酿酒酵母研究
酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)一直作为面包和馒头以及酿造葡萄酒和啤酒等产品的发酵株．随着石油资源的日益枯竭以及环境的持续恶化，能源和环境问题成为了全球关注的焦点．为了缓解能源危机给经济和环境带来的影响，各国一方面提高能源的利用率，另一方面大力开发新型能源．由于生物能源具有绿色性和可再生性，因此成为研究的热点与重点．研究发现?，通过酿酒酵母发酵代谢生产乙醇，然后将乙醇进一步脱水后再加上适量的变性剂就可获得变性燃料乙醇．因此，利用酿酒酵母发酵技术将甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物等转化为燃料乙醇，已成为解决世界能源危机和开发生物能源的重要手段．燃料乙醇俗称酒精，是国民经济中十分重要的工业产品，用途十分广泛，如在食品行业用于配制各类白酒、果酒、药酒等[1]；在化工行业用于合成化工产品(橡胶、苯胺、乙二醇等)；在燃料方面用于替代日益匮乏的石油资源，可有效减少环境污染，市场前景广阔；在医药工业用于提取医药制剂和作为消毒剂；染料生产、国防工业等也需要大量酒精；同时酿酒酵母中还含多种生理活性物质和营养成分，可用于食品和动物饲料的添加剂，不仅能提高其营养价值，而且还具有医疗保健功能，治疗机体因消化不良或维生素缺乏而引起的一些疾病．此外，酿酒酵母与动、植物同为真核生物，具有很多相同的细胞结构，并且具有生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等特点[2]，在生命科学研究中被用作真核生物研究的模式生物．选育出优良的酿酒酵母菌种不仅能提高产品的产量和质量、降低生产成本、增加企业的利润和市场竞争力，还能缓解能源危机、减轻环境污染．因此，对酿酒酵母进行研发与利用具有重要的经济价值和科研意义．人们急切盼望获得具有多种优良特性的酿酒酵母菌株，尤其是转化乙醇能力强的酿酒酵母，其研究意义十分深远．
不仅如此酿酒酵母还存在高效合成萜类的甲羟戊酸途径，可有效吸附废水中的Mn，具有表达人血清白蛋白(HSA)系统等，可以利用酿酒酵母的这些功能，将其应用于处理传统方法不能处理的低浓度重金属废水或用于避免人血生产HSA时造成的肝炎和艾滋病等疾病的传染以及将酿酒酵母改造为生产青蒿酸、丹参酮和人参皂苷等多种药用萜类化合物的工程菌[3]．此外，利用酿酒酵母作为底盘菌构建生产番茄红素细胞工厂也具有很大潜力[4]。
[1]汤晓宏，胡文效，魏彦锋，等．葡萄酒野生酿酒酵母的筛选及其生物特性的研究[J]．山东大学学报：理学版，2014，49(3)：12～17．
[2]张强，郭元，韩德明，等．酿酒酵母乙醇耐受性的研究进展[J]_化工进展，2014，33(1)：187—191．
[3] de LianosFrutos R，Fernandez—Espinar M T，Querol A．Identification of species of the genuscandida by analysis of the 5．8S rRNA gene andthe two ribosomal internal transcribe d spacers[J]．Antonie Van Leeuwenhoke，2004，85(3)：175-185．
I20 J Coulon J，Husnik J I，Inglis D L，et a1．Metabolicengineering of Saccharomyces cerevisiae tominimize the production of ethyl carbamate inwine [J]．Am J Enol Vitic，2006，57(2)：113—124．
[4] J Fell J W，Bockhout T，Fonseca A．et a1．Biodi—versity and systematics of basidiomycetous yeasts
as determined by large—subunit rDNA D 1／D2domain sequence analysis[J]．Int J SystEvolMicrobiol，2010，50(3)：1351—1371．
酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
BY4741酿酒酵母菌使用说明
BY4741酿酒酵母菌 BY4741Strain BY4741菌信息： 培养基：YPD 菌株类别：酵母菌 培养条件：28℃，有氧，YPD 质粒转化：电激 保存方式：30%甘油，-20℃ 基本应用：用于蛋白表达 BY4741菌使用说明： 四区划线培养，挑单菌落接种培养使用并保存甘油菌。 BY4741操作说明： 1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。 2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落进行后续操作。 冷冻管开封： 用浸过75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。 BY4741菌株复溶： 无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取1ml左右复溶液，加入到冷冻管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。 BY4741菌株复壮： 用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培养。细菌在30-35℃培养箱中培养24-48h，真菌在23-28℃培养箱中培养24-72h（必要时，可适当延长培养时间）。 BY4741菌株传代： 将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。 注意事项： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放置会导致
菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要5-10%CO2促进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 BY4741菌保藏条件： -20℃保存（复溶液于2-8℃保存） 保藏时间： 2-10年，应根据菌种状况及时转接
酵母表达体系
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
酿酒酵母的应用概况
酿酒酵母的应用概况 酿酒酵母虽然形态简单但其代谢产物多、生理结构复杂且富含多种生理活性物质和营养成 分，在酿造、医药保健、饲料、能源化工以及生命科学研究等领域中广泛应用． 1、酿酒酵母在酿酒工业中的应用 由于酿酒产业是我国的支柱产业之一，因此酿酒酵母在国民经济中有着举足轻重的作用．酿酒酵母所酿酒的种类繁多，如白酒、啤酒、黄酒和果酒等，并且形成了各种类型的名酒，如贵州茅台酒、绍兴黄酒、青岛啤酒和张裕解百纳等．一般 来说，酒的品种不同，所用的酿酒酵母以及酿造的工艺也不同．但就算是同一类型的酒，不同的地区 也有独特的酿造工艺和不同的风味。 2、酿酒酵母在医疗保健中的应用 我国古代就有用酿酒酵母来治疗疾病的记载，中医将其称为“神曲”．现代医药上将酿酒酵母制成酵母片，即市售的食母生片，可用于提高新陈代谢机能，治疗消化不良症、肝脏疾病和药物中毒以及白血球减少症和肝炎等疾病．另外，酿酒酵母还可作为一些微量元素的载体，如在酵母培养过程中，添加硒可用于治疗克山病、大骨节病和防止细胞衰老，添加铬的酿酒酵母可用于治疗糖尿病等．在医药生产中，可从酿酒酵母细胞中提取凝血脂、麦甾醇(纤维素的前体)、卵磷脂、核酸、核苷酸、多糖、氨基酸、谷胱甘肽和核苷类药物等多种生化药物_53J．此外，利用现代分子生物学技术可以制备相应的基因重组酵母育苗，为攻克及预防相关疾病提供试验支撑． 3、酿酒酵母在饲料生产中的应用 酿酒酵母蛋白质含量高达50％以上，在畜牧业中～直作为单细胞蛋白的主要来源而被广泛使用．单细胞蛋白是从含蛋白的微生物中提取的蛋白质，具有促进动物的生长发育、缩短饲养期、增加肉量和蛋量、改善肉质和提高瘦肉率、改善皮毛的光泽度和增强幼禽的抗病能力的作用．此外，酿酒酵母还存在于动物肠道中，不仅可以提高反刍动物对饲料干物质、纤维素、半纤维素、蛋白等有机物和磷酸的消化率，增强机体的免疫力，还能提高饲料中矿物质利用率，有助于动物充分利用饲料中的养分．随着家畜摄入酿酒酵母量的增加，酿酒酵母会在家畜的肠胃道上大量繁殖，可有效改善家畜肠胃的菌群结构，增强家畜的免疫力和抗病力． 4、酿酒酵母在能源化工中的应用 酿酒酵母在能源化工中主要用于生产酒精，酒精除了可作为“绿色”燃料外还是许多化工行业中不可缺少的基础原料和溶剂，如合成橡胶、聚丙乙烯、乙二醇、冰醋酸、苯胺、聚氯乙烯、乙醚、脂类、环氧乙烷和乙基苯等化工产品．另外，酒精还是香料、染料、油漆、树脂等工业生产部门必不可少的有机溶剂，还可作为珠宝、钟表等的洗涤剂．酒精也是生产和加工油漆和化妆产品中不可缺少的溶剂．我国农副产品资源丰富，把农副产品用于工业酒精生产也是农产品深加工和保护环境的一条有效途径． 5、酿酒酵母在生命科学研究中的应用 酿酒酵母与动、植物同为真核生物，且全基因组比较小、遗传背景相对清楚，因此被广泛作为真核模式生物．通过对酿酒酵母基因进行连锁分析、定位克隆和测序验证等一系列检测后就可获得与人类某些疾病相关的基因序列，使构建精细的遗传图谱成为可能，可大大提高人类基因遗传性疾病(如糖尿病、小肠癌等)的诊断和治疗水平．酿酒酵母作为真核生物的模式菌株，与分子生物学技术结合后会使人类对真核生物的功能基因组信息、生物信息学、
实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法
电转法 设计方案一： 感受态制备： 1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm 培养约16-18h(OD:1.3-1.5)； 3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水 重悬，可换成较小的离心管； 4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇 匀，于30度轻轻摇动45min； 5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min； 6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤； 7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）； 8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。 电转化： 1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min； 2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆； 3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h； 4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h； 5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。 说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。 设计方案二： 感受态制备： 1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm 培养约16-18h(OD:1.3-1.5)； 3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬 于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇， 10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min； 4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三 次，离心条件一样； 5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山 梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。 电转化： 1.向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移 至预冷的电转杯中，静置5min； 2.擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆； 3.立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；
酿酒酵母培养基配方
种子培养基(g/L ) : 无氨基酵母氮源(YNB, Difco) 15, 尿嘧啶0. 04, 腺嘌岭0. 04, 色氨酸0. 02,组氨酸0.02, 精氨酸0.02, 蛋氨酸0.02, 苏氨酸0.03。 常规发酵培养基(g/L ) : 大豆蛋白胨(Difco )40, 酵母粉(Difco) 40, 葡萄糖20。 合成培养基由葡萄糖(60 g/L )、氨基酸、微量矿物质和维生素构成。氨基酸成分与种子培养基相同。微量矿物质和维生素的构成如下: 微量矿物质(g/L ) : (NH4)2SO4 20, KH2PO4 0.3, M gSO4·7H2O 0.5, EDTA 1.5, ZnSO4·7H2O0.0045, CoCl2 · 6H2O 0.003, M nCl2 · 4H2O 0.001, CuSO4 ·5H2O 0.003, CaCl2 ·2H2O 0.0045, FeSO4·7H2O 0.003, H3BO3 0.001, KI 0.001(121 °C灭菌30 m in)。维生素(mg/L ) : 生物素0.5, 泛酸0.1, 尼克酸1.0, 肌醇25.0, 硫胺素1.0, 吡哆酸1.0, 对氨基苯甲酸20, 叶酸1, 胆碱15, 核黄素4 (过滤灭菌)。 合成培养基(g/L )： 1，(NH4)2SO4 25，KH2PO4 25，MgSO47.3，CaSO4.2H2O 1 2，YNB 13.4，His 1，Leu 2，Trp 2 3，PTM1 4ml 4，甘油30 50％甘油补料(g/L )： 1，甘油500 2，12ml PTM1 3，His 1，Leu 2，Trp 2 20％半乳糖诱导(g/L )： 1，半乳糖200 2，6ml PTM1 3，His 1，Leu 2，Trp 2
酿酒酵母研究
酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)一直作为面包和馒头以及酿造葡萄酒和啤酒等产品的发酵株．随着石油资源的日益枯竭以及环境的持续恶化，能源和环境问题成为了全球关注的焦点．为了缓解能源危机给经济和环境带来的影响，各国一方面提高能源的利用率，另一方面大力开发新型能源．由于生物能源具有绿色性和可再生性，因此成为研究的热点与重点．研究发现?，通过酿酒酵母发酵代谢生产乙醇，然后将乙醇进一步脱水后再加上适量的变性剂就可获得变性燃料乙醇．因此，利用酿酒酵母发酵技术将甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物等转化为燃料乙醇，已成为解决世界能源危机和开发生物能源的重要手段．燃料乙醇俗称酒精，是国民经济中十分重要的工业产品，用途十分广泛，如在食品行业用于配制各类白酒、果酒、药酒等[1]；在化工行业用于合成化工产品(橡胶、苯胺、乙二醇等)；在燃料方面用于替代日益匮乏的石油资源，可有效减少环境污染，市场前景广阔；在医药工业用于提取医药制剂和作为消毒剂；染料生产、国防工业等也需要大量酒精；同时酿酒酵母中还含多种生理活性物质和营养成分，可用于食品和动物饲料的添加剂，不仅能提高其营养价值，而且还具有医疗保健功能，治疗机体因消化不良或维生素缺乏而引起的一些疾病．此外，酿酒酵母与动、植物同为真核生物，具有很多相同的细胞结构，并且具有生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等特点[2]，在生命科学研究中被用作真核生物研究的模式生物．选育出优良的酿酒酵母菌种不仅能提高产品的产量和质量、降低生产成本、增加企业的利润和市场竞争力，还能缓解能源危机、减轻环境污染．因此，对酿酒酵母进行研发与利用具有重要的经济价值和科研意义．人们急切盼望获得具有多种优良特性的酿酒酵母菌株，尤其是转化乙醇能力强的酿酒酵母，其研究意义十分深远． 不仅如此酿酒酵母还存在高效合成萜类的甲羟戊酸途径，可有效吸附废水中的Mn，具有表达人血清白蛋白(HSA)系统等，可以利用酿酒酵母的这些功能，将其应用于处理传统方法不能处理的低浓度重金属废水或用于避免人血生产HSA时造成的肝炎和艾滋病等疾病的传染以及将酿酒酵母改造为生产青蒿酸、丹参酮和人参皂苷等多种药用萜类化合物的工程菌[3]．此外，利用酿酒酵母作为底盘菌构建生产番茄红素细胞工厂也具有很大潜力[4]。 [1]汤晓宏，胡文效，魏彦锋，等．葡萄酒野生酿酒酵母的筛选及其生物特性的研究[J]．山东大学学报：理学版，2014，49(3)：12～17． [2]张强，郭元，韩德明，等．酿酒酵母乙醇耐受性的研究进展[J]_化工进展，2014，33(1)：187—191． [3] de LianosFrutos R，Fernandez—Espinar M T，Querol A．Identification of species of the genuscandida by analysis of the 5．8S rRNA gene andthe two ribosomal internal transcribe d spacers[J]．Antonie Van Leeuwenhoke，2004，85(3)：175-185． I20 J Coulon J，Husnik J I，Inglis D L，et a1．Metabolicengineering of Saccharomyces cerevisiae tominimize the production of ethyl carbamate inwine [J]．Am J Enol Vitic，2006，57(2)：113—124． [4] J Fell J W，Bockhout T，Fonseca A．et a1．Biodi—versity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large—subunit rDNA D 1／D2domain sequence analysis[J]．Int J SystEvolMicrobiol，2010，50(3)：1351—1371．
酿酒酵母
酿酒酵母 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）又称麫包酵母或者出芽酵母。 形态及大小：是一种直径为5微米 所属分类 域：真核域(Eukarya) 界：真菌界(Fungi) 门：子囊菌门(Ascomycota) 纲：半子囊菌纲(Hemiascomycetes) 目：酵母目(Saccharomycetales) 科：酵母科(Saccharomycetaceae) 属：酵母属(Saccharomyces) 种：酿酒酵母(S. cerevisiae) 酿酒酵母介绍 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称麫包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10 μm。其繁殖的方法为出芽生殖。 酵母生活史 酵母的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞（酵母的优势形态）也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能够进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配，重新形成二倍体。酵母有两种交配类型，称作a和α，是一种原始的性别分化，因此很有研究价值。 酿酒酵母基因组 酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，测序工作于1996年完成。 酿酒酵母的基因组包含大约1200万碱基对，分成16组染色体，共有6275个基因，其中可能约有5800个真正具有功能。据估计其基因约有23%与人类同源。酵母基因组数据库包含有酵母基因组的详细注释(annotation)，是研究真核细胞遗传学和生理学的重要工具。另一个重要的酿酒酵母数据库[1]由慕尼黑蛋白质序列信息中心维护。 在科学中的作用 因为酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。在人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物的，其中包括有关细
酿酒酵母培养基配方和诱导表达方法
第一部分酿酒酵母培养基和培养平板配方 所有的液体培养基需用磷酸缓冲液配制：Na2HPO4-7H2O, L, NaH2PO4-H2O L. 称量好所需组分，先把氨基酸、氮源等添加到水中，再添加糖最后添加10X的磷酸缓冲液。液体培养基的PH需在左右。 液体选择培养基和丰富培养基可以选择过滤除菌，但是琼脂平板培养基必须高压灭菌 丰富非选择培养基 2 x (YEPD or) YPD = Yeast Extract Peptone Dextrose 20g酵母粉yeast extract(OXOID LP0021) 40 g 蛋白胨peptone (OXOID LP0042) 40g葡萄糖dextrose**（国药14434-43-7） 把除葡糖糖之外的所有组分加入500ml水中溶解，定容至900ml，高压灭菌 配置20%的葡萄糖过滤除菌，添加100ml。 室温保存1-2个月。 **也可以所有组分一起灭菌，但是可能会发生焦化作用，然而焦化作用不会引起任何问题。 生长选择合成培养基（Selective Growth Synthetic Media） 2x (SD – CAA) 1）用于EBY100菌株配套pYD 系列载体，或者二配体酵母配套pPNL20 和pPNL30 载体 10 g/L 酪蛋白水解物casamino acids (-ade, -ura, -trp)（库存货号：Fluka A2427-250G） 40g/L 葡萄糖dextrose（国药14434-43-7） 14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids （SIGMA Y0626） g/L Na2HPO4（国药10039-32-4） g/L NaH2PO4（国药14431-43-7） 44 2）用于YVH10 with pPNL30系列载体 10 g/L 酪蛋白水解物（casamino acids (-ade, -ura, -trp) 40g/L 葡萄糖dextrose 14g/L YNB （Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids ）40mg/L色氨酸（tryptophan）g/L Na2HPO4 g/L NaH2PO4 3)用于JAR with pPNL20系列载体 10 g/L 酪蛋白水解物（casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050) 40g/L 葡萄糖dextrose 14g/L YNB （Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids ）(BD Difco 233520) 20mg/L Uracil g/L Na2HPO4 g/L NaH2PO4 Selective scFv (or Fab or ligand) Induction Media 抗体scFv (or Fab or 配体)的选择诱导培养基
酿酒酵母S_cerevisiae高密度培养条件优化研究
第37卷第1期 2007年2月 工业微生物 Industrial Microbiology Vol.37No.1 Feb.2007 基金项目:厦门市科技计划资助项目(编号:3502Z20031079);作者简介:王颖(1983～),女,硕士研究生; 3通讯作者。Tel :86-592-2183088;Fax :86-592-2184822;E 2mail :ylu @https://www.wendangku.net/doc/bd15848224.html, 酿酒酵母S.cerevisiae 高密度培养条件优化研究 王 颖, 何 宁, 李清彪, 邓 旭, 卢英华3 (厦门大学化学工程与生物工程系,厦门361005) 摘 要 考察了培养基组成和培养条件对酿酒酵母S accharom yces cerevisiae 发酵的影响。以TB 培养基为初始培养基,通过正交实验设计优化培养基组成,确定了影响酵母细胞产量最主要的 因素是葡萄糖,最适培养基组成为:酪蛋白胨15g/L ,酵母粉25g/L ,葡萄糖30g/L ,KH 2PO 42.4g/L ,K 2HPO 4?3H 2O 16.34g/L 。并确定了最佳培养条件:温度30℃,转速150r/min 。采用优化 培养基及培养条件下进行发酵,菌液最高OD 600值和细胞密度分别达15.82和2.03×108/mL ,比优化前分别提高24.2%和22.0%。 关键词:酿酒酵母; 培养基; 培养条件; 正交实验 近代基因技术的进步使人们可以利用微生物大量生产高价值的生物药物及其它重组蛋白。发酵产物的多少通常与细胞密度的高低关联,因此发酵过程的首要任务通常是研究如何尽可能地达到高的细胞密度,以便提高生产率、简化下游加工、减少废水排放量、降低培养容积、生产成本及设备投资,使目的产物产生良好的成本效益[1]。 优化培养基是一种提高细胞密度的有效方法。培养基分复合培养基、半合成培养基和合成培养基三种[2]。合成培养基成分和浓度已知且可以控制,常用来获得高细胞密度;复合培养基含有提取物(如蛋白胨,酵母提取物),营养物的成分和质量可能不同,故复合培养基进行发酵过程的重复性较差。然而,复合培养基和半合成培基对促进产物生成是必要的,而且在复合培养基和半合成培基中,细胞生长往往比在合成培基中快[3]。为使细胞生长达到高密度,有必要设计一种含必需成分的平衡性营养培养基,以维持细胞生长,同时避免生长的抑制。 酿酒酵母(S accharom yces cerevisiae )作为人类利用最早的微生物,其营养成分十分丰富,含有菌体蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪、食物纤维、矿物元素、微量元素及生理活性物质等[4]。由于其具有 安全、生长繁殖快、代谢周期短、容易进行大规模培养、菌体蛋白质丰富等优点,一直是基础和应用研究的主要对象,并被广泛应用于酿造、食品、医药、饲料工业等领域[5]。近年来,世界各国均在积极采用微生物发酵技术开发酵母菌市场。此外,酿酒酵母还是外源基因理想的真核生物表达系统,并与盘基网柄菌 D.discoi deum 一起,于2000年被N IH 选为 标准微生物模型系统(http ://https://www.wendangku.net/doc/bd15848224.html,/sci 2ence/)。 国内外对酿酒酵母菌培养的实验研究已有了较多的报道。Raj 等采用合成培养基,可获得140g/L 的细胞干重[6]。Park 等在内置膜过滤反应器内连续培养酿酒酵母,得到13g/(L ?h )的细胞干重[7]。赵宝华等探讨了外加Ca 2+、La 3+对酿酒酵母生长的影响[8]。梅乐和等研究了酿酒酵母微囊化培养过程[9]。此外,也有不少研究集中在基因工程和固定化技术于酿酒酵母生产中的应用[10～12]。本文以TB 培养基(一种培养大肠杆菌的简单复合培养基)为基础,考察了培养基成分和浓度,以及培养条件等对酿酒酵母发酵培养的影响,并利用正交实验对培养基进行了优化,开发出了一个适合高密度培养酿酒酵母菌的简单复合培养基。
_酿酒酵母源饲料添加剂的研究与应用
也证实，在饲料中添加0.05%~0.1%酵母核酸，就能显著提高平均日增重和饲料利用率。在本次试验中，酵母核酸的添加能显著降低断奶仔猪的腹泻率，这和潘树德等（2008）的结果一致。由于酵母所含有的不是单一的核酸，化学成分复杂，因此表现出众多的功能，尤其是诱食方面的功能，因此，试验猪只表现出明显的采食量的增加。而对于腹泻率的降低主要是由于酵母核酸的添加，显著提高了肠道正常菌群数量、肠绒毛数量及高度。 4结论 在试验日粮中添加酵母核酸提取物，能显著提高猪只的日均采食量和平均日增重，降低料肉比和腹泻率，0.5%添加剂量组添加效果优于0.3%添加剂量组。 参考文献 [1]J.D Carve,W.A.Walker.The role of nucleotides in human nutri－ tion[J].The Journal of nutritional Biochemistry,1995,6(2):58-72.[2]Hartma P A,Hays V W,Baker R O,et al.Digestive enzyme devel－ opment in the young pig[J].J.Anim.Sci.,1961,20:114-123. [3]Lindemann M D,Cornellus S G,El Kandelgy S M,et al.Effect of age,Weaning and diet on digestive enzyme levels in the piglet[J]. J.Anim.Sci.,1986,62:1298-1307. [4]Owsley W F,Orr D E,Tribble L R.Effect of age and diet on the development of the pancreas and the sythesis and secretion of de－velopment of the pancreatic enzymes in the young pig[J].J.Anim. Sci.,1986,63:497-504. [5]Jensen M S,Jesen S K,Jakobsen K.Development of digestive en－ zymes in pigs with emphasis on lipolytic activity in the stomach and pancreas[J].J.Anim.Sci.,1997,75:437-445. [6]鲁小翠,齐德生,张妮娅，等.酵母核酸对肉仔鸡生长性能和血液 生化指标的影响[J].中国粮油学报,2007,22(4):85-90. [7]施用晖,乐国伟,刘建文，等.外源核苷酸对肉鸡生产性能的影响[J]. 无锡轻工业大学学报，2000（19）:598-599. [8]潘树德,李学俭,边连全.酵母核酸对断奶仔猪生产性能及肠道菌 群影响的研究[J].中国畜牧杂志，2008,44（5）：37-40. （编辑：高雁，snowyan78@https://www.wendangku.net/doc/bd15848224.html,） 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是单细胞微生物，属于真菌类，耐酸性强，是兼性厌氧菌。活性干酵母、酵母培养物、酵母提取物、酵母细胞壁等都是我国农业部《饲料添加剂品种目录》（2008）所允许使用的饲料添加剂。酵母类产品能有效改善畜禽消化道菌群平衡、增强机体免疫力、提供丰富的营养物质，从而达到防治消化道疾病和促进生长等多重作用，具有无毒、无副作用、无污染、不产生抗药性等特点，是一种绿色的饲料添加剂，在饲料工业中有广泛的研究和应用。文中对酵母源饲料添加剂的作用机理、种类及应用效果做了简述。 1酵母源添加剂的作用机理 1.1保持动物胃肠道微生态平衡 动物胃肠道内寄生了大量的微生物，这些微生物在合适的营养底物下能够保持正常的生长代谢，这将有利于维护各菌系之间的代谢平衡并为动物胃肠道消化吸收功能提供一个良好的微生态环境，使得日粮中的各种养分在胃肠道内能被充分吸收和利用，实现养殖效益的最大化。活性干酵母、破壁酵母粉和酵母培养物都能作为微生态制剂，改善动物胃肠道生态环境。酵母菌为兼性厌氧菌，在动物体内生长繁殖，能消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，并代谢产生乳酸等有机酸，从而有利于乳酸菌等有益菌的生长，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，因此可改善胃肠道环境和菌群结构，促进胃肠对营养物质的消化、吸收和利用。王学东等（2006）在猪饲料中添加活性干酵母的研究显示，与对照组相比，饲喂活性干酵母组胃内厌氧菌及双歧杆菌数明显上升。破壁酵母粉中含有的甘露聚糖（MOS）能够无选择地吸附结合多种霉菌毒素和阻止病原菌定居增殖，改善动物消化道的菌群结构，也能起到维护动物肠道微生态平衡的作用，其作用机理是：许多病源菌利用含有D-甘露糖受体的Ⅰ型纤毛附着于肠道表面，而MOS可为细菌提供甘露 酿酒酵母源饲料添加剂的研究与应用 王鹏银王海燕段文娟卢晓菲崔胜男 王鹏银，北京挑战农业科技有限公司，100081，北京市海 淀区中关村南大街12号中国农业科学院饲料研究所六层。 王海燕、段文娟、卢晓菲、崔胜男，单位及通讯地址同第一 作者。 收稿日期：2010-10-23 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
毕赤酵母表达手册(详细)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，
酵母表达系统
酵母表达系统 基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。 1、酵母表达系统的特点 酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。 应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3. 0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。 2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统) （1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(a utomaticreplicating sequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(for mul tiple integration into ribosomal DNin yeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到1