血小板冻干再水化的形态结构与凋亡_刘瑛
2008年 11月第28卷 第11期
基础医学与临床
B asic&
C linicalM ed i c i n e Nove m ber 2008Vo.l 28 N o .11
收稿日期:2007-12-11 修回日期:2008-05-14
基金项目:卫生部科学研究基金省部共建项目计划(W K J2005-2-037);浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目
*
通信作者(correspond i ng au thor):y l x @zj b .org .cn ;0571-********
文章编号:
1001-6325(2008)11-1169-05
研究论文
血小板冻干再水化的形态结构与凋亡
刘 瑛,许先国,洪小珍,马开荣,朱发明,严力行
*
(浙江省血液中心输血研究所卫生部血液安全研究重点实验室,浙江杭州310006)
摘要:目的探讨冷冻干燥法对血小板的细胞形态、
超微结构和细胞凋亡的影响。方法以新鲜血小板为对照,以保存30d 后再水化的冻干血小板为实验对象,分别在倒置相差显微镜和透射电镜下观察血小板的细胞形态和超微结构,用流式细胞仪(FC M )检测血小板凋亡率,并以1@103U /L 凝血酶为诱导剂检测再水化血小板的聚集活性。结果与新鲜血小板相比,冻干再水化后的血小板在形态上为圆盘状,未见有明显的细胞聚集,仅细胞透光性相对较弱;超微结构上也无明显变化,其内部基本结构清晰可辨,细胞膜、细胞器及分泌颗粒的包膜保持完整。新鲜血小板的细胞早期凋亡率为(0144?0119)%,显著低于冻干血小板的细胞凋亡率(3125?1168)%(P <0105)。冻干再水化血小板的最大聚集率为(93128?213)%。结论冻干再水化的血小板形态结构完整,细胞内超微结构完好,为本实验室成功建立血小板冻干保存方法提供了依据。
关键词:冻干血小板;再水化;超微结构;细胞凋亡
中图分类号:R 3311143;R 318152 文献标志码:A
M orphology and apopt osis of freeze -dri ed and rehydrated p l atelets
LIU Y i n g ,XU X i a n-guo ,HONG X iao -zhen ,M a Ka-i rong ,Z HU Fa -m i n g ,YAN L -i x ing
*
(Key Laboratory of B l ood S af ety Res earch ,M i n i stry ofH ealt h,Insti tute of Transf u sion M ed i ci n e ,B lood C en t er of Zh eji ang
Prov i nce ,H angz hou 310006,Ch i na)
A bstract :O bjective To eval u ate the effect o f lyophilization on the m orpho l o g ica l feature ,ultrastructure and apop -tosis o f p l a telets .M et hods The lyoph ilized plate lets w ere rehydrated after be i n g preserved 30days .The change of m or pho l o gy and u ltrastructure o f plateletsw as observed under the li g htm icr oscope and trans m issi o n electron m icro -scope (TE M ).The surv i v a l rate and apoptosis rate of plate lets w ere ana l y zed by flo w cyto m etry (FC M ).The aggregation rates o f rehydrated lyoph ilized p latelets w ere m easured by usi n g 1U /mL thr o m b i n .R esu lts The m or -pho logy o f rehydrated l y oph ilized platelets keeps nor m a.l There was no ev ident cell aggregati o n i n rehydrated lyoph -ilized platelets ,but the refractive i n dex w as re lative lo w as co m pared w ith fresh p l a telets .The result of u ltrastr ucture observati o n sho w ed that the i n trace ll u lar ele m entar y str uctures of rehydrated lyoph ilized platelets w ere clear and the cellm e m brane keeps intac.t Accord i n g to the result of FC M ana l y sis ,
the apoptosis rate of the fresh platelets
and lyophilized plate lets w as(0144?0119)%and (3125?1168)%respectively ,and there w as a sign ificant d ifference bet w een the t w o groups(P <0105).The m ax i m um aggregati o n rates o f rehydrated lyoph ilized platelets w ere (93128?213)%.Conclusion The rehydrated lyophilizedp late letskeep intactce llular str ucture .The resu lt
supportsm ethod bu il d i n g of lyophilized platelet i n our l a b.
K ey words:lyophilized p l a telet;rehydra ted;u ltrastructure;apoptosis
现临床用血小板在22e振荡条件下仅能保存5d,极大限制了血小板的临床应用,因而延长血小板的保存期限对于解决临床急救用血和血液的供求矛盾具有重要意义。冻干保存血小板是近年来发展起来的一项新技术,是解决血小板长期保存的理想途径[1-2]。研究发现,血小板在冻干和再水化过程中,细胞易受到损伤而发生形态和结构上的改变,影响血小板的存活率和生物活性。我们在建立了血小板冻干保存方法的基础上[3],对冻干再水化后血小板的细胞形态、超微结构、细胞凋亡和聚集活性等进行了研究。
1实验
111材料
11111血小板来源:实验所用血小板为新鲜机采血小板,调整后浓度为(1~115)@1012L-1,来自健康无偿献血者,所有标本均经献血者知情同意。11112主要试剂:海藻糖(C10H22O11#2H2O,北京经科宏达生物技术有限公司);牛血清白蛋白(BSA,上海生工公司);磷酸盐缓冲液(PBS);Annex i n?血小板凋亡检测试剂,包括Annex in?-FI T C、碘化丙啶(PI)、CD61-Per CP和结合缓冲液(B i n ding Buffer) (美国BD公司);凝血酶(美国S ig m a公司)。11113冻干血小板的制备:新鲜血小板的预处理和冻干悬液的制备方法见文献[3]。本实验对血小板冷冻干燥的程序优化为:将血小板冻干悬液先以20e/m i n的速率冻结至-40e,预冻2h后,再以115e/m in对搁板升温至-30e,退火015h,然后进入一次干燥,-38e维持一次干燥条件20h,最后以012e/m i n的加热速率使隔板温度升高至20e,维持二次干燥条件10h直至冻干结束。112冻干血小板的再水化
冻干的血小板密封保存在室温,30d后将它们复水。每个冻干样品原含有1m L血小板悬浮液,将血浆(PPP)B水=1B1(v/v)的复水溶液1mL在室温下直接加入每个冻干样品瓶中,轻轻振荡直到样品完全溶解于复水溶液中。113血小板形态观察
冻干再水化后血小板的形态用N ikon TE2000-U 型倒置相差显微镜(尼康,日本)进行观察,并用连接在显微镜图像输出接口的N ikon DXM1200F数码显微成像系统及其附带的图像采集软件N i k on ACT-1拍摄血小板形态的显微照片。
114血小板超微结构观察
再水化后的血小板和新鲜血小板分别以戊二醛固定、脱水,环氧树脂包埋后制作超薄切片。在Ph ilips E M410型透射电镜(浙江大学医学院电镜室提供)下观察血小板的超微结构。
115血小板凋亡检测
用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤血小板并重悬于结合缓冲液(B i n ding Buffer),轻轻混匀细胞后各加10L L Annex in?-F I T C、碘化丙啶(PI)和CD61-Per-CP,分别对新鲜机采血小板(对照组)和冻干再水化的血小板(实验组)进行染色标记,室温避光孵育10m i n后上FACS C ali b ur检测,采用CELLQuest软件分析细胞凋亡率。
116血小板聚集实验
将冻干血小板复水后转入离心管中进行洗涤以去除细胞外保护剂,离心(10000r/m i n@1m i n)后再用新鲜冰冻血浆重悬血小板,调整血小板浓度为(012~013)@1012L-1。冻干再水化后血小板的聚集功能用其对1@103U/L凝血酶的聚集反应来检测,血小板悬浮液吸光度随时间的改变由TYXN-91智能血液凝集仪(上海)记录,具体实验方法参见文献[3]。
117统计学分析
冻干血小板再水化后检测数据以均数?标准差(x)?s)表示,采用SPSS1110统计软件进行数据分析处理,组间差异比较用t检验。
2结果
211冻干再水化后血小板的形态观察
将密封保存在室温30d的冻干血小板复水,稀释后进行显微观察细胞形态。结果显示,新鲜血小板透光性较强(图1A),而冻干再水化后的血小板
透光性较弱(图1B)。血小板冻干复水后仍保持形态完整,细胞呈正常的圆盘状,多数血小板呈散在分布,未见血小板互相黏附聚集等严重激活损伤的细胞改变。
212冻干血小板再水化后的超微结构观察
透射电镜观察显示,新鲜血小板因着色较深,胞质中着色深的区域为线粒体及各种血小板颗粒,包括A颗粒、致密颗粒、过氧化酶颗粒等(图2A);冻干再水化后的血小板着色较浅(图2B),细胞呈椭圆形,细胞膜完整,血小板的内部基本结构清晰可辨,胞内储存颗粒和开放管道系统(OCS)等各种细胞器分布均匀并保持完整的包膜。
213冻干血小板的细胞凋亡检测
流式细胞仪对血小板凋亡的检测结果见图3 (图3为5次实验中的1次检测结果)。首先在FSC/SSC图中根据血小板的大小和颗粒性,设血小板门(R2区域)(图3A);然后据SSC/CD61-Per CP 点图,找出CD61-Per CP阳性的血小板群(R1区域) (图3B)。在R1和R2门内做Annex i n?-FI T C/PI 双参数分析,图3C根据阴性对照(新鲜机采血小板)可将Annex in?-FI T C/PI点图分为4个象限,其中lo w-le ft(LL)象限(Annex i n?-PI-)为活细胞;lo w-right(LR)象限(Annex i n?+PI-)为早期凋亡的血小板;up-l e ft(UL)和up-right(UR)象限(PI+)为坏死的血小板。冻干再水化血小板(实验组)的细胞凋亡检测情况(图3D)。结果表明,实验组和对照组的活细胞数均占血小板总数的95%以上,但是冻干再水化血小板的细胞凋亡率显著高于新鲜血小板的自然凋亡率(P<0105)(表1)。
214冻干血小板对凝血酶的反应
将密封保存在室温30d的冻干血小板样品再水化,其对1@103U/L
凝血酶的聚集轨迹用血小板聚
图3FC M检测冻干再水化后的血小板早期凋亡率
F ig3Apop tosis of rehydrated l yoph ili zed p l atelets de tected by f l ow cyto m etry
A1plate lte were recogn i zed on t he basis o f FSC versus SSC g ati ng(R2);B1plate lte w ere recogn ized on t he basis o f CD61 ve rsus SSC g ati ng(R1);C1expression ofA nnex i n V on F resh plate lets(contro l);D1expression o fA nnex i n V on rehydra-ted l yoph ilized plate lets
表1Ann ex i n V/PI荧光标记法检测血小板的
早期凋亡率
Table1Exp ressi on of Ann exin V on rehydrated
lyoph ilized p late lets and con trols
(x)?s,%,n=5)
group annex i nV-PI-
(LL)
annex i nV+PI-
(LR)
rehydrated l yoph ili zed p l atel ets95147?11563125?1168* fres h p l atelets(con trol)98173?01420144?0119
*P<0105co m pared w it h fres h p l atel ets
集仪记录,实验重复3次,再水化的血小板最大聚集率为(93128?213)%(n=3)。
3讨论
建立血小板冻干保存方法,不仅要充分利用冷冻干燥技术优点,还应考虑血小板本身的基本特性[4]。如果冷冻干燥过程造成了血小板大量损伤而致使冻干后的血小板存活率大大降低,则失去了冻干的意义。因此,血小板的冻干保存是建立在细胞生物学基础之上。随着国内外对血小板保存技术的深入研究发现,血小板对温度非常敏感,当低于生理温度时,血小板的主要膜成分、致密管道系统及质膜都会在10~20e之间发生磷脂相转变[5-6],引起血小板细胞从静息状态的圆盘状变成有多个伪足的球形;在4e贮存超过24h,血小板就会激活并释放致密颗粒、溶酶体和A颗粒,细胞膜破碎溶解,此过程与血小板生理激活过程类似,激活的血小板临床应用受到限制[7]。
血小板细胞结构的完整性影响其功能活性,它是决定冻干保存成败的关键。本实验以海藻糖为细胞内保护剂,1%小牛血清和20%海藻糖为细胞外保护剂,进行血小板冻干保存[3,8]。冻干再水化后的血小板在光学显微镜下形态方面与新鲜血小板无明显区别;透射电镜下观察到大多数血小板的超微结构保持完整,说明冻干和再水化过程未造成血小板膜结构的破坏,而血小板内部储存颗粒的存在以及开放管道系统的完整为其发挥正常生理功能提供了一定基础。研究中发现,透射电镜下新鲜血小板着色相对较深,可能为新鲜血小板生物活性较高或膜通透性相对较高,因而有较强吸附染料的能力。从FC M检测结果可知,冻干再水化的血小板主要集中于(Annex in?-PI-)区,说明大部分血小板仍为活细胞。冻干再水化血小板的细胞凋亡率显著高于新鲜血小板的自然凋亡率,说明冻干和再水化过程对血小板有影响,使得部分细胞活性改变并有少量细胞发生凋亡,提示血小板冻干再水化后有一定程度的活性损失。
总之,本实验结果显示,冻干再水化的血小板具有完整的细胞结构,早期凋亡的细胞数低于5%,冻干再水化的血小板仍具有一定的聚集活性,表明冻干血小板仍具有一定的存活能力,为成功建立血小板冻干保存方法提供理论依据。
参考文献:
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2008年诺贝尔生理学/医学奖简介
2008年诺贝尔生理学/医学奖的评选已于10月6日落下帷幕,荣膺此项大奖的是德国科学家哈拉尔德#楚尔#豪森和两名法国科学家弗朗索瓦丝#巴尔-西诺西和吕克#蒙塔尼尔,旨在表彰他(她)们发现两种严重危害人类健康的病毒及有关研究与贡献。
H PV与人子宫颈癌
子宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,尤其在第三世界。迄今在我国某些地区的农村,它的发病率仍居女性肿瘤中的第一位。什么是H PV呢?它与子宫颈癌究竟有何关系呢?
H PV是人乳头瘤病毒(hu m an pap ill om a v irus)的英文缩写。豪森的最大贡献便在于他早在上个世纪70年代即从事H PV 的研究,并且首先提出HPV是人类子宫颈癌的元凶。他认为一旦子宫颈上皮细胞感染了HPV,则该病毒的DNA即可整合至宿主细胞的基因组内,使得细胞发生转化(即细胞表型与性质改变之意),导致细胞分裂失控而无限增殖,最终产生了肿瘤。不仅如此,他还提出在癌细胞中应可找出这种H PV的基因。
经过10余年的不懈努力,他终于在人子宫颈癌的活检组织中找到了H PV-DNA,并且他陆续证明,HPV是一个家族,其中最具致癌活性的是两种称为HPV16和H PV18的亚型。
正是由于豪森的这些发现,使得人们有可能制备出针对该病毒亚型的,十分有效的子宫颈癌预防性疫苗。
顺便提及HPV感染虽然多见于女性生殖道,但在其他部位的组织也是可以找到的,其中包括女阴、阴茎、口腔以及某些其他肿瘤组织。
H I V与艾滋病
艾滋病的全名是/获得性人类免疫缺陷综合征0(A cqurred hu m an i m m unodeficiency syndrom e,A I D S),音译成艾滋病。该病最早出现于上个世纪80年代初。法国科学家巴尔-西诺西和蒙塔尼尔首先注意到病人的淋巴结肿大与血液中一种称之为T淋巴细胞数量的减少,于是他们从病人的淋巴结中分离出这种细胞,进行培养(即让它们在实验室培养瓶中生长)。他们不但观察到病态的细胞用出芽方式将一种颗粒排出,而且发现这种颗粒属于一种称之为反转录病毒的病毒,即现在称之为人免疫缺陷病毒(hum an i m m unodeficiency v irus),缩写为H I V。
由于T淋巴细胞是人类主要的免疫防御功能细胞之一,它受到H I V攻击后会死去,于是病人的免疫力会急剧下降,这样又可引发一系列其他疾病,如卡波济肉瘤、肺囊虫病、真菌感染及其他细菌感染。
虽然目前对艾滋病尚无特效药物可以杀伤H I V。但H IV及其发病机制的发现极大地丰富了人们对病毒致病机理的认识,并且因此找出早期诊断的方法和采取有效的预防措施以防止或延缓A I D S在全球的传播。相信随着对H I V更深入的研究,人类必将最终找到有效的治疗药物和预防性疫苗。
章静波