药物急性毒性试验LD50的方法

药物急性毒性试验LD50的方法

对全新结构的药物或中草药复方，先通过小批量动物的摸索，找出0%和100%估计致死量（即Dmin和Dmax），再求出i值。

（1）用10倍稀释的药物浓度系列，用少量动物（每组2~3只），找出大致死亡范围。如：

上述结果提示，大致死亡范围为：50~500 mg/kg。

（2）再用1、2、4、8……等2倍稀释的药物浓度系列，每组4只，找出Dmin和Dmax。如：

Dmax：当出现4/4死亡时，如其前一组为3/4死亡，则取4/4组的剂量为Dmax；如前一组为1/4或2/4死亡，考虑到4/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于70%，为慎重起见，可将4/4组的剂量乘以2作为Dmax。

Dmax=400×70%×2=560 mg/kg

Dmin：当出现0/4死亡时，如其后一组为1/4死亡，则取0/4组的剂量为Dmin；如后一组大于1/4，考虑到0/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于70%，为慎重起见，可将0/4组的剂量除以2作为Dmin。

Dmin=50÷70%÷2≈35 mg/kg

（3）本法用较少的动物和药物，寻找出正式实验时最高死亡率不低于70%，最低死亡率不高于30%点剂量范围在确定了Dmax和Dmin以后，可求得组间距（i值）：

lg Dmax-lgDmin

i=

n-1

（4）以Dmin的对数为起点，向上退出n组动物的各组剂量的对数值，求出反对数即可得出各组的剂量值。

注意：①LD50测定中剂量组数的设计，除符合统计学要求外，还应根据预试验所提供的药物的毒性情况而定。②一般而言，在实际工作中，设4~5个剂量组，组距以0.65~0.85为宜。③小鼠每组10只（雌雄各半），大鼠不应少于6~8只。

药物重复给药毒性试验技术指导原则

药物重复给药毒性试验技术指导原则 一、概述 重复给药毒性试验是描述动物重复接受受试物后的毒性特征，它是非临床安全性评价的重要内容。重复给药毒性试验可以：①预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量效和时效关系、以及可逆性等；②判断受试物重复给药的毒性靶器官或靶组织；③如果可能，确定未观察到临床不良反应的剂量水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）；④推测第一次临床试验（First in Human, FIH)的起始剂量，为后续临床试验提供安全剂量范围；⑤为临床不良反应监测及防治提供参考。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。 二、基本原则 药物安全性评价试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP），药物重复给药毒性试验是药物研发体系的有机组成部分，试验设计要重视与其他药理毒理试验设计和研究结果的关联性，要关注同类药物临床使用情况、临床适应症和用药人群、临床用药方案，还要结合受试物理化性质和作用特点，使得重复给药毒性试验结果与其他药理毒理试验研究互为说明、补充或/和印证。 三、基本内容

（一）受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较长时，应考察配制后体积是否存在随放置时间延长而膨胀造成终浓度不准的因素。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格及生产单位。 化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。 在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性试验。

急性毒性(GB20592-2006)

化学品分类、警示标签和警示性说明安全规范急性毒性 GB20592-2006 化学品分类、警示标签和警示性说明安全规范急性毒性Safety rules for classification，precautionary labeling and precautionary statements of chemicals-Acute toxicity 前言 本标准第4章、第6章、第7章、第8章为强制性的，其余为推荐性的。 本标准与联合国《化学品分类及标记全球协调制度》(GHS)的一致性程度为非等效，其有关技术内容与GHS中一致，在标准文本格式上按GB／T 1.1—2000做了编辑性修改。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC／TC251)提出并归口。 本标准负责起草单位：天津出入境检验检疫局。 本标准参加起草单位：中国疾病预防控制中心、中化化工标准化研究所、浙江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王利兵、李宁涛、尚为、冯智颉、刘绍从、张园、陈文。 本标准自2008年1月1日起在生产领域实施；自2008年12

月31日起在流通领域实施，2008年1月1日～12月31日为标准实施过渡期。 化学品分类、警示标签和警示性说明安全规范急性毒性 1 范围 本标准规定了化学品引起的急性毒性的术语和定义、分类、判定流程、类别和警示标签、类别和标签要素的配置及警示性说明的一般规定。 本标准适用于化学品引起的急性毒性按联合国《化学品分类及标记全球协调制度》的危险性分类、警示标签和警示性说明。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 6944—2005 危险货物分类和品名编号 联合国《化学品分类及标记全球协调制度》(GHS) 联合国《关于危险货物运输的建议书规章范本》 3 术语和定义 急性毒性acute toxicity 经口或经皮肤摄入物质的单次剂量或在24 h内给与的多次剂量，或者4 h的吸入接触发生的急性有害影响。

药物急性毒性试验LD50的方法

精品文档 药物急性毒性试验LD 50的方法 对全新结构的药物或中草药复方，先通过小批量动物的摸索，找出0%和100%估计致 死量（即Dmin和Dmax），再求出i值。 （1）用10倍稀释的药物浓度系列，用少量动物（每组2~3只），找出大致死亡范围。如: 上述结果提示，大致死亡范围为：50~500 mg/kg。 （2）再用1、2、4、8……等2倍稀释的药物浓度系列，每组4只，找出Dmin和Dmax。如： Dmax :当出现4/4死亡时，如其前一组为3/4死亡，则取4/4组的剂量为Dmax ;如前一组为1/4或2/4死亡，考虑到4/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于70%，为慎重 起见，可将4/4组的剂量乘以2作为Dmax。 Dmax=400 X 70% X 2=560 mg/kg Dmin :当出现0/4死亡时，如其后一组为1/4死亡，则取0/4组的剂量为Dmin ;如后一组大于1/4，考虑到0/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于70%，为慎重起见，可 将0/4组的剂量除以2作为Dmin。 Dmin=50 十70% 十2~ 35 mg/kg （3）本法用较少的动物和药物，寻找出正式实验时最高死亡率不低于70%，最低死亡率不高于30%点剂量范围在确定了Dmax和Dmin以后，可求得组间距（i值）： lg Dmax-lgDmin i= ------------------------------ n-1 （4）以Dmin的对数为起点，向上退出n组动物的各组剂量的对数值，求出反对数即可得出各组的剂量值。 注意：①LD50测定中剂量组数的设计，除符合统计学要求外，还应根据预试验所提供 的药物的毒性情况而定。②一般而言，在实际工作中，设4~5个剂量组，组距以0.65~0.85 为宜。③小鼠每组10只（雌雄各半），大鼠不应少于6~8只。

小鼠的急性毒性试验

五种农药对小鼠的急性毒性试验 绪论 随着现代农业的飞速发展，农药的应用越来越广泛，在农林作物的病虫防治中,农药一直发挥着巨大作用,尤其是本世纪60-70年代,人们大量使用农药,几乎使粮食产量增长一倍,但随着农药长期的、大量的、不合理的使用,导致了对环境的严重污染并对人体健康产生极大的影响。它们对动、植物和人类的危害越来越严重。一方面它们可以直接进入生物体内引起急性、慢性中毒和畸变，同时还通过径流、排污、挥发等途径进入土壤、大气和水体，引起各种生态环境下生物的死亡，并通过食物链的富集影响人类的食品安全。目前，因农药使用与管理失控而引发的一系列水域环境污染以及食品安全等问题，已引起政府相关部门和业内学者的广泛重视。当前，随着有机氯农药的禁用，菊酯类和有机磷类等成为我国目前使用较广泛的农药。 《中华人民共和国农药管理条例》指明，农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成物或者几种物质混合物及其制剂。农药残留是指农药使用后残存于环境、生物体和食品中的农药及其衍生物和杂质的总称。动植物在生长期间、食品在加工和流通中均可受到农药的污染，导致食品中农药残留。 相关报道表明，农药利用率一般为10%，约90%的残留在环境中，过多地使用农药，大量未被利用的农药经过降雨、农田渗滤和水田排水等进入水体，同时，还有大量散失的农药挥发到空气中，最后汇入水域，沉降积淀在土壤中，通过农作物吸收和食物链进入人体进行累积，并对人体健康造成危害。目前中国一些食品，如茶叶、大米、肉、蛋等食品中农药残留量常超过规定标准，过多的残留量对人体健康会造成危害。为此，论述农药残留对人体健康的危害效应及其毒理机制和防治措施，以期对防治食品中农药残留对人体健康的危害提供理论依据。 在哺乳类实验动物中，由于小鼠个体小，饲养管理方便，生产繁殖快，质量控制严格，价廉可以大量供应，又有大量的具有各种不同特点的近交品系，突变品系，封闭群及杂交一代动物，小鼠实验研究资料丰富参考对比性强；更重要一点乃是全世界科研工作者均用国际公认的品系和标准的条件进行试验，其实验结果的科学性、可靠性、重复性高，自然会得到国际认可。 本文以百草枯、甲氰菊酯、乐果、草甘膦和敌敌畏五种常用农药为实验材料, 检测了它们对

急性毒性试验

试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。 一、啮齿类动物单次给药的毒性试验 （一）试验条件 1.动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。选用其他动物应说明原因。年龄一般为7-9周龄。同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%.实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。 2.饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。 3.受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。 （二）试验方法： 由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。 1.伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。 2.最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。 3.最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。 4.单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续再观察7天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。

药物单次给药毒性指导原则征求意见

药物单次给药毒性试验技术指导原则 （第二稿） 一、概述 急性毒性（Acute toxicity）是指药物在单次或24小时内多次给予后一定时间内所产生的毒性反应[1、2]。狭义的单次给药毒性试验（Single dose toxicity study）是指为获得药物单次给予后的急性毒性反应的试验[2]。本指导原则所指单次给药毒性试验是广义的单次给药毒性试验，通常，可采用单次或24小时内多次给药的方式获得药物急性毒性信息。 拟用于人体的药物通常需要进行单次给药毒性试验[注1]。单次给药毒性试验对初步阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。单次给药毒性试验所获得的信息对重复给药毒性试验的剂量设计和某些药物Ⅰ期临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息[1]。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的单次给药毒性试验研究。 二、基本原则 （一）试验管理

药物的单次给药毒性试验属于安全性评价研究，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。 （二）具体问题具体分析 单次给药毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。 对于化学药，应根据受试物的结构特点、理化性质、同类化合物情况、适应症和用药人群特点、试验目的等选择合适的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其它药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价。 对于中药和天然药物，还应考虑到其与化学药的不同特点，选择合适的试验方法。由于中药、天然药物情况复杂，试验时应根据各自不同的情况进行针对性设计。 （三）随机、对照、重复 单次给药毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复。 三、基本内容 （一）受试物 中药、天然药物：受试物应能充分代表临床试验样品或上市药品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，由于中药的

制剂长期毒性研究技术指导原则

制剂长期毒性研究技术 指导原则 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-

北京市医疗机构制剂长期毒性研究 技术指导原则 一、概述 长期毒性研究可为医疗机构制剂（以下简称“制剂”）的研发提供重要的安全性参考信息，是非临床安全性评价的重要内容。通过长期毒性研究，可预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量毒关系和时毒关系、可逆性等；判断受试物长期给药的毒性靶器官或靶组织；推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；提示临床试验中需重点监测的指标；提供临床试验中解毒或解救措施的参考。 本指导原则适用于中药制剂、化学制剂的长期毒性试验研究。 二、一般要求 长期毒性研究应遵守《药物非临床研究质量管理规范》，遵循毒理学研究中随机、对照、重复的基本原则进行试验设计和开展研究工作。 研究机构必须具有法人资格，具备从事药物安全性评价的相关设备、设施及资质，必须取得相应实验动物使用许可证，具有与所使用的实验动物级别相符的实验环境。 试验项目负责人必须获得相关专业领域副高级以上职称（含副高），所有参加研究的人员必须经过相关专业的业务培训。 三、基本内容 制剂的开发背景和研究基础各不相同，在长期毒性研究立题之前应进行文献查阅，根据申报品种的立题依据、临床意义、处方来源、使用历史、有效性与安全性等背景资料进行综合考虑。 （一）试验项目的选择 1.制剂注册申请

（1）中药制剂若满足以下全部条件，可免于进行长期毒性试验： ①根据中医药理论组方； ②处方中的药味用量不超过法定药品标准规定； ③处方组成中不含有法定标准中标识有毒性及现代毒理学证明有毒性的药材（毒性药材是指历版中国药典，部颁标准，进口药材标准，省、自治区、直辖市的中药材标准中标注为大毒/剧毒和有毒的药材，如制附子、制川乌、制草乌等）； ④处方组成不含有十八反、十九畏配伍禁忌； ⑤利用传统工艺配制（即制剂配制过程没有使原组方中治疗疾病的物质基础发生变化的）； ⑥急性毒性试验（采用最大给药容量、最大给药浓度）未见明显毒性反应； ⑦临床实际用药周期为1周以内。 实际用药周期超过1周者，如符合上述条件，且该处方在本医疗机构具有5年以上（含5年）使用历史、能提供可靠的临床安全性资料，亦可免于进行长期毒性试验。 （2）申请配制的化学制剂属已有同品种获得制剂批准文号的，可免于进行长期毒性试验。 （3）本医疗机构已有品种的改剂型品种，如果配制工艺无质的改变且临床用量、给药途径相同，可以免报长期毒性研究资料（缓释、控释制剂除外）。否则，应按临床拟用途径比较改变前后的长期毒性反应。 （4）化学制剂注射剂品种，参照新药的注射剂相关研究技术要求进行试验研究，提供申报资料及文献资料。 2.制剂补充申请

实验二 经口急性毒性试验

毒理学实验二经口急性毒性试验 一、实验目得 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LＤ５０得试验设计原则 3、小鼠得经口灌胃技术 二、试剂与材料 1、实验动物: (1)动物品种:健康成年IＣR小鼠,体重18g～22g (2)样品来源:首都医科大学实验动物部 2、器材:注射器(1ml)、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。 3、试剂:敌敌畏(1400mg/ｍｌ)、苦味酸染液(标记用)。 三、实验内容 1、健康实验动物得选择与性别鉴定 选择健康得雄性小鼠(健康标准:毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎,废弃。) 肛门与生殖孔距离:大者为雄性,小者为雌性 2、实验动物称重、编号与随机分组 选择体重在1８-22 g得小鼠,采用随机分组得方法(动物按体重分为几个体重段,再从每个体重段分出各组动物),每组10只小鼠,用黄色得苦味酸饱与液标号１ ~9,10号小鼠不标记、 3、受试化学物溶液得配制 (1)确定灌胃量:0、１mｌ/10ｇ (2)确定最高给药量,计算溶液浓度,估计给药总体积 (3)药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定,右手持灌胃器,插入动物口腔,沿咽后壁徐徐插入食道,深度为口腔至剑突得距离。 5、毒性体征得观察与LＤ５０计算 (１)毒性体征得观察: 染毒后注意观察小鼠中毒得发生、发展过程及死亡数与死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间,记录死亡情况及时间,观察期为３0 min （2）ＬD５０得计算: ａ、实验各组剂量得确定:设5组,每组雌雄动物各10只。 剂量组距 d 为: ｄ为相邻两个剂量组剂量对数之差 利用lgLD０依次加d,取反对数,即可得出各组剂量。 b、LD5０得计算(见附件):

鱼的急性毒性试验

鱼的急性毒性试验 一、实验目的和要求： 通过本试验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析和报告等全过程。 二、实验原理： 鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96h为一个实验周期，在24h、48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50%时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效成都，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。 三、实验材料： 1.实验鱼的选择和驯养 12×6 小锦鲤鱼体长7-12cm 体宽3-5cm 体重 7-12g 不同浓度的苯酚（mg/L）0、24、48、96、192、384 2、实验仪器设备 （1）实验容器 实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水槽。容器体积可以根据试验鱼的体重确定，通常以每升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为1g）。一些小型鱼类幼鱼可选择500ml 或1000ml烧杯为实验容器。容器的深度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，以除去所有毒性残留物。 （2）其他 吸光光度计 3、实验用水：曝气水 四、操作步骤： 1、设置5个浓度组，1个空白对照组，选择不同浓度的苯酚（mg/L）0、24、48、96、 192、384。每个浓度放入12条小锦鲤鱼。采用直接投毒方式，将配制的苯酚溶液直接倒入水槽中，搅拌均匀。分别分为1、2、3、4、5、6组。染毒后观察其活动状况，并

实验二 经口急性毒性试验

毒理学实验二经口急性毒性试验 1、实验目的 1、掌握实验动物分组方法 2、测定LD50的试验设计原则 3、小鼠的经口灌胃技术 二、试剂和材料 1、实验动物： （1）动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g～22g （2）样品来源：首都医科大学实验动物部 2、器材：注射器（1ml）、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。 3、试剂：敌敌畏（1400mg/ml）、苦味酸染液（标记用）。 3、实验内容 1、健康实验动物的选择和性别鉴定 选择健康的雄性小鼠（健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。） 肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性 2、实验动物称重、编号和随机分组 选择体重在18-22 g的小鼠，采用随机分组的方法（动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物），每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液标号1~9,10号小鼠不标记。 3、受试化学物溶液的配制 （1）确定灌胃量：0.1ml/10g （2）确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积 （3）药品称量及稀释 4、小鼠灌胃技术 左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。 5、毒性体征的观察和LD50计算 （1）毒性体征的观察：

染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间 按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min （2） LD50的计算： a、实验各组剂量的确定：设5组，每组雌雄动物各10只。 剂量组距 d 为： d为相邻两个剂量组剂量对数之差 利用lgLD0依次加d，取反对数，即可得出各组剂量。 b、LD50的计算（见附件）： C、求半数致死量的95%可信区间 4、实验过程 1、人员分工：本次实习同学分两个大组(A组和B组)，分别在不同实验室。每大组分5个小组，分别处理雌雄动物，每小组10只动物。 集体活动：1、 2、 3、 4、5 组各1人，进行受试物配制。 各小组活动： 每小组1人（共4人），进行动物标记。（1-10号） 每小组1人（共4人），进行体重记录。（1-10号） 每小组1人（共4人），进行灌胃。（1-10号） 每小组1人（共4人），根据体重吸取受试物（0.1ml/10g）

急性毒性试验[1]

实验一急性毒性试验(Acute Cytotoxicity Test) 一、实验目的： 了解生物材料急性毒性的含义，掌握急性毒性试验的基本方法。 二、实验原理： 医学上通常指的急性毒性试验是对药物而言的，并以半数致死量（median lethal dose, LD50）来衡量药物急性毒性的大小。所谓LD50是指某一药物使试验动物总体死亡一半的剂量，由于LD50是剂量反应曲线上最敏感的一点，而且有易测、准确和重复性好的优点，以此作为药物使用的安全指标。但对于生物材料而言，它与药物在体内的反应机理不同，大多数生物材料不能计算LD50，所以在试验过程中，通过对实验动物进行动物静脉或腹腔注射试验材料或其浸提液来观察实验动物体重在24、48和72h的变化、运动、呼吸状态以及死亡情况作为评价的指标，判定某种生物材料的急性毒性作用。 三、实验对象：小鼠 四、实验器材和药品： 聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA），蒸馏水，生理盐水（0.9％），注射器（1ml），量筒（10ml），小烧杯（50、100ml），高压消毒器。 五、实验步骤： 1．浸提液制备： 按评价标准裁剪试样，选择适当浸提温度制备浸提液。 2．将10只体重在17～23g间的健康、未做过其他实验的小鼠随机分为实验组和对照组，每组5只。 3．将浸提液按每公斤小鼠体重注射50ml于实验组小鼠尾静脉（50ml/kg），用生理盐水按同样方法作空白对照。 4．记录试样表面积和使用浸提液的容量；记录注射后24h、48h、72h两组小鼠的体重，观察其各种生物学反应情况。 六、评价方法：

2．结果判断标准： 2．1 在72h观察期内，注射材料浸提液的动物反应不大于对照组动物，则认为该材料符合急性毒性试验要求。 2．2在72h观察期内，注射材料浸提液动物中有2只以上出现轻度毒性症状或仅1只动物出现明显毒性症状死亡，或实验组5只动物的体重均下降，即使无其他中毒症状都要进行重复试验。 2．3 重复试验的动物数量应加倍，即每组需10只小鼠。浸提液应该重新制备。重复试验若符合2．1 项要求，则认为该材料合格。 2．4 如实验组动物有2只以上发生死亡或3只以上出现明显毒性症状或动物普遍出现进行性体重下降，则不需要重复试验，可认为该材料不符合急性毒性试验要求。 附：小鼠静脉注射方法 小鼠的尾部有三条静脉，一般采用两侧的静脉。把动物固定在暴露尾部的固定器内（可用烧杯、铁丝罩或粗试管邓物代替固定器）。拔去尾部静脉走向的毛，置尾巴于40～500C 温水中浸泡几分钟，或用75％乙醇棉球反复擦抹，使尾部血管扩张。行尾部注射时，尽量采用与尾部平行的角度进针，抽吸法不能验证是否穿刺成功，开始注药时应尽量缓慢，仔细观察，如果有白色皮丘出现，说明未刺入血管，应重新向尾部方向移动针头，再次穿刺，直至注射时无皮丘出现，才能正式注射药物，有时在注射药物的同时可见静脉血被进去的药物向前推进。 实验二致热源试验(hypersusceptibility test) 一、实验目的： 掌握致热源实验的基本方法。 二、实验原理： 致热源试验是通过被测材料或其浸提液注入实验动物体内，若浸提液存在热源物质，作用于单核细胞、巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内出性热源，作用于丘脑体温调节中枢，使动物体温上升，因此，观察动物的体温变化可用来判断该材料或其浸提液中所含热源量是否符合人体的要求。 三、实验对象：兔 四、实验器材和药品： 硅橡胶、蒸馏水、生理盐水（0.9℅）、注射器（50ml）、烧杯(150ml)、量筒（100ml）、高压消毒器、体温计（肛测）。 五、实验步骤： 1．浸提液制备： 1.1将所有与浸提液接触的容器、量器等玻璃器皿均应先置于干燥箱内250℃加热30min，或180℃加热2h去除热原物质。 1.2 浸提液所用灭菌0.9℅生理盐水应是热原检查合格者，试样浸提前应用同一批号灭

(仅供参考)药物重复给药毒性试验技术指导原则

附件3 药物重复给药毒性试验技术指导原则 一、概述 重复给药毒性试验是描述动物重复接受受试物后的毒性特征，它是非临床安全性评价的重要内容。重复给药毒性试验可以：①预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量效和时效关系、以及可逆性等；②判断受试物重复给药的毒性靶器官或靶组织；③如果可能，确定未观察到临床不良反应的剂量水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）；④推测第一次临床试验（First in Human, FIH)的起始剂量，为后续临床试验提供安全剂量范围；⑤为临床不良反应监测及防治提供参考。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。 二、基本原则 药物安全性评价试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP），药物重复给药毒性试验是药物研发体系的有机组成部分，试验设计要重视与其他药理毒理试验设计和研究结果的关联性，要关注同类药物临床使用情况、临床适应症和用药人群、临床用药方案，还要结合受试物理化性质和作用特点，使得重复给药毒性试验结果与其他药理毒理试验研究互为说明、补充或/和印证。 三、基本内容 （一）受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的

工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较长时，应考察配制后体积是否存在随放置时间延长而膨胀造成终浓度不准的因素。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格及生产单位。 化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。 在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性试验。 化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。 （二）实验动物 重复给药毒性试验通常采用两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类。理想的动物应具有以下特点：①对受试物的代谢与人体相近； ②对受试物敏感；③已有大量历史对照数据，来源、品系、遗传背景清楚。在重复给药毒性试验前应采用合适的试验方法对实验动物种属或品系进行选择。通常，啮齿类动物首选大鼠、非啮齿类动物首选Beagle犬，特殊情况下可选用其他种属或品系动物进行重复给药毒性试验，必要时选用疾病模型动物进行试验。

急性毒性试验

急性毒性试验 试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计 提供参考信息等。 一、啮齿类动物单次给药的毒性试验 （一）试验条件 1．动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。选用其他动物应说明原因。年龄一般为7-9周龄。同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%。实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。 2．饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。应写明动物饲养室内环境因素的控 制情况。 3．受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。 （二）试验方法： 由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急 性毒性试验。 1．伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。 2．最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产

生死亡的剂量。 3．最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动 物，观察动物的反应。 4．单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择5、50、500和2000mg/kg四个 固定剂量。 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7 天仍然存在，尚应继续再观察7天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。 试验观察：给受试药物后至少应观察2周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每只动物均应仔细观察和详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。给受试药物当天至少应观察记录两次，以后可每天一次。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主及中枢神经系统行为表现等。动物死亡时间的记录要准确。给受试药物前、给受试药物后1周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应作病理组织学检查。固定剂量试验法所获得的结果，参考下表标准进 行评价。 单次口服固定剂量试验法结果的评价

药物单次给药毒性研究技术指导原则

药物单次给药毒性研究技术指导原则 一、概述 急性毒性（Acute toxicity）是指药物在单次或24小时内多次给予后一定时间内所产生的毒性反应[1、2]。狭义的单次给药毒性研究（Single dose toxicity study）是考察单次给予受试物后所产生的急性毒性反应[2]。本指导原则所指为广义的单次给药毒性研究，可采用单次或24小时内多次给药的方式获得药物急性毒性信息。 拟用于人体的药物通常需要进行单次给药毒性试验（见注释1）。单次给药毒性试验对初步阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。单次给药毒性试验所获得的信息对重复给药毒性试验的剂量设计和某些药物临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量所致急性中毒相关的信息[1]。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。 二、基本原则 （一）试验管理 用于支持药品注册的单次给药毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。 （二）具体问题具体分析 单次给药毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。

对于化学药，应根据受试物的结构特点、理化性质、同类化合物情况、适应症和用药人群特点、试验目的等选择合适的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其他药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价。 对于中药和天然药物，还应考虑到其与化学药的不同特点，试验时应根据各自不同的情况进行针对性设计。 （三）随机、对照、重复 单次给药毒性试验应符合动物试验的一般基本原则，即随机、对照和重复。 三、基本内容 （一）受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较长时，应考察配制后体积是否存在随放置时间延长而膨胀造成终浓度不准的因素。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格及生产单位。

皮肤用药毒性试验

皮肤急性毒性试验 一.试验目的观察动物完整皮肤及破损皮肤短期内接触受试物所产生的毒性反应。 二.实验材料 1.动物：选用成年健康家兔(2kg)、白色豚鼠(300g)、白色小型猪(7kg)或大鼠(200g)。家兔 或小型猪每组4只，豚鼠或大鼠每组10只。受试动物应皮肤光滑、无损伤、无皮肤病。 2.受试物：膏剂、液体或粉末。前两者可直接试验，后者需用适宜赋形剂(如羊毛脂、凡士 林等)混匀，以保证受试物与皮肤良好接触。 三试验方法 1 受试动物皮肤制备： ①完整皮肤制备：动物在给药前24h，将背部脊柱两侧去毛，可采用剪、剃或适宜的脱毛剂，如8%Na2S等。去毛范围约相当于体表面积的10%左右，即家兔约150cm2左右，豚鼠、大鼠约40cm2左右，小型猪约300cm2。去毛后24小时检查去毛皮肤是否因去毛而受伤，受伤的皮肤不宜做完好皮肤的毒性试验。 ②破损皮肤准备：按上述方法将受试动物去毛，消毒皮肤后，用消毒手术刀做井字形划破表皮，或用砂布纸摩擦打毛皮肤等，以皮肤出现轻度渗血为度。 2 剂量选择和分组：分对照组和试验组。对照组应设赋形剂组或空白组。试验组分为完整皮肤组和破损皮肤组，各2～3个剂量组。每组动物数为家兔或小型猪4只，大鼠或豚鼠10只，雌雄各半。低剂量组以临床用制剂(含辅料)用量不低于1g或1ml，高剂量组为低剂量组的2～4倍，或各剂量组间间距根据受试物毒性大小和预试结果而定，一般以0.65～0.85为宜。根据中药具体特点，可以提高浓度或增加24小时内用药次数。若用受试物剂量超过有效浓度20倍以上，仍未出现异常反应或死亡，则只设一个高剂量组 3 给药方法及观察时间：试验时，将受试物均匀的涂敷于动物背部脱毛区，破损皮肤则在脱毛区划破皮肤后再涂敷受试物，并用无刺激性砂布、胶布或网孔尼龙绷带加以固定。给受试物24小时后，可用温水或适当溶剂去除残留的受试物或赋形剂，每日观察，连续观察7天。给受试物时应注意，若受试物是固体粉末或中药散剂，则需加适量水或赋形剂(如羊毛脂、凡士林、橄榄油等)混匀，以保证受试物与皮肤的良好接触。如受试物时液体，除用纱布固定外，还应在其覆以聚乙烯薄膜，然后再包扎固定，以防止液体挥发。给药后，要防止动物舔食受试物。 4. 观察内容：观察动物全身中毒表现和死亡情况，包括动物体重、皮肤、毛发、眼睛和粘膜的变化，呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等的变化。若有动物死亡则需进行尸检和肉眼观察。当有肉眼可见病变时，则需进行病理学检查。 四结果判断及实验报告 实验结果与对照组比较进行判断。试验报告应详细论述实验方法，列表说明分组、剂量、动物数、每日用药次数、中毒表现及死亡动物数，有死亡动物时，应报告病例解剖学及病理组织学检验报告，并与对照组进行对比评价。

急性毒性试验方法

由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。 1．伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。 2．最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。3．最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。 4．单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续再观察7天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。

制剂长期毒性研究技术指导原则

北京市医疗机构制剂长期毒性研究 技术指导原则 一、概述 长期毒性研究可为医疗机构制剂（以下简称“制剂”）的研发提供重要的安全性参考信息，是非临床安全性评价的重要内容。通过长期毒性研究，可预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量毒关系和时毒关系、可逆性等；判断受试物长期给药的毒性靶器官或靶组织；推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；提示临床试验中需重点监测的指标；提供临床试验中解毒或解救措施的参考。 本指导原则适用于中药制剂、化学制剂的长期毒性试验研究。 二、一般要求 长期毒性研究应遵守《药物非临床研究质量管理规范》，遵循毒理学研究中随机、对照、重复的基本原则进行试验设计和开展研究工作。 研究机构必须具有法人资格，具备从事药物安全性评价的相关设备、设施及资质，必须取得相应实验动物使用许可证，具有与所使用的实验动物级别相符的实验环境。 试验项目负责人必须获得相关专业领域副高级以上职称（含副高），所有参加研究的人员必须经过相关专业的业务培训。 三、基本内容 制剂的开发背景和研究基础各不相同，在长期毒性研究立题之前应进行文献查阅，根据申报品种的立题依据、临床意义、处方来源、使用历史、有效性与安全性等背景资料进行综合考虑。 （一）试验项目的选择 1.制剂注册申请 （1）中药制剂若满足以下全部条件，可免于进行长期毒性试验：

①根据中医药理论组方； ②处方中的药味用量不超过法定药品标准规定； ③处方组成中不含有法定标准中标识有毒性及现代毒理学证明有毒性的药材（毒性药材是指历版中国药典，部颁标准，进口药材标准，省、自治区、直辖市的中药材标准中标注为大毒/剧毒和有毒的药材，如制附子、制川乌、制草乌等）； ④处方组成不含有十八反、十九畏配伍禁忌； ⑤利用传统工艺配制（即制剂配制过程没有使原组方中治疗疾病的物质基础发生变化的）； ⑥急性毒性试验（采用最大给药容量、最大给药浓度）未见明显毒性反应； ⑦临床实际用药周期为1周以内。 实际用药周期超过1周者，如符合上述条件，且该处方在本医疗机构具有5年以上（含5年）使用历史、能提供可靠的临床安全性资料，亦可免于进行长期毒性试验。 （2）申请配制的化学制剂属已有同品种获得制剂批准文号的，可免于进行长期毒性试验。 （3）本医疗机构已有品种的改剂型品种，如果配制工艺无质的改变且临床用量、给药途径相同，可以免报长期毒性研究资料（缓释、控释制剂除外）。否则，应按临床拟用途径比较改变前后的长期毒性反应。 （4）化学制剂注射剂品种，参照新药的注射剂相关研究技术要求进行试验研究，提供申报资料及文献资料。 2.制剂补充申请 （1）增加中药制剂的功能主治（需延长用药周期或者增加剂量者）、增加化学制剂的适应症，应当提供长期毒性试验资料及文献资料。 （2）变更制剂使用剂量，应当提供长期毒性试验资料或文献资料。

药物急性毒性实验

实验一药物急性半数致死量（LD50）的测定 【目的】 了解药物半数致死量(LD50)测定的意义、原理，掌握半数致死量的测定方法和计算过程。【原理】 LD50是指在一群动物中能使半数动物死亡的剂量。由于实验动物的抽样误差，药物的致死量对数值大多在50％质反应的上下呈正态分布。在这样的质反应中药物剂量和质反应间呈S型曲线，S型曲线的两端处较平，而在50％质反应处曲线斜率最大，因此这里的药物剂量稍有变动，则动物的死或活的反应出现明显差异，所以测定半数致死量能比较准确地反映药物毒性的大小。 【实验材料】 1、动物：小白鼠，体重18-24g，雌、雄各半，实验前禁食12小时，不禁水。 2、药品：盐酸普鲁卡因，苦味酸。 3、器械：小鼠笼，天平，注射器（1mL），电子计算器。 【方法和步骤】 （一）预备实验 1、探索剂量范围：先找出100%及0%死亡的剂量，此即上下限剂量（D m及D n）。方法是先取出小鼠9-12只，每组3只，按估计量（根据经验或文献资料定出）给药，如3只小鼠全死则降低剂量一半，如全不死则增加剂量一倍，如部分死亡，则按2：1的比例向上、向下调整剂量，由此找出上下限剂量。 2、确定组数，计算各组剂量： 确定组数（G）：可根据适宜的组距确定组数，一般分5-8个剂量组。 计算各组剂量：要求各组剂量按等比级数排列，在找出D m及D n和确定组数后，可按下列公式求出公比r： r 再按公比计算各组剂量D1,D2,D3,D4,D5……D m，其中D1=D n=最小剂量，D2=D1?r; D3=D2?r; D4=D3?r; D5=D4?r; ……D G=D G-1?r。r值一般以1.7~1.15之间为宜。 计算举例：已知某药在致死毒性实验中，Dm=187.5 mg/kg; Dn=76.8 mg/kg, 确定组数 G=5，求r及各组剂量。先代入公式求r=1.25，再计算各组剂量D1=Dn=76.8 mg/kg, D2=76.8?1.25=96 mg/kg, 依次计算D3，D4，及D G(D5)分别为120，150，187.5 mg/kg。