人胎盘间充质干细胞对小鼠肺纤维化的影响及机制_吴树才_杨永辉_李辉_郭素敏_李秀
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。
间充质干细胞在医学中的应用文献综述
间充质干细胞在医学中的应用文献综述 学院：生命科学学院 年级：2011 姓名：张胜男
前言:干细胞是具有增殖分化潜能的一种细胞,人体200多种细胞均起源于一个全能干细 胞---受精卵,出生后的机体生存也依赖于不同组织中的干细胞,进行自我更新和损伤修复.追溯到1895年人类第一次临床应用骨髓移植治疗肿瘤疾病,干细胞在临床上的应用已有100多年的历史,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员.随着人类技术的发展,人类具备了从成体组织中提取间充质干细胞的能力,并可以在体外进行大量的细胞扩增培养,但是间充质干细胞临床试验研究所面临的基础理论、实验技术、行业法规，法律伦理等问题，使其在真正走向临床应用的道路还很艰难，这条路上还有多少障碍？还有多远？需要的不仅仅是生命科学领域研究人员的努力，也需要相关管理部门同行！ 正文： 1间充质干细胞 间充质干细胞英文缩写MSC，存在于多种组织中。 1.1间充质干细胞的发现过程 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，使用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。 最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC 用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。 然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 1.2 间充质干细胞的生物学特性 间充质干细胞具有其独特的生物学特性
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞（UCMSC ）具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点，是目前“成药”性最高的成体干细胞（ASC ）之一。UCMSC 还有广泛的生物效应，对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确，且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注，已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究，解决了临床前关键技术和理论问题，进入了迈向临床验证的最后一公里，即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化，是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上，对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害（变性、坏死、缺失）、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗，但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间，疗效可能不尽相同，其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展，UCMSC 的临床适应证主要有： （1）机械性创伤：包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤； （2）退变性疾病：如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等； （3）缺血性疾病：心脑血管意外、血管栓塞等； （4）中毒性疾病：如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等； （5）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮，再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等； （6）炎症性疾病：慢性炎症、急性系统性炎症综合征等； （7）代谢性疾病：糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等； （8）组织残缺性疾病：主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之，UCMSC 的适应范围很广，可通过多种机制发挥治疗作用，对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。
脐带间充质干细胞综述(转)
脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图
2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明
间充质干细胞在人胎盘组织中的染色定位
间充质干细胞在人胎盘组织中的染色定 位 本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！ 【摘要】目的探索间充质干细胞(mscs)在人胎盘组织中的分布规律。方法取正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,按中央带、中间带、边缘带、绒毛板层、中间层和基底板层分为9组:aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc。连续切片,以抗cd166、抗cd44、抗cd29分别做免疫荧光和免疫组化染色。显微镜下观察阳性细胞分布区域,采用彩色病理图像分析系统进行图像分析。结果cd166、cd44、cd29阳性表达细胞的分布情况较一致,主要集中于血管内皮下及血管附近间质内。胎盘中央带中间层(ab)阳性细胞较集中,阳性表达的强度较强,其od值与其它组差异有统计学意义(p伦理委员会批准,获取临床正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,所选择的胎盘脐带附着点均在胎盘中央或稍偏位,大小及重量在正常范围内。 方法 分组将胎盘组织分为中央带即脐带附着处(a)、
边缘带即距脐带附着点最远处(c)和中间带即两者之间中点处(b)3大组,每组从胎儿面向母体面再分为绒毛板层(a)、中间层(b)和底板层(c)3小组。 冰冻切片取aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc 9处新鲜组织,大小为1cm×1cm×,以oct包埋于冻台上,速冻后切5μm薄片,贴附于载玻片。 石蜡切片取前述9处组织,大小为1cm×1cm×,中性福尔马林液中固定24h,梯度酒精溶液脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋后切5μm薄片,贴附于涂布多聚赖氨酸的玻片。 染色 免疫组化染色(sabc法) 切片置60℃烘箱内过夜,取出后以二甲苯脱蜡,梯度酒精洗去二甲苯、水化,pbs 冲洗3min×3次,置枸橼酸钠溶液中微波加热以修复抗原,自然冷却后以pbs冲洗3min×3次,滴加抗体(cd29、cd44,阴性对照滴加pbs),室温1h,pbs冲洗3min×3次,滴加免疫反应增效剂,dab显色3～10min,充分水洗,苏木素复染5s,盐酸酒精分化1s,流水促蓝,梯度酒精脱水,二甲苯透明后以中性树胶封片,置显微镜下观察。 免疫荧光染色将冰冻切片稍稍风干后即滴加ι抗(cd166,浓度为1∶400,阴性对照滴加pbs),置37℃水浴箱中1h,pbs冲洗3min×3次,洗去多余抗体,滴加fitc
脐带血间充质干细胞体外分离_纯化及培养
脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养 陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2 (1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019; 3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006) 摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。 关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养 中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03 THE ISOLATION PURIFICATION AND CULTURE OF HUCA MSCs CHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling, LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li (1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz hou University ,Suz hou,Jiangsu ,215006) ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbil ical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs. KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro 脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的 血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem 收稿日期:2003-12-16 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。 12 实用临床医药杂志 Journal of Clinical M edicine in Practice 2004年第8卷第1期
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;
胎盘间充质干细胞的分离和培养
胎盘间充质干细胞得分离,原代与继代培养及鉴定 刘亭 2016、7。21 目录 前言 (2) 1分离制备PMSC组织得选取 (3) 2脐带,胎盘MSC得分离与纯化 (5) 2、1胎盘组织得获取,存储与清洗 (5) 2—2 脐带,胎盘MSC得分离及纯化方法 (6) 3 原代培养与继代培养 (10) 3-1培养基 (10) 3-2培养密度 (11) 3—3培养条件 (11) 3—4换液 (11) 3-5 传代培养 (12) 3-6细胞形态与生长速度 (12) 3-7 MSC得冻存与复苏: (12) 4细胞表面抗原检测 (13) 5生长曲线 (13) 6细胞周期 (13) 7分化潜能 (13) 参考文献 (13) 附件1不同实验室从脐带血,脐带与胎盘等各组织中分离MSC得方法 (15) 脐带血 (15) 脐带 (15) 羊膜 (17) 绒毛膜 (18) 蜕膜层 (18) 胎盘 (19) 整体灌注法 (20) 附件2 背景知识 (20) 附件3 PMSC实验所需试剂 (21)
前言 干细胞(Stem cell,SC)就是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系得细胞。在一定得条件下,干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。按照来源与分化潜能不同,干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)与成体干细胞(Adult stem cell,ASC)两类。胚胎干细胞来源于早期得胚泡与胚胎内层得细胞群,并且具有向3个胚层细胞分化得能力。但就是胚胎干细胞应用时产生得免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及得伦理问题等影响并制约了临床应用。成体干细胞形成于原肠胚形成后得胎儿与成体组织,早期研究认为,成体干细胞主要分化为其来源组织得细胞类型。然而,近几年来得很多研究表明,成体干细胞具有能够分化成为除来源以外得其她胚层组织得能力。 间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)又称为基质干细胞,就是属于成体干细胞得一种,最早从骨髓中分离而来、MSC就是由早期中胚层发育而来得非造血成体干细胞,该细胞在体外可以贴壁生长,并呈现梭状。胞质丰富,细胞核呈圆形,1-3个核仁、在适当得条件下可以大量扩增,并转化为间充质祖细胞,进而分化成包括三个胚层得各种组织细胞,如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。 MSC具有低得免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节与造血支持等功能,而且易于外源基因导入表达,就是基因治疗中重要得载体细胞。此外,一些研究学者还发现,MSC具有类似免疫抑制剂作用,可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中得免疫反应,并同时抑制T细胞得异基因增殖反应、所以,MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛得应用前景。近年来MSC已逐步成为干细胞研究得热点(张慧娟等,2014)、 目前所报道得间充质干细胞主要来源于骨髓,采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便,但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦得手术,并在取材过程中及取材后会有很高得感染机会;由于人体骨髓中间充质干细胞得含量极其稀少,每105-106个单个核细胞中大约只有1个;而且随着年龄得增加,骨髓中间充质干细胞得数量、增殖与分化能力均显著下降,使其在研究与应用尤其就是临床应用中受到限制。其她组织中,如动员得外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞,然而,从这些组织中获得得细胞数量较为有限。以上因素,都限制了间充质干细胞
人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟
中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5955www.CRTER .org 张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。 通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031 并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 [https://www.wendangku.net/doc/b716000800.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31 Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China Accepted: 2014-07-31 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性 张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1， 3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大 学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031) 文章亮点： 1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，含有来源细胞的膜蛋白成分，可以选择性地将含有的蛋白质、RNA 等递送至受体细胞，调节细胞间的信号传导。故可将间充质干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因此，通过间充质干细胞来源的外泌体促进组织损伤修复是今后具有重要探讨价值的研究方向。 2 分离提取及鉴定外泌体是进行深入研究的基础，实验主要通过超滤及差速离心法分离出外泌体，通过透射电镜及流式鉴定相结合来鉴定，为后续的外泌体功能研究奠定基础。 3偏倚或不足：人脐血间充质干细胞源性外泌体生物学功能及相关机制还需要进一步分析；人脐血间充质干细胞的外泌体最终要移入体内研究，所以尚需建立动物模型。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；外泌体；人脐血间充质干细胞；分离鉴定；活性 主题词： 胎血；间质干细胞；外泌体；膜蛋白质类 摘要 背景：外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，越来越多的研究表明，间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用，目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。 目的：分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体，并鉴定其生物学特性。 方法：收集人脐血间充质干细胞培养上清，采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体，通过透射电镜观察其形态，流式细胞术检测其表面标志 CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。 结果与结论：人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体，电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径40-100 nm 。外泌体表达其共性表达标志CD63、CD81及间充质干细胞表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体，间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。 张娟，刘峰，张薇，丛旭，王彩生，魏来. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性[J].中国组织工程研究，2014，18(37):5955-5960. Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics Zhang Juan 1, Liu Feng 2, Zhang Wei 2, Cong Xu 2, Wang Cai-sheng 1, 3, Wei Lai 2 (1Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2 Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China; 3the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China) Abstract BACKGROUND: Exosomes are membrane vesicles secreted by mesenchymal stem cells. Increasing studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete exosomes via paracrine function to play a role in tissue injury. However, reports on how to isolate and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells are few. OBJECTIVE: To extract, purify and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. METHODS: The cell culture supernatant of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was collected. Exosome was extracted and purified with ultrafiltration and gradient centrifugation methods. The morphology of exosome was observed by transmission electronic microscope, and the expressions of CD63, CD81, CD90, CD73, CD105, CD29, and CD166 in exosome of mesenchymal stem cells were analyzed by fluorescent activated cell sorting. RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood secreted exosome
骨髓间充质干细胞治疗肺动脉高压的研究进展
骨髓间充质干细胞治疗肺动脉高压的研究进展 来源：创新医学网 肺动脉高压(pulmonary artery hypertension, PAH)是一组以肺血管阻力持续增加为主要特征的临床综合征,其病因和发病机制未明,临床治疗困难,预后较差。近年来随着分子生物学及细胞生物学的发展,特别是干细胞的研究,给PAH的治疗带来了新的曙光。本文现就骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)治疗PAH的进展进行综述。 1 BMsCs的生物学特性 早在1867年,德国科学家Cohnheim发现骨髓中除了造血干细胞以外还有一些非造血干细胞。此后Fried enstein进一步描述了这些呈纺锤状贴壁生长的细胞,并发现在一定条件下能分化形成类似骨及软骨的沉积物,这种细胞就是BMSCs[1]。骨髓中间充质干细胞占有核细胞总数的0.001%~ 0.010%,并随年龄的增长而减少,分析间充质干细胞的细胞周期发现,20%为G0期细胞,大多数细胞处于G0/G1期,表明间充质干细胞具有高度的分化潜能。 BMSCs既有间质细胞的表面抗原特征,又有内皮细胞、上皮细胞、肌细胞的表面抗原,但不表达造血细胞表面抗原标志(CD14,CD34,CD45),也不表达与人白细胞抗原相关的因子(B7-1,B7-2,人白细胞抗原DR等),缺少特异的表面标志分子。 BMSCs表达的主要分子包括:① 黏附分子,如 CD166、CD54、CD1o2、CD44、CD 106等。② 生长因子和细胞因子受体,如白介素受体(IL-1R、IL-3R、 IL-4R、IL-6R、IL-7R),y干扰素受体(IFN-yR)、肿瘤坏死因子α(TNR-α)等。③整合素家族成员,包括CD49、CD29、CD104等。④ 其他,如C D90、 CD105等[2]。根据这些单克隆抗原阳性特征,可以对骨髓单个核细胞进行分离纯化,得到纯度较高的BMSCs。 2 BMsCs的多向分化潜能 BMSCs在一定条件下可定向分化为骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、骨髓基质及星形细胞, 另外还可以向外胚层内胚层的细胞分化。Khoo等采用以生长因子刺激为基础的三阶段神经元分化程序 (使用 FGF-2/EGF/PDGF/SHH/FGF-8/ GDNF)刺激BMSCs,发现所形成的神经元细胞在形态及基因表达等方面是不成熟的,能够形成神经球样结构,并高表达NES及NR4A2[3]。Xing等采用聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)作为支架,分离培养大鼠BMSCs,并用5胞苷及0,1umol/L血管紧张素Ⅱ刺激24h后完全培养基培养,形成心肌样细胞, 表达心肌细胞的标志物抗原肌钙蛋白I[4]。Li等将大鼠BMSCs接种于3D PLGA支架,培养3周后发现细胞表达较高水平的肝细胞标志物如白蛋白、甲胎蛋白、角蛋白18、肝细胞核因子α及细胞色素P450[5]。干细胞之所以具有多向分化潜能,与其复杂的调控网络有关。细胞因子、黏附分子、转录因子等因素参与,包括多潜能性转录因子Oct4、Nanog和Sox2等,组成复杂的调控网络来调节与干细胞多潜能性和自我更新相关的分子的表达[6]。如IL- 17能够刺激BMSCs表达瘦素[7]。TGF-β1能够刺激BMSCs向成骨细胞及成软骨细胞分化,而抑制其向脂肪细胞分化[3]。另外,表观遗传修饰,如组蛋白和DNA甲基化等,可以协同转录调节 1
间充质干细胞治疗小脑萎缩
间充质干细胞治疗小脑萎缩（山东干细胞网） 遗传性小脑共济失调，即遗传性小脑萎缩，是一组以共济运动障碍为突出表现的慢性进行性小脑变性疾病，发病年龄多在33—34岁，病情进行性加重。发病机理目前并不清楚，病变主要累及小脑，但脊髓、颅神经、基底节、脑干、大脑皮质等也可受累。遗传方式为常染色体显性遗传，因此，如果有本病家族史的人尽量不要生育。 患者：宋某，男性，40岁，患有遗传性小脑共济失调，即遗传性小脑萎缩。其具有明显的家族遗传性，其外公、姨、母亲、两个哥哥均患有该病。 入院时，患者口齿不清，行走经常跌倒 ，双手动作笨拙，症状逐渐加重，并出现双下肢无力，下蹲后不能自行站起。后经间充质干细胞移植成功治疗，基本恢复正常的生活。 目前采用的治疗方法是给予体外培养扩增的间充质干细注射，每周1次，共4次为一个疗程，同时给予系统功能锻炼。 干细胞治疗后在这位患者出院的时候，已经能行走稳健，未再出现跌倒情况，口齿清楚。后来，这位患者的两位哥哥也来做间充质干细胞治疗，恢复的效果也不错。 干细胞治疗重度颅脑外伤后遗症期 患者，男性，35岁。诊断：重度颅脑外伤后遗症期 重度颅脑外伤术后言语及肢体活动障碍8个月，拟行神经外科行颅骨修补和干细胞移植治疗。 干细胞移植治疗前： 四肢肌张力均高，以左侧为著，右上肢、右下肢活动较灵活，左侧肢体处于肌紧张状态，疼痛刺激后有屈曲。 影像学检查：双侧大脑见多发片状低密度区，CT值10-15Hu，边尚清。左侧侧脑室后部与左脑内低密度区贯通，脑内见引流管影。脑室系统略扩张，右侧脑室后角增大明显。右侧颅骨见巨大缺损区，左侧颅骨呈术后状态。[印象]双侧大脑多发软化灶、脑积水分流术后。 干细胞移植治疗后效果： 颅骨修补并干细胞脑内移植治疗后4天，患者左侧上肢肌张力明显降低，第二次干细胞移植后，次日患者左上肢肌张力进一步降低，左下肢肌力增强，达三级，屈伸自如(之前在强刺激下能才在水平面屈曲)。该患者再经过一阶段锻炼，有望下地行走。
脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验
脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应