冻、切片、烹饪)很难断裂,使用安全。

实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定

实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]: 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示,即以-1-1ug.g.h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单,适合快速、多组测定。离体法复杂,但重复性较好。 [试剂] 1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml,然后再吸取5ml定容至1000ml,即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 242242 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml; -13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL); (0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中,4 贮于棕色瓶中; -1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33 液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO,0.0570g 24.2

植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定

实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定 【原理】 谷氨酰胺合成酶(GS )是植物体内氨同化的关键酶之一,在A TP 和Mg 2+存在下,它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中,谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物,该络合物在540nm 处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示,单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示,单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。 【仪器与用具】 冷冻离心机;分光光度计;天平;研钵;恒温水浴;剪刀;移液管(2ml 、1ml )。 【试剂】 提取缓冲液: 0.05mol/L Tris-HCl ,pH8.0,内含2mmol/L Mg 2+ ,2mmol/L DTT ,0.4mol/L 蔗糖。称取Tris (三羟甲基氨基甲烷)1.5295g ,0.1245g MgSO 4·7H 2O ,0.1543g DTT (二硫苏糖醇)和34.25g 蔗糖,去离子水溶解后,用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0,最后定容至250ml ; 反应混合液A (0.1mol/L Tris-HCl 缓冲,pH7.4): 内含80mmol/L Mg 2+ ,20mmol/L 谷氨酸钠盐,20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ,称取 3.0590g Tris ,4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐,0.6057g 半胱氨酸,0.1920gEGTA ,去离子水溶解后,用0.1mol/L HCl 调至pH7.4,定容至250ml ; 反应混合液B (含盐酸羟胺,pH7.4): 反应混合液A 的成分再加入80mol/L 盐酸羟胺,pH7.4; 显色剂(0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液): 3.3176g TCA (三氯乙酸),10.1021g FeCl 3·6H 2O ,去离子水溶解后,加5ml 浓盐酸,定容至100ml ; 40mmol/L A TP 溶液:0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中(临用前配制)。 【方法】 1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中,加3ml 提取缓冲液,置冰浴上研磨匀浆,转移于离心管中,4℃下15,000g 离心20min ,上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml 反应混合液B ,加入0.7ml 粗酶液和0.7ml A TP 溶液,混匀,于37℃下保温半小时,加入显色剂1ml ,摇匀并放置片刻后,于5,000g 下离心10min ,取上清液测定540nm 处的吸光值,以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml ,用水定容至100ml ,取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质(见实验28)。 4.原始数据记载 5.结果计算: GS 活力(A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1)=t V P A ?? 式中 A —540nm 处的吸光值; P —粗酶液中可溶性蛋白含量(mg/ml ); V —反应体系中加入的粗酶液体积(ml ); T —反应时间(h )。

转谷氨酰胺酶

人转谷氨酰胺酶2C多肽(TGM2)酶联免疫分析试剂盒 使用说明书 本试剂盒仅供体外研究使用! 预期应用 ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中TGM2含量。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗TGM2抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗TGM2抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TGM2呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板:一块(96孔) 2.标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10ng/ml,做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后,分别稀释成10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,0.625ng/ml,0.312 ng/ml,0.156ng/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0ng/ml,临用前15分钟内配制。如配制5ng/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml)10ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。 3.样品稀释液:1×20ml。 4.检测稀释液A:1×10ml。 5.检测稀释液B:1×10ml。 6.检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A1:100稀释,稀释前根据预先计算

好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。 7.检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。 8.底物溶液:1×10ml/瓶。 9.浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10.终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 11.覆膜:5张 12.使用说明书:1份 自备物品 1.酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热) 2.微量加液器及吸头,EP管 3.蒸馏水或去离子水,全新滤纸 标本的采集及保存 1.血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 2.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2-8°C1000x g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 3.其它生物标本:请1000x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 4.样本处理:血清或血浆标本推荐稀释10倍,如:稀释10倍,取100uL血清或血浆加入900uL 样品稀释液。标本使用0.1M的PBS稀释(PH=7.0-7.2)。 注:以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存,-20℃不应超过1个月,-80℃不应超过2个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

谷氨酰胺合成酶活性的测定

谷氨酰胺合成酶活性的测定 一.试剂 (1)酶提取缓冲液(0.05mol/L Tris- HCl,pH 8.0;内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖) 称取 Tris[三(羟甲基)氨基甲烷]1.5295 g,MgSO4·7H2O 0.1245g,DTT(二硫苏糖醇)0.1543 g和蔗糖34.23 g,去离子水溶解后,用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0,最后定容至250 mL。 (2)酶反应液 1.对照反应液A(0.1mol/L Tris- HCl缓冲液,pH 7.4;内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2)称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2,分别用去离子水浴解后,用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4,定容至100mL。 2.完全反应液B(含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液) 除了反应混合液A的成分外,再添加80mmol/L盐酸羟胺(每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺)。 (3)显色剂(0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液) 称取3.3176 g TCA(三氯乙酸)和10.1021 g FeCl3·6H20,用去离子水溶解后,加5mL浓盐酸,定容至100mL。 (4)40mmol/L ATP溶液

称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中(临用前配制)。 二.实验步骤 (1)粗酶液的提取 取10mL藻液,在4500r/min离心15分钟,去掉上清液,加5mL酶提取液,超声波破碎10min,4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液 (2)GS活性的测定 取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中,加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液,混匀,于37℃下保温0.5 h,加入1mL显色剂终止反应,摇匀,室温下放置5min后,于3500r/min下离心10min,取上清液于540nm下测定吸光度,以加入1.0mL对照反应液A的为对照。三.结果处理及计算 GS活性[A540/(g·h)]= A540为540nm处的吸光度; m 为样品质量(g); Vt为粗酶液总体积(mL); Vs为反应体系中加入的粗酶液体积(mL); t 为反应时间(h)。

转谷氨酰胺酶在肉制品中的应用研究

转谷氨酰胺酶在肉制品中的应用研究 转谷氨酰胺酶学名谷氨酰胺转胺酶,是一种非常优良的蛋白质改良剂,能够催化蛋白质分子内、分子间连接交联,蛋白质和氨基酸之间的连接以蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解,同时改善蛋白质的功能和性质。我国肉类总产量位居全球第一,但肉制品量只占总量的6%,从发达国家的肉制品量占据肉类总产量的40%~50%来看,说明我国在肉类加工领域肉还有很大潜力,转谷氨酰胺酶作为一种优良的肉制品加工改良剂,在肉制品方面有巨大的应用潜力。 谷氨酰胺转 转谷氨酰胺酶广泛分布于自然界的生物中,转谷氨酰胺酶在豚鼠肝脏中被卡拉克人等首次发现,经过不断的研究发现微生物、植物和其他动物中也存在转谷氨酰胺酶。 动物来源哺乳动物几乎所有的组织和器官中都存在转谷氨酰胺酶。20世纪60年代到90年代,从豚鼠肝脏中提取转谷氨酰胺酶,由于来源较少,并且纯化工艺复杂,这两方面导致价格昂贵。 植物来源1987年,艾斯卡森等人发现转谷氨酰胺酶存在于豌豆中。研究者已经发现在马铃薯、菊芋、玉米等多种植物中也有转谷氨酰胺酶的存在。有研究者对大豆中提取的转谷氨酰胺酶进行深入研究,但是发现分离和纯化工艺非常复杂,酶得率也相对较低。所以迄今为止,植物来源的转谷氨酰胺酶还没有用于商业化生产。 微生物来源1989年,安腾等人首次从茂原链轮丝细菌中首次分离并且纯化得到了转谷氨酰胺酶。随后,研究人员在其他微生物中发现了转谷氨酰胺酶存在,并进行大量的微生物发酵试验、酶纯化分离试验等,取得了很大的进步。与动物来源转谷氨酰胺酶相比,微生物来源转谷氨酰胺酶属于胞外酶,它能够在培养基中直接分泌,分离和纯化相对比较容易,发酵所用的原料价格较低、生产周期短,最有前途用于大规模的工业化生产。 转谷氨酰胺酶的理化性质 不同来源的转谷氨酰胺酶其理化性质差异动物肝脏的转谷氨酰胺酶的分子量大约在70~90kDa之间,需要通过钙的离子激活来实现其功能性,酶的活性中心为半胱胺酸铵残基位点。动物来源转谷氨酰胺酶中,豚鼠肝脏的转谷氨酰胺酶研究最为深入,研究发现酶分子量大约为90KDa,使酶反应需要钙离子去激活,底物特异性较强,同时该酶含有多个半胱氨酸残基导致其热稳定性较差,50℃保持10min其酶活性仅为残留的40%。 与动物的来源相比,微生物来源的转谷氨酰胺酶具有更加优良的特性:一是具有较低的分子量,分子量在23000~45000,多数为40000左右,高度的交联催化度;二是具有更强的耐热性,来源于S.mobaraensis的转谷氨酰胺酶在40℃条件下,即使保持10min,酶仍然具有相同的活性,即使在50℃的条件下,保持10min该酶仍具有74%的活性;三是耐酸耐碱性强;四是是否存在钙离子对酶的活性影响不大,这一特性非常重要,因为绝大多数的蛋白质容易与钙离子发生化学反应,导致蛋白质沉淀;五是转谷氨酰胺酶耐高温高压,周围

乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达

乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达 刘俊红1,2,刘顺谊2,殷志敏2 (1.安徽师范大学生命科学学院,安徽芜湖241000) (2.南京师范大学生命科学学院,江苏南京210097) [摘要] 以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶(L 2谷氨酸:氨连接酶,Glutam ine Synthetase,GS EC 6131112)蛋 白表达宿主菌株BL21(DE3)(pET3C /谷氨酰胺合成酶)作为研究对象,借助S DS 2P AGE 分析方法,对于用乳糖 诱导由T7lac 启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究,分别比较了最佳诱导起始生长量、 所需乳糖的浓度、诱导持续时间、补加乳糖和氨苄青霉素及不同培养基等参数对重组产物表达的影响.实验结 果表明,对于T7lac 启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,诱导产物的 表达量、可溶性及酶活与I PTG 诱导产物基本接近.本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌谷氨酰 胺合成酶工业化生产提供了一定的参考依据. [关键词] 谷氨酰胺合成酶,原核表达,乳糖,I PTG [中图分类号]Q 78 [文献标识码]A [文章编号]100124616(2006)0320066205 Expressi on of Reco m b i n an t Glut am i n e Syn thet a se i n Escherich ia coli I nduced by Lactose L i u J unho ng 1,2,L i u S hunyi 2,Yi n Zh i m in 2 (1.College of L ife Science,Anhui Nor mal University,W uhu 241000,China ) (2.School of L ife Science,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210097,China ) Abstract:L 2Glutam ine is mainly p r oduced by fer mentati on,rarely by enzy me reacti on .Gluta m ine Syn 2 thetase gene is a mp lified fr om Bacillus Subtilis gnd cl oned int o p r okaryotic exp ressi on vect or pET3C .Af 2 ter the transf or mati on of this recombinant p las m id int o BL -21(DE3),Lact ose and I PTG (is op r opyl 2 β2D 2thi ogalact o 2pyranoside is op r opylthi o 2β2D 2galact oside )are used t o induce gene exp ressi on at 37℃re 2 s pectively .Both of the m can induce the exp ressi on of the Gluta m ine Synthetase gene efficiently .The in 2 fluences of culture conditi on such as the lact ose concentrati on,gr owth mediu m compositi on,the durati on of the inducti on and the re -additi on of lact ose on the exp ressi on of the recombinant p r otein are analyzed in detail .The inducti on efficiency of lact ose is basically the sa me as that of I PTG,which p r ovides the evi 2 dence that lact ose could be a p r om ising inducer in the future large scale p r oducti on of recombined Gluta 2 m ine Synthetase . Key words:Gluta m ine Synthetase,p r okaryotic exp ressi on,lact ose,I PTG  收稿日期:2005211228. 基金项目:国家教委留学回国人员基金(2002S WXS BJBC22)、南京师范大学人才基金(2001S WXXG QB914)资助项目. 作者简介:刘俊红,女,1970—,博士研究生,讲师,主要从事细胞生物学的学习与研究.E 2mail:liujunhong700911@yahoo https://www.wendangku.net/doc/bc14201436.html, 通讯联系人:殷志敏,1963—,教授,博士生导师,主要从事生物化学及细胞生物学的教学与研究.E 2mail:yinzhi m in@njnu .edu .cn 0 引言 L 2谷氨酰胺是一种对人体十分有益的氨基酸衍生物,它在氨基酸代谢中具有极其重要的地位,已广泛应用于营养补给、抗疲劳、胃肠道功能修复和提高人体免疫等方面,其市场需求量日渐增长. 目前国内外主要以发酵法生产L 2谷氨酰胺.近年来,酶法合成L 2谷氨酰胺已开始有少量研究[1,2],在 第29卷第3期2006年9月 南京师大学报(自然科学版)JOURNAL OF NANJ I N G NOR MAL UN I V ERSI TY (Natural Science ) Vol .29No .3Sep,2006

谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOGAT)试剂盒说明书

货号:MS1801 规格:100管/96样谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOGAT)试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: GOGAT广泛分布于植物中,和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环,参与氨同化的调控。 测定原理: GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸,形成两分子的谷氨酸;同时NADH氧化生成NAD+,340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。 自备实验用品及仪器: 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制: 提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存; 试剂一:液体20mL×1瓶,4℃保存; 试剂二:粉剂×2瓶,4℃保存; 粗酶液提取: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 测定步骤: 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。 2、样本测定 (1)在试剂二中加入9mL试剂一充分溶解混匀,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;现配现用(配好后3h内用完); (2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL试剂二,混匀,立即记录340nm 处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。 GOGAT活性计算: a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1)按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GOGAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr (2)按样本鲜重计算: 单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 第1页,共2页

谷氨酰胺合成酶活性测定

谷氨酰胺合成酶活性测定 原理谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一,在ATP 和M g 2+ 存在下,它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中,谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸,进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物,该络合物在540nm 处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示,单位μmol·mg -1 protein·h -1 。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示,单位A·mg -1 protein·h -1 。【仪器与用具】冷冻离心机;分光光度计;天平;研钵;恒温水浴;剪刀;移液管(2 ml、1ml)。【试剂】提取缓冲液:0.05mol/L Tris-HCl,pH8.0,内含2mmol/L Mg 2+ ,2mmol/L DTT,0.4 mol/L 蔗糖。称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)1.5295g,0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O,0.1543g DTT(二硫苏糖醇)和34.25g 蔗糖,去离子水溶解后,用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0,最后定容至250ml;反应混合液A(0.1mol/L Tris-HCl 缓冲,pH7.4):内含80mmol/L Mg 2+ ,20mmol/L 谷氨酸钠盐,20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA,称取3.0590g Tris,4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐,0.6057g 半胱氨酸,0.1920gEGTA,去离子水溶解后,用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4,定容至250ml;反应混合液B(含盐酸羟胺,pH7.4):反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺,pH7.4;显色剂(0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液):3.3176g TCA(三氯乙酸),10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O,去离子水溶解后,加5ml 浓盐酸,定容至100ml;40mmol/L ATP 溶液:0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中(临用前配制)。【方法】1.粗酶液提取称取植物材料1g 于研钵中,加3ml 提取缓冲液,置冰浴上研磨匀浆,转移于离心管中,4℃下15,000g 离心20min,上清液即为粗酶液。2.反应 1.6ml 反应混合液B,加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液,混匀,于37℃下保温半小时,加入显色剂1ml,摇匀并放置片刻后,于5,000g 下离心10min,取上清液测定540nm 处的吸光值,以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml,用水定容至100ml,取2ml 用考马斯亮蓝G-250 测定可溶性蛋白质(见实验28)。 4.原始数据记载 5.结果计算:GS 活力(A·mg -1 protein·h -1 )=式中A—540nm 处的吸光值;P—粗酶液中可溶性蛋白含量(mg/ml);V—反应体系中加入的粗酶液体积(ml);T—反应时间(h)。

植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定

植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定 一、实验原理 谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一,在ATP和Mg2+存在下,它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中,谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物,该络合物在540nm处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示,单位μmol·mg﹣1protein·h ﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示,单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。 二、仪器与用具 冷冻离心机;分光光度计;天平;研钵;恒温水浴;剪刀;移液管(2ml、1ml)。 三、试剂 1、提取缓冲液:0.05mol/LTris-HCl,pH8.0,内含2mmol/LMg2+,2mmol/L DTT, 0.4mol/L蔗糖。称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)1.5295g,0.1245g MgSO 4·7H 2 O, 0.1543g DTT(二硫苏糖醇)和34.25g蔗糖,去离子水溶解后,用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0,最后定容至250ml; 2、反应混合液A(0.1mol/L Tris-HCl缓冲,pH7.4):内含80mmol/L Mg2+,20mmol/L 谷氨酸钠盐,20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA,称取3.0590g Tris,4.9795 gMgSO 4·7H 2 O, 0.8628g谷氨酸钠盐,0.6057g半胱氨酸,0.1920gEGTA,去离子 水溶解后,用0.1mol/L HCl调至pH7.4,定容至250ml; 3、反应混合液B(含盐酸羟胺,pH7.4):反应混合液A的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺,pH7.4; 4、显色剂(0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl混合液):3.3176g TCA(三氯乙酸),10.1021g FeCl 3·6H 2 O,去离子水溶解后,加5ml浓盐酸,定 容至100ml; 5、40mmol/L ATP溶液:0.1210g ATP溶于5ml去离子水中(临用前配制)。

谷氨酰胺转氨酶在面粉加工中的应用

谷氨酰胺转氨酶在烘培食品加工中的作用 导读:烘焙食品由于其营养、美味、方便、实惠而深受人们的喜爱。但是由于我国面包专用粉的质量稳定性差以及面包制作过程中机械搅拌力的破坏,导致面筋的筋力不足,从而影响面包品质。使用面包改良剂是提高面包品质的一个重要手段。酶制剂作为天然来源的面包改良剂,越来越受到青睐。 什么是谷氨酰胺转胺酶 谷氨酰胺转胺酶(简称TGase)是一种催化酰基转移反应的转移酶,它能够促使蛋白质分子内交联、分子间交联以及蛋白质和氨基酸之间交联。可以在很大程度上改善蛋白质的功能性质。 谷氨酰胺转胺酶作用 1添加TGase后,小麦粉的吸水率略有提高。这是由于TGase具有很高的亲水性,使得面团的吸水率有所增加。面团的形成时间和稳定时间有所提高。稳定时间越长,韧性越好,面筋的强度越大,面团的加工性质越好。 2添加TGase后,小麦粉的弱化度显著减小。弱化度表明面团的耐破坏程度,也就是对机械搅拌的承受能力,弱化度越大,表明该小麦粉的面筋越弱,面团越容易流变,成品不易成型,且易塌陷。弱化度减小,面筋网络结构和耐机械搅拌能力得到增强,小麦粉的粉质特性得到改善。 3添加TGase后,使得蛋白质分子间和分子内的交联作用得到加强,从而增强了面筋的网络结构和面团的稳定性。同时面包的体积和比容均有所增大。 4添加TGase后,面包的持水性得到提高。水分的保持有效抑制了淀粉的老化,面包的硬度有所减小,面包的弹性明显增大。贮藏过程中老化焓值减小,有效抑制了面包的老化,延长了面包的货架期。 小提示 食品酶制剂以其高效、安全等优点广泛应用于面包生产中。小麦粉中加入适量的谷氨酰胺转氨酶,可改善面团的粉质特性、拉伸特性和流变学特性,增大面包的体积和比容,提高了面包的持水性,改善面包质构,抑制了淀粉的老化,有效延长了面包的货架期。

谷氨酰胺转氨酶

谷氨酰胺转氨酶 谷氨酰胺转氨酶 英文名称:Glutamine transaminase 别名:转谷氨酰胺酶 产品说明:谷氨酰胺转胺酶(Microbialtransglutaminase ) 是一种催化蛋白质间(或内)酰基转移反应,从而导致蛋白质(或多肽) 之间发生共价交联的酶 谷氨酰胺转氨酶又称转谷氨酰胺酶(TG酶)是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质,其可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联,从而改善蛋白质的结构和功能,对蛋白质的性质如:发泡性,乳化性,乳化稳定性,热稳定性、保水性和凝胶能力等效果显著,进而改善食品的风味、口感、质地和外观等。传统肉类加工工艺通常加入大量的盐和磷酸,以提高其持水力、连贯性和质地。近期,少盐少磷酸的食物被广泛推广,但其质地和物理性质都不尽如人意。TG酶可以替代部分通常肉制品加工中添加的品质改良剂—磷酸盐,生产低盐肉制品。可应用于水产加工品、火腿、香肠、面类、豆腐等等。TG酶在40~45℃、pH6-7的条件下,只需添加0.1-0.3%的量,即可达到明显的效果。 一、什么是TG? TG是采用现代生物工程技术研制开发出的一类用于生产新型蛋白食品的食品添加剂。TG的主要功能因子为谷氨酰胺转胺酶(EC 2.3.2.13,简称TG),不同系列产品的主要区别在于作为辅料的蛋白质种类和数量不同。 TG产品的主要成分: 主要成分 TG TG 0.5% 1% 蛋白质99.5% 99% 二、TG具有哪些功能? TG的主要功能因子是谷氨酰胺转胺酶。这种酶广泛存在于人体、高级动物、植物和微生物中,能够催化蛋白质分子之间或之内的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺残基的水解。通过这些反应,可改善各种蛋白质的功能性质,如营养价值、质地结构、口感和贮存期等。 三、TG在食品加工中有哪些用途 ? 改善食品质构。它可以通过催化蛋白质分子之间发生的交联,改善蛋白质的许多重要性能。如用该酶生产重组肉时,它不仅可将碎肉粘结在一起,还可以将各种非肉蛋白交联到肉蛋白上,明显改善肉制品的口感、风味、组织结构和营养。

谷氨酰胺转氨酶的研究进展 - 资料中心 - 生物在线

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谷氨酰胺转氨酶的研究进展 作者:陶红军, 邵虎, 黄亚东, 孔令伟, TAO Hongjun, SHAO Hu, HUANG Yadong, KONG Lingwei 作者单位:陶红军,黄亚东,TAO Hongjun,HUANG Yadong(常州红梅乳业有限公司,江苏,常州,213023),邵虎,SHAO Hu(江苏食品职业技术学院,江苏,淮安,223003), 孔令伟,KONG Lingwei(淮安快 鹿牛奶有限公司,江苏,淮安,223001) 刊名: 中国酿造 英文刊名:CHINA BREWING 年,卷(期):2010(6) 参考文献(38条) 1.黄六容;何冬兰微生物谷氨酰胺酶的研究进展 2004(02) 2.王灼维;王璋土壤分离转谷氨酰胺酶生产菌株 2004(04) 3.MOTOKIM;OKIYAMA A;NONAKA M Novel transglutaminase manufacture for praparation of protein gelling compounds 1989 4.MOTOKI M;SEGURO K Transglutaminase and its use for food processing 1998 5.唐名山;王树英;陈坚Streptovcrticillinm mobaraense 谷氨酰胺转胺酶的表达、纯化和复性[期刊论文]-食品与发酵工业 2004(04) 6.鲁时瑛;岗楠迪;堵国成谷氨酰胺酶的分离纯化及酶学性质[期刊论文]-无锡轻工大学学报 2002(06) 7.崔艳华;张兰威谷氨酰胺转氨酶研究进展[期刊论文]-生物技术通报 2009(1) 8.姜燕;温其标;唐传核谷氨酰胺转移酶对食物蛋白质成膜性能的影响[期刊论文]-华南理工大学学报 2006(08) 9.丁克毅;刘军;EleanorM.Brown转谷氨酰胺酶(MTCrase)改性明胶可食件薄膜的制备[期刊论文]-食品与生物技术学报 2006(04) 10.丁克毅轻谷氨酰胺酶改性明胶高强度薄膜的制备 2006(01) 11.张春红;陈海英;车晓彦谷氨酰胺转氨酶改性谷朊粉的研究[期刊论文]-食品科学 2006(12) 12.KURAISHI C;SAKAMOTO J;YAMAZAKI K Production of restructured meat using microbial transglutaminase without salt or cooking[外文期刊] 1997(3) 13.田少君;梁华民转谷氨酰胺酶对大豆分离蛋白凝胶性的影响[期刊论文]-中国油脂 2005(08) 14.熊晓辉;王晓丽;束长丰谷氨酰胺转氨酶对内酯豆腐品质的影响[期刊论文]-食品研究与开发 2007(05) 15.田少君;梁华明转谷氨酰胺酶对大豆分离蛋白的改性研究[期刊论文]-粮油加工与食品机械 2005(06) 16.陈义华;陆兆新;尤华灰色链轮丝菌产转谷氨酰胺酶发酵条件的优化[期刊论文]-食品科学 2003(09) 17.王璋;刘新征;王亮"神舟"4号空间飞行对搭载的转谷氨酰胺酶链霉菌选育的影响[期刊论文]-航天医学与医学工程 2004(04) 18.陈国娟;张春红;刘长江谷氨酰胺酶的分离纯化及酶学性质的研究[期刊论文]-食品工业科技 2007(01) 19.LEE H G;LANIER T C;HAMANN D D Transglutaminase effects on low temperature gelation of fish protein sols[外文期刊] 1997(1) 20.ANDO H;ADACHI M;UMEDA K Purification and characteristics of a novel transglutaminase derived from microrganisms 1989 21.江波;周红霞谷氨酰胺转氨酶对大豆7S蛋白质及肌球蛋白质胶凝性质的影响[期刊论文]-无锡轻工大学学报2001(02) 22.江新业;宋钢以鱼类下脚料制备风味蛋白粉的研究[期刊论文]-中国酿造 2007(12)

实验三预习报告 硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定

实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定 一、硝酸还原酶的测定 [原理]: 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示,即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单,适合快速、多组测定。离体法复杂,但重复性较好。 [试剂] 1.亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml,然后再吸取5ml定容至1000ml,即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液;2.0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml; 3.1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中(25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL); 4.0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中,贮于棕色瓶中; 5.0.1mol.L-1KNO3溶液:2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中; 6.0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g Na2HPO4.12H2O,0.0570g KH2OP4.3H2O,溶于1 000ml去离子水中; 7.30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]; 摇匀后在25度下保温30min,然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮(ug)为横坐标(X),吸光值为纵坐标(Y)建立回归方程。 2.样品中硝酸还原酶活力测定 1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 2.称取作物叶片0.5g(共3份,剪成1cm 左右的小段(均匀),放入3只三角瓶中,其中 1份作对照,另外2份作酶活性测定用。 3.反应:先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液,然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液,混匀后立即放入干燥器中,抽气30分钟(期间几次通入空气,再 抽真空,使叶片完全沉入瓶底,后在25℃黑暗中反应0.5小时,分别向测定瓶(对照瓶除外)加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。

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