salmonella

实验技术与方法

一种有效检测沙门菌的显色培养基的研究

刘　振1

　于　奂1

　肖　强2

　刘　沛1

　何艳玲1

　李　瑾

1

(11中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司,北京　100025;

21江西师范科技大学,江西　南昌　330013)

摘　要:目的　研究一种显色培养基分离筛选沙门菌。方法　合成一种C8酯酶的显色底物研制检测沙门菌的显色培养基CS A ,采用116株标准菌株试验以及按照IS O 方法(IS O 6579:2002)对342份样品进行检测,对比该显色培养基CS A 与传统选择性培养基的选择性。结果　研制的显色培养基能有效检测包括伤寒、甲型副伤寒在内的沙门菌,且灵敏度与特异性分别达到100%和9818%,均明显高于传统沙门菌分离筛选的培养基。结论　研制的沙门菌显色培养基较传统选择性培养基在检测的灵敏度和特异性上均有很大的提高。

关键词:沙门菌属;微生物学技术;培养基

Study on H igh 2Perform ance Chromogenic Media for Salmonella Detection

LI U Zhen ,Y U Huan ,XI AO Qiang ,LI U Pei ,HE Y an 2ling ,LI Jin

(Beijing Landbridge T echnical C o.,Ltd.Chinese Academy of Inspection and Qurantine ,Beijing 100025,China )Abstract :Objective T o explore a novel chrom ogenic medium for screening of Salmonella spp.Method The substrate of the

C8esterase was synthesized ,and the chrom ogenic salm onella agar (CS A )for detecting Salmonella spp.was developed.116standard strains were used to test the CS A.342food sam ples on sale were detected by CS A and other 3kinds of traditional selective media in order to com pare their selectivities ,using the method of IS O (IS O 6579∶2002).R esults Salmonella spp.including S .typhi and S .paratyphi A ,could be effectively detected by the CS A method.The sensitivity and specialty were 100%and 9818%,and both were better than 3kinds of traditional selective media.Conclusion I t was concluded that the sensitivity and specialty of the CS A were greatly im proved.

K ey w ord :Salm onella ;M icrobiological T echniques ;Culture Media

作者简介:刘振　男　工程师

沙门菌是一种重要的食源性致病菌,一直是世

界公共卫生关注的问题[1,3]

。传统培养方法筛选分离沙门菌一般利用其产H 2S 、不发酵乳糖等特

征[2,11],采用的培养基主要有SS 琼脂(Salm onella Shigella Agar )、HE 琼脂(Hektoen Enteric Agar )、X LD 琼脂(X ylose Lysine Deoxycholate Agar )等,这些培养基

存在不足之处是有大量假阳性给实际检验带来繁重的工作量,同时某些沙门菌如甲型副伤寒沙门菌产

H 2S 较弱,在培养基上容易造成漏检[4,14]

。近些年来,在分子生物学技术领域中利用显色酶底物筛选重组克隆子的优点,也带给微生物分离

筛选方法一些启示[3,4,13]

。Rambach 琼脂就是一种最早利用显色酶底物与菌体代谢产生酶反应显色而筛选沙门菌的显色培养基,其原理是利用沙门菌丙二醇阳性与半乳糖苷酶阴性等特点,主要缺点是不能检测S .mosocow 、S .wassenar 以及S .typhi 等沙门菌[2,3,7]。Ventitia M 等人通过研究肠道菌C4-C10

等酯酶的活性发现沙门菌C8水平上的酯酶具有高

度的一致性[6,9,10]。Aguirre 等[14]

人利用C8酯酶底物4-甲基伞形酮-辛酯(4-methylumbelliferyl 2caprylate )进行C8酯酶斑点测试,通过沙门菌C8酯酶水解底物观察荧光判别阳性培养物,但存在荧光较弱时误判。

本研究利用新的C8酯酶显色底物研制出沙门菌显色培养基,所配制的平板具有很高的灵敏性与特异性,可以有效检测沙门菌,包括伤寒、副伤寒沙门菌,具有很高的特异性。1　材料与方法111　培养基

11111　C8酯酶显色底物合成

[5]

,结构式如下。

R

R N

H

CH 2(CH 2)5CH 3

C O OH

11112　培养基制备　沙门菌显色培养基CS A(北京陆桥技术有限责任公司自主研制),加热煮沸灭菌,灭菌后倾注平板,待培养基充分凝固后,放置冰箱避光冷藏备用。SS琼脂(Cat N o1211597)、X LD琼脂(Cat N o1295646)和HE琼脂(Cat N o1221365)均购自美国BD公司,配制按照厂家说明进行。营养肉汤C M106,北京陆桥。

112　标准菌株　116株标准菌株,包括81株沙门菌与35株非沙门菌见表1。

表1　116株标准菌株在沙门菌显色培养基CS A上的显色反应

菌株名称菌号显色反应菌株名称菌号显色反应沙门菌非沙门菌

S.typhi50035紫红色E scherichia coli44101蓝绿色

50038紫红色44102蓝绿色

50039紫红色44103蓝绿色

50071紫红色44104蓝绿色

44381蓝绿色

111017a蓝绿色S.paratyphi A50001浅紫红色Enterobacter cloacae45301蓝绿色

50002浅紫红色12021蓝绿色

ATCC10699b蓝绿色

ATCC33457b蓝绿色S.paratyphi B50004紫红色Citrobacter freundii11732蓝绿色

50076紫红色48010蓝绿色

48013蓝绿色S.enteritidis50040紫红色K lebsiella pneumoniae46101蓝绿色

50041紫红色46105蓝绿色

50100紫红色46108蓝绿色

50128紫红色46114蓝绿色

50335紫红色

50336紫红色

50338紫红色

50760紫红色

S.typhimurium111174a紫红色Enterobacter aerogenes45102蓝绿色

111190a紫红色45103蓝绿色

50115紫红色12022蓝绿色

50220紫红色

50707紫红色

50709紫红色

50712紫红色

50222紫红色

S.derby50112紫红色Proteus mirabilis49003无色

50320紫红色49005无色

50718紫红色49106无色

50719紫红色

ATCC6960b紫红色

S.london50106紫红色Providencia rettgeri ATCC14505b无色

50310紫红色

50324紫红色

50357紫红色

S.arizonae47001紫红色P seudomonas aeruginosa10101无色

47002紫红色10116无色

47003紫红色10211浅红色S.choleraesuis50018紫红色P seudomonas alii11813无色

50307紫红色

50191紫红色

50732紫红色

S.dublin50042紫红色P seudomonas mendocina ATCC25411b无色

50761紫红色

50104紫红色

ATCC15478紫红色

ATCC15480紫红色

续表1菌株名称菌号显色反应菌株名称菌号显色反应

S.pullorum(n=5)ATCC13036b紫红色Staphylococcus aureus26112生长抑制

ATCC9120b紫红色189生长抑制

ATCC10398b紫红色26003生长抑制

ATCC19945b紫红色ATCC27217b生长抑制

C79-14c紫红色

S.hadar ATCC51956b紫红色Enterococcus facecalis32220生长抑制

ATCC51958b紫红色32221生长抑制

50882紫红色

S.anatum50083紫红色

50353紫红色

50774紫红色

S.thompson50023紫红色

50322紫红色

50326紫红色

50735紫红色

50846紫红色

50853紫红色

S.infantis50204紫红色

50341紫红色

50348紫红色

ATCC51741b紫红色

S.senftenberg(n=4)50050紫红色

50201紫红色

50315紫红色

50913紫红色

S.newport50029紫红色

50124紫红色

50321紫红色

S.manhattan50151紫红色

50152紫红色

50380紫红色

50825紫红色

50827紫红色

S.aberdean50107紫红色

50312紫红色

50786紫红色

注:11“a”表示购自中国普通微生物菌种保藏中心;“b”表示购自美国典型培养物保藏中心;“c”表示国家兽医微生物菌种保藏中心;其他购自国家医学菌种保藏中心。21所有菌株的培养物均保存在含有15%甘油的肉汤中,温度为-80℃。

113　试剂　诊断血清,泰国S&A公司。API20E生

化试剂条,Biomerieux公司。

114　检测样品　342份检测样品均为市售的自然

污染食品,种类包括生肉(牛肉、鸡肉、羊肉和猪肉)、

鸡蛋、蔬菜、豆制品以及水果沙拉。

115　分析方法

11511　标准菌株分析　将-80℃冰箱中保存的培

养物接种至营养肉汤(C M106,北京陆桥技术有限责

任公司),(36±1)℃培养18～24h活化,活化后的菌

株转种至制备好的培养基平板上置(36±1)℃培养

24～48h,观察结果,典型沙门菌的菌落在该平板上

显(浅)紫红色,非沙门菌的细菌在该培养基上菌落

呈蓝绿色、无色或生长受到抑制。

11512　样品检测分析　按照IS O6579∶2002规定的

程序[8]进行样品制备和增菌培养,之后转接至制备

好的平板上,挑取可疑沙门菌的菌落进行血清学试

验[12](诊断血清,泰国S&A公司)以及生化鉴定试验

(API20E生化鉴定条,Biomerieux)。可疑菌落形态

为(浅)紫红色菌落,圆形突起。每个平板上挑取5

个典型菌落进行试验,以血清学凝集反应阳性确证

显色培养从样品中分离的可疑沙门菌,从而报告检

测样品沙门菌阳性。

2　结果

211　标准菌株试验结果　(36±1)℃培养至36h

时,所有沙门菌在显色培养基上的菌落均显现紫红

色,颜色有深浅,包括伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门

菌。铜绿假单胞菌在该培养基的菌落与沙门菌类

似,但菌落颜色很浅,且室温放置18～24h后,菌落

周围产铜绿色素。革兰阳性菌在该培养基上生长受

到抑制。

212　样品检测结果　342份样品中经制备的平板

筛选后,对可疑沙门菌进行血清学试验,结果如表2所示,表明显色培养基上没有假阴性,灵敏度为100%,基于该表中的数据,统计分析其特异性为9818%。其他3种培养基的灵敏度分别为:SS琼脂8614%、HE琼脂8216%、X LD琼脂8614%;特异性指数分别为:SS琼脂9316%、HE琼脂9210%、X LD琼脂9414%。沙门菌显色培养基的假阳性菌株主要是铜绿假单胞菌,其他3种传统培养基均存在假阳性与假阴性的情况,造成假阳性的菌主要是Proteus mirabilis,另外产H2S较弱的沙门菌如S.typhi和S.paratyphi A等在检测中易出现假阴性造成漏检。

表2　4种培养基检测沙门菌的结果

样品

阳性与阴性样本数量

可疑沙门菌样品数(其中假阳性)假阴性样品

SS HE X LD CS A SS HE X LD CS A

肉(n=125)15(10)17(13)13(8)7(1)1210禽蛋(n=85)5(3)5(3)4(2)3(0)1110蔬菜(n=92)12(8)13(9)12(8)7(2)1110豆制品(n=15)4(1)5(2)4(1)4(1)0000水果沙拉(n=25)2(0)3(1)2(0)2(0)0000总计(n=342)38(22)43(28)35(19)23(4)3430

3　讨论

利用C8酯酶显色酶底物研制的沙门菌显色培养基用于沙门菌检测,灵敏度与特异性均大大高于传统培养基。特别是该培养基能有效检测伤寒沙门菌(包括S.paratyphi A)。在样品检验过程中我们发现传统培养基筛选沙门菌时,样品中带有Proteus mirabilis常会造成筛选结果假阳性,给后续生化与血清学试验带来繁重的工作量[7,8]。Proteus mirabilis 在该显色培养基平板上的菌落为无色,沙门菌在该平板上形成清晰可见的(浅)紫红色菌落,且色泽在室温放置不会褪色,因而显色培养基可以将其与沙门菌有效区分。尽管铜绿假单胞菌在该培养基上菌落呈浅紫红色,但培养后放置室温一段时间(18～24 h)可以发现其产铜绿色素。同时,我们也验证了4 -甲基伞形酮-辛酯筛选沙门菌的效果,对比发现该显色底物对培养基的pH要求较为敏感,一般要求在碱性的环境,在紫外光(波长λ=365nm)下观察,弱荧光的培养物容易漏检,在实际检测过程需要配备荧光观察的装置。

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3232.

[收稿日期:2007-05-31]

中图分类号:R15;Q93-335;R44615 文献标识码:B 文章编号:1004-8456(2007)06-0520-04