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粘多糖贮积症I型分子生物学及产前诊断研究进展

粘多糖贮积症I型分子生物学及产前诊断研究进展

江雨综述周裕林审校

(厦门市妇幼保健院分子诊断实验室,厦门,361003)

摘要:粘多糖贮积症为糖胺聚糖降解代谢障碍所引起的一组遗传代谢病。根据不同的酶缺陷,可分为8型,鉴于我国I型最常见,本文就MPS-I的临床特征、a- L-艾杜糖苷酸酶基因结构、突变类型、特点及检测方法加以综述。

关键词:粘多糖贮积症I型;a- L-艾杜糖苷酸酶;基因突变

粘多糖是一类蛋白多糖,其中包括透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS}、硫酸皮肤素(DS)、硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸角质素(KS) 5种。其分解代谢首先由组织蛋白酶使蛋白多糖复合物的肽链分离并水解,然后经葡萄糖苷酶或半乳糖苷酶等逐步降解,最后释出多糖。降解过程的任一种酶发生遗传性缺陷,均可使代谢中断而致病。粘多糖贮积症I型(mucopolysaccharidosis typeone,MPS-I)是由a-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)基因突变引起的一种常染色体隐性遗传病。多种突变可导致a- L-艾杜糖苷酸酶的缺陷,它是HS和DS降解过程中所必需的酶。该酶的缺陷导致其天然底物在各组织溶酶体内堆积,最终引起临床症状。本病的临床表现具有广泛的变异性,现分为三种亚型:重型Hurler综合征;中间型Hurler/Scheie 综合征;轻型Scheie综合征。MPS- I临床表现的差异性给疾病严重程度的预测及遗传咨询带来了一定的困难,然而自从IDUA基因被克隆以来,突变分析为MPS-I的各种表型提供了分子水平的解释。目前已发现51种突变和30种多态性[1],使该病呈现了复杂的分子异质性。突变分析对于表型的预测、遗传咨询以及各种实验性治疗的选择和评估具有重要价值。

1、临床特征

在生化基础未被认清之前,粘多糖贮积症主要根据其临床表现分类。Hurler综合征是最早被人们认识的一种粘多糖病,又由于它最为常见,发病率为新生儿的1/ 15 000-1/ 10 000[2],.因而又被认为是粘多糖贮积症的原型。后又发现一临床表现较轻的MPS-Scheie综合征,后经证实Scheie与Hurler综合征具有相同的生化基础,均是由同一种酶a-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起,因而又将他们划分为亚型MPS- I H和MPS- I S。Hurler与Scheie综合征被

认为是由IDUA基因座位上一对等位基因所决定的[3],Hurler综合征是重型基因的纯合子,Scheie综合征为轻型基因的纯合子,并可认为临床表现介于此两型之间的患者为二等位基因的双重杂合子,划分为MPS- I/H或Hurler/ Scheie综合征。重型MPS- I型患者通常在出生后一年内即发病,呈进行性发展,表现为肝脾肿大、肾骼畸形、角膜浑浊、严重智力低下,通常于10岁前因呼吸道阻塞或心肺合并症死亡。中间型患者,中枢神经系统累及很少,但多于7岁以前表现运动能力的明显下降。轻型患者神经系统很少或无受累,体形改变较轻,正常生命时限,但以关节僵直、肝脾轻度肿大、主动脉瓣疾病和角膜浑浊为特征。

2、IDUA基因结构

自90年代以来,许多学者一直在探索MPS-I的分子致病机制,并取得了很大进展。1991年,编码全部外显子的cDNA被分离和表达[4],从其IDUA的cDNA序列可知,IDUA 含有1959bp的开放阅读框,编码653个氨基酸。其中包括26个氨基酸组成的信号肽,在成熟前被切掉,因而成熟的酶蛋白含有627个氨基酸,分子量为70 029da1。1992年,该基因被克隆,现知该基因定位于4p16.3,全长约19kb,含14个外显子,外显子长度介于77217bp 之间[5,6]。第1,2外显子被一个长566bp的内含子间隔;第2,3外显子间的内含子较大,约13kb,而最后12个外显子聚集在4.5kb的区域,其间的内含子长度在78478bp之间。内含子含有一个Alu重复区和一个可变数目串联重复序列(VNTR),此VNTR是由一长为86bp 的核心单位串联重复而成,具有高度的多态性,可利用此多态性进行家系分析以辅助诊断。Scott等曾在人群中分析该多态性,发现3种长为800bp, 715bp和630bp多态片段[7]。中山医科大学光炜等用同样方法检测了广东汉族人口该位点多态性,发现5种等位基因和9种基因型,其类型和频率与Scott报道的有显著差异,提示IDUA基因的改变可能具有种族差异性[8]。另外,还发现除内含子11以外的所有内含子-外显子连接区均遵循GT/AG法则,而内含子11两端为GC/ AG连接。IDUA基因具有看家基因的特点:启动子区没有典型的CAAT 框,仅含有GC框和多个转录起始点CA,其转录后的mRNA长仅为2.3kb。

目前,犬和鼠的IDUA已被分离[9],它们的IDUA基因均与人的IDUA基因结构相似。犬与人的IDUA基因和蛋白均有82%同源性,鼠与人的cDNA和蛋白同源性为78%和77%。正因为这种较高的同源性,我们可以制造MPS- I的动物模型,用于进一步探索该基因和新的治疗方法。

3 IUDA基因突变类型

利用各种检测突变的技术,目前已发现51种突变,包括无义突变、错义突变、剪接位点突变和缺失或插入。大多数突变位于基因的起始和中间部位。另外,还发现30种多态性。

3. 1无义突变

至今已报道了9种无义突变,均导致重型MPS,甚至突变点邻近C末段如R621X,酶活性亦完全丧失[10]。Scotty[11],Bach[12], Tieu[13]等人先后对W402X,Q310X和Y343X三种突变的mRNA及蛋白质进行了研究,发现许多无义突变均使正常mRNA量减少,而形成异常的mRNA,尤其突变点越靠近起始部位(如Q70X, Y64X),产生正常mRNA量越少。这就提示我们在力图认清基因型与表型相关性及结构与功能关系之前,应首先认识突变的mRNA。

3. 2错义突变

目前已报道25种错义突变,其中2种发生在终止密码子处。从群体学和基因表达研究来看,错义突变很可能是致病性突变。除4种(L218P, R489P,1.490P和R492P)以外的所有氨基酸替换在人类、犬和鼠中均具有保守性。除上述21种外,尚有7种非致病性的序列改变也导致了氨基酸替换,这些突变均位于糖基化位点附近。在17种可以引起轻型或中间型MPS的突变中,有12种错义突变,说明错义突变很可能是允许酶发挥功能的突变类型。3. 3剪接位点突变

现已发现3种剪接位点突变,其中678-7g > a和1062+ 2t > c是由于3’剪接位点发生突变,使其成熟的mRNA内含有内含子序列,从而产生轻型MPS。另一为474-2a > g,由于3’剪接位点发生突变使外显子4被剪切掉,从而产生重型MPS[14]。另外,其他的突变也可导致剪接异常,如发生在内含子5与外显子6交界处的703de122ins10,682insAC和外显子7内的Q310X突变,他们均利用内含子上游28bp处的3’隐蔽裂解位点进行剪切。而在正常人的IDUA基因中尚存在少数低水平的该种剪切现象。

3. 4缺失和插入

目前已发现7种微缺失(112bp)和6种插入(1-12bp)[15],另外还有一种复杂重排现象。在这14种突变中,有9种发生在重复序列区;有3种可影响mRNA的剪接和稳定(369insAC,703de122ins10,682insAC)。虽有5种没有导致移码突变(134de112,974ins12,1132de16,1277ins9,△D445),但只有2种表现为轻型MPS(974ins12,△D445)。1132de16因导致第349位的天冬氨酸和350位天冬酰胺缺失,从而产生重型MPS,且它与保守的错义突变D349N 具有重叠区,而D349N同样也导致重型MPS,这提示我们该区具有重要功能。134de112产生移码突变使信号肽部分第1619号密码子丢失,该突变的纯合子为重型MPS,这对于进一

步研究突变的酶在细胞内的加工过程可能会有意义。

3. 5多态性和非致病性序列改变

目前为止,共发现30种非致病性序列改变。有18种发生于外显子区,其中7种可导致氨基酸的改变。与大小相近的其他基因相比,IDUA基因具有高度的多态性。这些多态性对于mRNA的稳定、蛋白的翻译效率、蛋白的活性、蛋白的稳定性及运输究竟有何影响,目前尚未清楚。然而大多数学者认为,这些多态性可能是IDUA活性在健康个体中存在变异性的构成因素[16]。

4、MPS-I基因诊断方法

目前比较通用的做法是以PCR为基础,结合SSCP、化学断裂法、Southern或Northern 印迹杂交、异源双链分析、多态性分析及单倍体分析等进行突变筛查,但最终都需测序证实突变的性质。然而,目前的检测方法仅适于对少数患者进行研究,而不适合对所有患者进行筛查。

4. 1 RFLP分析

多种IDU A基因点突变可引起一个酶切位点的改变,例如W402X,R89Q,T64X ,L218P, T366P , G409A等均可增加或消除一个限制性内切酶位点。W 402X在外显子引入一个MaeI 酶切位点,R89Q则消除了一个外显子II的Hap II酶切位点。作为欧洲后裔中最常见的一种突变,W402X可以在大多数MPS-I患者的IDUA基因上检测到,MaeI酶切位点的引入使得对该突变的筛查更为可行。R89Q则是日本患者中最常见的突变,由于对MPSI的基因诊断在亚洲人群中开展得不多,所以用限制性内切酶Hap II对亚洲地区MPSI患者进行筛查很值得一试。

4. 2 AOS杂交

1992年,Scott等人采用ASO杂交方法确定了Q70X突变[17]。他们用来自患者基因组DNA的PCR扩增片段进行ASO分析,通过辨别是否完全配对或是否存在单碱基错配的杂交结果来确定IDUA基因是否发生Q70X突变。目前,可以用ASO杂交来进行诊断的IDUA 基因突变包括474-2a→g、W402X 、A75T、678-7g→a、1060+2t→c,P533R、deltG 1702等。

4. 3 RT-PCR分析

1993年,Seott等人采用RT-PCR方法分析含有R89Q等位基因患者的IDUA基因表达情况[18],证实R89Q为一种轻型表现型的等位基因。该基因的纯合子病情较轻,而其杂合子的病情则介于中间。该突变主要影响IDUA降解硫酸皮肤素的功能,而对其降解硫酸乙酞肝

素功能的影响甚微。

4.4 Northern印迹杂交

1993年,Bach等[19]利用Northern印迹法确定IDUA基因外显子VIII的T366P突变时发现,与正常对照组相比,该突变纯合子患者的mRNA量较正常高两倍,然而由患者mRNA 反转录得到的cDNA只表达出正常IDUA活性的1%。

4. 5 PCR-SSCP并DNA测序

这是目前广泛应用的一种检测未知基因突变类型的方法。1994年,Clarke等采用PCR -SSCP分析,检测出A 75T和474-2a→g两种突变。同年,Bunge等[20]用该方法对含有全部编码序列的46位欧洲后裔患者的IDUA cDNA进行筛选,除检测到两种最常见的突变Q70X 和W 402X之外,还发现了8种新突变。

5、MPS-I的治疗与产前诊断

目前,对MPS-I的临床诊断主要靠粘多糖尿检和细胞内酶活性的测定。在治疗方面,骨髓干细胞移植被认为是当前治疗Hurler综合征唯一有效的方法。而骨髓移植本身难度大,适应征要求严且疗效不一,因而从真正改善该病患者生命质量来看,该法并不十分理想。而酶替代法和基因治疗正应用于动物模型。尽管骨髓移植已做为一种治疗手段在进行尝试,但由于该治疗效果并不理想,尤其是对神经系统发育障碍没有明确疗效,因而,产前诊断就显得十分重要。产前诊断的适应对象应包括:曾生育过患病的孩子而再次怀孕的妇女及已知为X连锁遗传的MPS-II型携带者的妊娠妇女。这样就要求首先弄清先证者为哪种酶缺陷,主要是用生化方法检测组织细胞中的酶活性。除了MPS-II,其它各型MPS均为常染色体隐性遗传,故对于那些尚未明确诊断即死亡的患儿的父母及近亲结婚且其家系中曾有该类患者的父母均应进行是否为携带者的检测。用敏感的酶活性测定方法即可实现这一目的。MPS产前诊断的标本来源有:孕早期绒毛、孕中期羊水、胎儿和母亲的血。

6、结语

糖多糖贮积症I型作为发病率最高、最典型的M PS,对其发病机制、临床表现及分子遗传学改变方面的研究己经比较成熟,但是对该病的治疗却一直没有行之有效的方法。日前采取的手段主要是进行患者及携带者出生前的酶学诊断,以防止患儿出生。今后,应用基因诊断的方法以及采用肾髓移植、酶替代疗法乃至真正意义上的基因治疗等方法将成为该领域研

究中越来越受到重视的课题。

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