拟南芥原生质体的制备及转化

拟南芥原生质体制备转化操作流程

主要试剂

1. 纤维素酶解液：

试剂

15ml酶液体系

1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225g干粉

2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045g干粉

3．0.4M mannitol 1.09g干粉

4．20mM KCl 1 ml 0.3 M KCl母液

5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液

6．加入10ml 水

7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2

9．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）

11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。

2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）

PEG4000 ( Fluka, #81240)…………… 1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g

0.8 M Mannitol………………………….. 0.625ml…………………………2.5ml

1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml

约1.2ml

3. W5 溶液（1000ml）

154mM NaCl, NaCl 9g

125mM CaCl2, CaCl2.H2O 18.4g

5mM KCl, KCl 0.37g

2mM MES（PH 5.7），MES 0.39g

pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。

4. MMG溶液

MaMg溶液（500ml）

15mM MgCl2，MgCl 0.71g

4 mM MES(PH5.7) MES 0.39g

0.4 M mannitol，Mannitol 36.5g

用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。

5. WI溶液

WI(200ml)

0.5M mannitol，mannitol 18.217g

4mM MES,pH5.7，MES 0.156g

20mM KCl，KCl 0.12g

高温高压灭菌，室温保存。

实验步骤

1. 土培室播种种植拟南芥。

2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。

3. 剪取中部生长良好的叶片用新的剃须刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。

4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液（10ml的酶液用125ml 的三角瓶装）中（每5-10 ml 酶解液大约需10-20片叶子（小量））(100 -150 叶片需要40-60ml酶解液（大量）)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。

5. 用真空泵于黑暗中抽5-30分钟。

6. 或者将叶条至于培养皿中加入酶液放入真空干燥箱里，在黑暗中消化3个小时，此步需要根据你自己的实验经验，通常会延长孵育16-18h。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。）（此时预冷一定量W5溶液）

7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。

8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。

9. 先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。

10. 用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，如果回收率低可以提高转速或是加入CaCl2（50mM）。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体(电转化用预冷的W1)终浓度为1-2 x 105/ml。

11. 在冰上静至原生质体30分钟。(在有些实验中原生质体在使用前可以在室温终保存)

以下操作在室温23℃下进行

12. 100g离心1-3分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。

13. 加入10 ul DNA（10-20微克约5kb的质粒DNA）至2ml离心管中。

14. 加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。

15. 加入110 ul PEG/Ca溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。

16. 诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。

17. 室温下用440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。

18. 室温下用台式离心机100g离心1-3分钟然后去除上清，将原生质体轻轻吹打稀释至100ul。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。

19. 用1ml WI或者W5溶液轻柔重悬原生质体于六孔组织培养皿中。

20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。

21. 激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。（以上实验可以根据自己实验情况适当调整）

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥

拟南芥原生质体制备转化方法整理

溶液配制 1、纤维素酶解液：

2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）

3、W5 溶液 4、MM G溶液

5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。

五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行

十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。

原生质体制备

1.影响原生质体数量和活力的因素 （1）细胞壁降解酶的种类和组合 不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞，由于它们的细胞壁结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同。例如，叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶，根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶（Driselase酶），花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶，成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。 （2）渗造压稳定剂 用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释放。这种高渗液称为渗透压稳定剂。常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCI、MgSO4.7H2O）等。在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。滲透压稳定剂中，用得最多的是甘露醇，常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等；山梨醇常用于油菜原生质体制备。滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异，例如胡萝ト用0.56mol ／L甘露醇，月季用14％蔗糖，柑橘用0.8mol／L甘露醇，蚕豆用0.7mol／L甘露醇，烟草的四分体用7％熊糖，烟草的成熟花粉用13％甘露醇。 （3）质膜稳定剂 质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。如在分离烟草原生质体时，在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾，一旦洗净确液进行培养，原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。而未加葡聚糖硫酸钾的对照，原生质体经一周培养即解体。常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。 （4）pH的影响 分离原生质体时，酶液的pH是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时（＜4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。分离原生质体时，酶液的pH因植物种类不同而有差异，如胡萝ト为5.5、月季为5.5～6.0、烟草为5.4～5.8、柑橘为5.6、蚕豆为5.6～5.7。 （5）温度影响 制备生质体时，一般在26土1℃条件下酶解。 （6）植物材料的生理状态 一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行取材。采用那些颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织和由其建立的胚性悬浮细胞系，更容易获得高质量的原生质体。要得到良好的供体材料，必要时应对材料进行预处理及预培养。 2.植物原生质体的纯化 材料经过一段时间的酶解后，需要将酶解混合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片去除出去。纯化原生质体的常用方法有过滤、离心、飘浮法，在实际操作中一般联合运用这三种方法。 1）过滤法用滤网过滤酶解混合物，滤去未被酶解的细胞、细胞团及组织块 2）离心法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于离心管底部。 3）飘浮法采用比原生质体比重大的高渗溶液（如蔗糖、Ficoll溶液），使原生质体漂浮在溶液表面。

细胞原生质体的制备

细胞原生质体的制备 —植物原生质体分离和活性鉴定 一、实验目的 1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。 2.了解原生质体活性鉴定的原理。 3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程 二、实验原理 去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的 酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间

冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。 原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。 三、实验用品 1．材料：绿豆，烟草幼苗叶片，油菜或菠菜或烟草等。 2．试剂： 酶解液(绿豆)：1%(W/V) 纤维素酶，1% (W/V)果胶酶，0.7mol/L 甘露醇;10mmol/L CaCl，2.2H2O，0.7mmol/L KH2PO4，pH 6.8～ 7.0。 13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4，101.0 mg/L KNO3，

拟南芥原生质体的提取和转化

拟南芥原生质体的提取和转化 (1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于 20ml双蒸水中）；共需叶片约90片； (2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时； (3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃， 60g，离心15min； (4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min； (5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min； (6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬； 以下操作均在23℃下进行： (7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪 去前端）轻柔混匀； (8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min； (9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5； (10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀； (11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。 (1)酶解液： cellulose R10 15% Macerozyme R10 0.3% Mannitol 1.09g KCl 0.3M MES 0.3M 调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液 CaCl20.15M β-巯基乙醇0.75mM (2)PEG溶液（40%，v/v） PEG4000 1g 0.8M Mannitol 0.625ml 1M CaCl2 0.25m (3)W5溶液

水稻原生质体分离及转化

水稻原生质体分离及转化 作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11 实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验 实验材料和试剂： 生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。 溶液的配制： 母液的配制： 1、0.2 M MES(pH 5.7) 2、0.8 M Mannitol(甘露醇) 3、1 M CaCl2 4、2 M KCl 5、2 M MgCl2 6、10% BSA [Fluka PEG 4000 81240] 以下如有上述母液，则都是使用的母液 酶解液：20 mL ×2 MES 0.5

mL 1 mL Mannitol 7.5 mL 15 mL Cellucose（纤维素酶）0.15 g 0.3 g Macerozyme（离析酶）0.075 g 0.15 g ddH2O 1.8 mL 3.6 mL 55℃10 min 冷却至RT后加入200 uL CaCl2 加入200 uL 10% BSA Mmg: 20 mL ×2 MES 0.2 mL 0.4 mL Mannitol 5 mL 10 mL MgCl2 0.075 mL 0.15 mL ddH2O 4.725 mL 9.45 mL

PEG-CaCl2: 20 mL ×2 Mannitol 2.5 mL 5 mL CaCl2 1 mL 2 mL PEG4000 4 g 8 g ddH2O 3 mL 6 mL W5: 200 mL MES 2 mL NaCl 1.8 g CaCl2?2H2O 3.67525 g KCl 0.5 mL ddH2O 197.5 mL 具体实验步骤： 1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。 2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。

水稻原生质体制备及转化方法

原生质体制备及转化 1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。然后用 2.5%的次氯酸钠消毒20 min。用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。 2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。 3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。 4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。 5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中， （1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。 6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。用手充分摇晃10s。 7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。 8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。 9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清 10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清 11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体 12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的 40%的PEG4000，混匀 13.28℃避光静置转化20--25min 14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。 15.重复步骤14 16.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避 光静置培养15-20小时 17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g 离心3min，弃上清，保留100μl上清液 18.共聚焦显微镜观察拍照 配制溶液方法：

拟南芥转化 浸花法

拟南芥转化—浸花法 实验步骤： 关键记录： a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。 b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。 c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。

d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。 e.干燥成熟的果夹用小袋套住。 f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。

说明： 如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。 如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。去掉用于转化植株上的果夹。 具体步骤： 1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。 2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。 注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。 3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。 浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。混匀，转移至50ml离心管。 注意：表面活性剂浓度过高有毒害。为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。在双转化试验中我们至少要用48株植株。间隔7天进行第二次浸染植株。 小心：戴手套及口罩防止表面活性剂的毒害。 4.浸染时将农杆菌悬浮液倒满50mL离心管的小盖子，将拟南芥横放使花序浸入小盖子中的悬浮液10s，轻微晃动小盖，20ml农杆菌悬浮液至少有效用于转化30株拟南芥， 150个花序以上，这一步骤要保证能在植株上看到菌液。 注意：确定所有花盆都已浸染，有时很有必要浸染整个植株确保浸染更短更多的花芽。将过多的农杆菌液移除也很重要。否则长时间

植物组织培养 第十章 原生质体培养

第十章原生质体培养 ?教学目的与要求： ?深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以 及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 ?原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 二、原生质体研究进展 ?据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再 生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 ?1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟 了道路。2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 第二节、原生质体的制备 1、用于分离原生质体的材料准备 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞 2、酶处理 ?原生质体分离常用的商品酶 ?纤维素酶类 ?果胶酶类 ?半纤维素酶 酶溶剂及其渗透压 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ?酶浓度及酶解时间 ?酶解时间 ?酶浓度酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 ?飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。 ?P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20m o s m／k g H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

拟南芥原生质体的制备及转化

拟南芥原生质体制备转化操作流程 主要试剂 1. 纤维素酶解液： 试剂 15ml酶液体系 1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉 2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉 3．0.4M mannitol1.09g干粉 4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液 5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6．加入10ml 水 7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2 9．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存） 11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。 2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量） PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g 0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml 1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml 约1.2ml 3. W5 溶液（1000ml） 154mM NaCl, NaCl9g 125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g 5mM KCl, KCl0.37g 2mM MES（PH 5.7），MES0.39g pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 4. MMG溶液 MaMg溶液（500ml） 15mM MgCl2，MgCl0.71g 4 mM MES(PH5.7)MES0.39g 0.4 M mannitol，Mannitol36.5g 用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 5. WI溶液 WI(200ml) 0.5M mannitol，mannitol18.217g 4mM MES,pH5.7，MES0.156g

原生质体制备

原生质体的制备： 1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。 2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。 3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。 4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。 5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。 6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。 7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。 8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。 9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。 10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。 11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。 12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。 13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。 14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。 15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。 16、室温下，100×g离心2 min，去除上清液。 17、在六孔板中，每孔用1 mL WI溶液重悬浮原生质体。 18、室温下（20-25℃）孵育原生质体一段时间。 19、重悬浮，通过100×g离心2 min收获原生质体。 20、去除上清液并观察GFP成像。

PEG介导法制备拟南芥原生质体及瞬时表达方法

采用PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达法。具体方法如下： 1）在MS培养基上用无菌牙签点种拟南芥种子，萌发后待根长至1-3厘米（2周左右），移栽到营养土:蛭石为1:1的培养土中，置于培养箱，温度22℃，光照16h，湿度70%，培养2-3周； 2）配制酶解液，选10ml酶解体系，置于90mm培养皿中； 3）在长势良好且未抽薹的拟南芥植株上选取鲜嫩叶片10-15片，用洁净的手术刀在培养皿的盖子上将叶片切成1mm宽的细条； 4）将切好的细条均匀铺在含酶解液的培养皿中，可以一边切一边从植株上取； 5）将酶解液和细叶条真空抽滤30 min； 6）将培养皿取出，静置在黑暗中，23℃，酶解3小时； 7）酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于2.0 ml离心管中，常温，100 g离心1 min； 8）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，4℃，100 g，离心1min； 9）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，冰上放置30min； 10）23℃，100 g，离心1min，弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬（本步骤及以下操作均在23℃）； 11）取约10-20ug质粒于2.0 ml EP管中，加100ul 制备好的原生质体，用剪去前端的200ul 枪头轻柔混匀； 12）加入110ul PEG/Ca溶液，轻柔混匀，23℃静置5-30min； 13）加入800 ul W5 溶液，轻柔的颠倒混匀，23℃，100 g，离心1min； 14）弃上清，加100ul W5，混匀，再次再加100ul W5，混匀； 15）上述混合液体置于恒温加热器中，23℃，避光，孵育6-18小时。 16）荧光观察，观察之前轻柔混匀，吸取观察物所用的枪头必须剪去前端。

原生质体转化

拟南芥原生质体制备 制备酶解液10 ml 1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。 （用胶带把下表皮沾掉，效果更好。放一小培养皿里面降解） 2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养2 h-2.5 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。 3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。 4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。（冰上） 5．100×g，4℃，离心2 min，收集原生质体。 6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复三次）。（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随后再轻轻加入剩W5） 7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。 8．100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积Mamg中。（看细胞浓度而定） 9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃保存一周内使用。 2.2.8 原生质体转化 1．在2 ml离心管中一次加入10 μl质粒DNA(10-20 μl，大小在5 Kb之内)，100 μl原生质体，充分混匀后加入110 μl PEG4000溶液。（3=1+2） 2．上述混合物室温放置10-30 min。 3．反应结束后加入440 μl W5液体培养基，充分混匀。 4．100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。 5．加入500 μl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复一次,可以重复两次）。 6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃黑暗培养。7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。

植物原生质体培养

原生质体的培养 1. 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 （二）分离方法 1.机械分离法 1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。 ②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。 ③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。

花序浸染法转化拟南芥

花序浸染法转化拟南芥 1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。营养土和蛭石1：1比例混合。 2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。总之盖膜时间自己灵活掌握。 3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。要转的每个基因的每个载体都是先2ml少量摇菌，然后按1：100的比例200ml大量摇菌。 4 在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。在用花序侵染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果（因为这些角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低阳性率，本身阳性率已经很低了，再降低就更不爽了），把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵

原生质体的制备

拟南芥原生质体转化实验 每次做大反应（用于CO-IP）最多做8管，每管需3 ml 原生质体溶液，浓度为106 ，10 ml 酶液需要40片叶子。小反应用于用于做蛋白定位，每管需200 μl 原生质体溶液 叶片的选取：，取刚刚完全展开，叶面光滑，非凹凸不平的，最上面最中间的叶片，依次向下选取，取瘦长的，叶缘尖锐的叶片为佳。每四棵苗取8-10片叶子。 1．打开水浴锅，TM=55o C 2. 配40 ml酶解液(8种试剂) Cellulose R10 0.6 g 不要粘在管壁上 Macrozyme R10 0.16 g Mannitol(4 o C) 20 ml KCl 0.4 ml MES 4 ml 55 o C，10 min(严格，前边摇2-3次，待管壁不再粘有酶，溶液澄清就不用摇) 待酶液自然降至室温，加入0.4 mL CaCl2 母液以及15.2 mL DDW ，0.04 g BSA，放置于3．将0.4 M mannitol 滴至一次性培养皿上，将叶片切成细丝，一刀一刀断开切，忌来回蹭。4．23 o C酶解2 h (或3 h，放置时间较长的酶液)，40 rpm。收获前75 rpm，摇1 min。5．配PEG 100 ml用Mannitol(4 o C) PEG 4000 40 g DDW 30 ml Mannitol 25 ml CaCl2 10 ml 6．提前将BD 50 ml 离心管置于冰上，尼龙膜过滤收集原生质体，100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心 7．用5 ml 大枪头吸除酶液，原生质体多则把酶液吸净，少则留一点酶液，加入W5 10-20 ml （依量而定）洗涤。100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心 8．吸去上清，再加入W5 20 ml，轻摇离心管重悬原生质体。100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心。 9．加入3-9 ml Mmg重悬,使原生质体浓度达到106，冰上放置。 10．取50 ml离心管（大反应），每管加入120 μg 质粒/每一种，然后用枪吸打混匀，阴性对照加一种质粒，然后用水补齐使总体积一致，然后用枪吸打混匀。冰上放置。 11．50 ml离心管中加入3 ml 原生质体溶液，沿管壁缓慢加入，充分摇匀。 12．每次室温摇匀后随即每50 ml离心管加入3 ml PEG溶液，轻柔颠倒混匀，不要有PEG 溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。加完PEG后每管室温放置6 min。（PEG刚加入时要分层，否则转化效率不好）。

手动质粒大提及原生质体提取

大提质粒 1．单菌落接种到5 ml含抗生素的LB培养液中（试管体积应比培养液至少大4倍；试管不应盖得太紧；转速应很剧烈）。 2．当OD600=0.6时倒入含抗生素的250 ml LB培养液，37℃300 r/min培养约14-18 h。 3. 4,000 rpm, 10 min, 4℃收集细胞。 4．去上清，加solution I 8 ml，涡旋振荡重悬（4℃）至溶液均匀无块状菌团。 5．每管加入solution II 16 ml 轻柔上下颠倒20下彻底混匀，置冰上5 min（时间不可过长）。6．每管加入solution III 8 ml (4℃)，立即轻柔地上下颠倒，彻底混匀，使沉淀均匀混于溶液中，呈现絮状而非团状，冰上放置10min。 7．平衡后，4℃，12,000 rpm, 20 min。 8．将上清经两层神奇滤布（DDW润洗）过滤至新50 ml 离心管中（约30 ml）加入0.6V （约18ml）异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温，30 min。 9．平衡后，室温，12,000 rpm, 20 min。 10．小心弃上清，离心管敞开盖，倒置以去残余上清。室温下70%乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，倒置去净乙醇，待挥发无味后（不要太干燥）加入总量4.2 ml DDW【or 6.2 ml】。11．转入15ml瘦型离心管中，加入CsCl 6 g 【or 8 g】（终浓度1g/ml），EB 120μl 【or 160μl】(母液浓度10 mg/ml)。 12．缓慢加入超速离心管6 ml【or 8 ml】，管内要装满，不能有气泡，精确配平（精确值0.01g）。13．超速离心60,000rpm（~250,000 g），16 h，20℃。升速调至次最快，降速调至no brake。14．收集闭环条带：用10ml注射器针头在离心管顶端扎一个小孔；将10ml的一次性注射针器针头斜面向上插入闭合环下方约1cm处，针头的斜面开口正好位于较低的DNA区带（闭环质粒DNA）下方；缓慢吸出质粒DNA，小心不要搅动上方粘稠的染色体DNA区带。15. 取等体积SSc饱和异戊醇上层加入离心管，反复上下颠倒混匀，静置5-10min，吸除上层含有EB的有机相，重复10次左右，直至溶液不含红色EB。最后一次抽提可静置60-90 min 【通风橱中操作】。 16．吸300μl质粒溶液入进口Ep管，加入1.2 ml (4V) 70% 乙醇颠倒混匀，沉淀质粒，室温，>30 min。 17．小离心机，13,000 rpm,15 min，室温。 18．加入600μl，70% 乙醇洗一次，13,000 rpm，3 min，室温。倒掉酒精，甩一下，用枪吸除剩余液体，放置5 min，呈半透明状，加DDW 200μl（依量而定）溶解。 19．稀释10倍或100倍，取2μl NANODrop测定浓度，再取500ng跑电泳。

拟南芥转化

1农杆菌感受态细胞的制备 挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于 5 ml含100 μg/ml利福平(Rifampicin)，50 μg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 μg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 μl接种于50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 μl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。 2.质粒转化农杆菌GV3101 将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化(冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下： 1) 从-80℃冰箱中取出GV3101 感受态细胞(100 μl)，置于冰上解冻； 2) 加入5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴5 min； 3) 液氮冷冻8 min； 4) 37℃水浴热激5 min； 5) 加入900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏； 6) 复苏结束后于4000 r/min 室温离心5 min； 7) 吸去800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；

8) 28℃倒置培养2 d 直至长出阳性菌落； 9) 挑取单克隆菌落，经LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落(液) PCR验证，以确认是否成功转化。经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。 （3拟南芥的转化 在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。 转化时将拟南芥的花序倒扣在盛有菌悬液的容器中，浸泡10-30秒，转化完毕后，将小花盆侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，12-24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，按照正常的方法培育植株至结实，收获成熟种子 将已经转化的Tl代成熟种子收取后，37℃烘干后准备阳性植株的筛选。由于表达载体带有除草剂抗性标记基因，所以用Basta(l:1(XX〕)进行阳性植株的筛选。将Tl代种子在消毒之后均匀撒播在培养土的表面，罩上盖子，当种子出苗后3天，打开盖子，在幼苗生长到2礴片真叶后，喷洒Basta筛选阳性植株。) 3拟南芥培养和转化 3.1 拟南芥培养 首先是拟南芥种子消毒，将待播拟南芥种子(每管100 μL) 分装于1.5 mLEppendorf 离心管中，每管加入1 mL 70%乙醇，振荡器上充分混匀，放置2 min，微型离心机上离心后，用 1 mL 枪头吸去乙醇，然后加入1 mL 10%NaClO，振荡器上充分混匀，放置15 min，

一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立

植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (3): 351~357351 收稿 2013-11-21 修定 2014-01-12 资助 国家重点基础研究发展计划(2012CB944803)、浙江省青年科学基金(LQ13C020002)和浙江省博士后项目择优资助(Bsh1202082和Bsh1202081)。 * 通讯作者(E-mail: yzhu1974@https://www.wendangku.net/doc/bc15982683.html,; Tel: 0571-********)。 一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立 段炼1,2, 钱君2, 郭小雨2, 朱英2,* 1 浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华321004; 2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所, 浙江省植物有害生物防控重点实验室, 省部共建国家重点实验室培育基地, 杭州310021 摘要: 在模式植物拟南芥中, 原生质体瞬时表达技术已被广泛地应用到功能基因组学的研究中, 但水稻原生质体因其制备过程相对繁琐, 转化效率偏低, 尚未在基因功能研究中获得广泛应用。本研究在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上, 对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。以水稻幼茎为起始材料, 采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10, 对水稻组织进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体, 获得了高纯度的原生质体。对质粒转化原生质体时的转化方法、转化时间及质粒浓度进行探索, 在缩短原生质体分离时间的同时, 大大提高了转化效率。用较少量的质粒DNA 即可获得外源基因在原生质体内高效的表达, 且转化效率可达70%。我们建立的这种快速有效的水稻原生质体制备和转化方法, 可为水稻功能基因组学研究提供技术支持。关键词: 水稻; 原生质体; 自沉降法 A Rapid and Efficient Method for Isolation and Transformation of Rice Protoplast DUAN Lian 1,2, QIAN Jun 2, GUO Xiao-Yu 2, ZHU Ying 2,*1 College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China; 2State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China Abstract: Transient gene expression in protoplast is a common approach for studying subcelluar localization, promoter activities and protein complexes in model plant, Arabidopsis. However, protoplast isolation, transformation and as well as downstream analyses in rice are often hampered by a number of factors such as time-consuming, cost-intensive and low transformation efficiency. In this study, we reported a rapid and efficient method for isolation and transformation of rice protoplast, based on the recently published procedure for Arabidopsis protoplast preparation. 10-to-14-days stem tissues but not leaf tissues were digested by proper cellulase R-10 and mecerozyme R-10. Pure protoplasts without cell debris were isolated from the interphase of sucrose gradient after natural sink. This method was also very time-efficient, large amount of protoplasts could be obtained within one day. The transformation efficiency was pretty high (70%) with little amount of DNA. The method we presented here should be valuable for the functional genomics research in rice.Key words: rice (Oryza sativa ); protoplast; the self-settlement method 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分细胞物质。离体的原生质体在适当的条件下具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力(张红梅和王俊丽2002)。近年来, 原生质体瞬时表达技术被广泛应用于基因功能研究, 其原因除了原生质体易于制备外, 还与其本身可以摄取外源细胞器、病毒、质粒以及DNA 等各种大分子物质有关(An 等2005)。在双子叶植物中, 重组质粒转化原生质体的相关技术已经十分纯熟, PEG 法介导的原生质体转化是实现该技术的重要手段之一。早在1989年, 就有Damm 等(1989)成功将外源基因转入了模式植物拟南芥的原生质体中。此后, 关于拟南芥的原生质体的相关报道层出不穷。拟南芥原生质体除了被用于胞内运输机制(Chen 和Halkier 2000; Wolfenstette 等2012)的探索、蛋白的亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA 与蛋白质的相互反应(Faraco 等2011; Yoo 等2007)外, 还被用作反向遗传学研究的受体(Zhai 等2009)。