六种不同耐热聚合酶的比较

合理选择耐热DNA聚合酶是PCR成败与否的一个关键因素。选择最合适的耐热聚合酶，是进行PCR实验首先要考虑的问题。许多耐热DNA聚合酶的主要区别在于特异性、保真性、

耐热性、扩增速率、扩增片段长度等几个指标。

下面是六种不同耐热聚合酶的比较：

Taq：扩增效率最高的耐热DNA聚合酶，能很好的扩增6kb以下的DNA 片段。扩增碱基出错率为10-5左右。

Pfu：目前保真度最高的耐热DNA聚合酶，碱基出错率为10-6，但扩增效率低于T aq酶，一般能很好的扩增2kb以下的片段。

Taq Plus：集扩增效率高和保真度好于一身。扩增效率比Pfu高，保真度比Taq好。能有效的扩增10kb以下的片段。

Hotstart T aq：经过化学修饰的耐热DNA聚合酶。此酶在常温下，活性被化学基团封闭，要在94℃-95℃加热数分钟才能回复正常活力开始反应，避免了起始循环较低温度下的非特异性扩增，提高了反应的灵敏度和特异性。

Long Taq：具有3’-5’外切酶活性的耐热DNA聚合酶，它不但扩增效率高而且错配率低，对于简单模板可扩增长达40kb的模板，对复杂模板也可扩增长达15kb的片段。

Taq Platinum：热启动高保真耐热DNA聚合酶。如果对保真度要求很高，而用Pfu扩增有难度，可选用T aq Platinum，一般扩增长度可达4kb。

根据不同的实验目的选择最合适的酶，

克隆普通长度的目的DNA 片段：Taq、Taq Plus

保真度要求较高，片段比较短，如点突变、基因筛选等：Pfu、T aq Platinum

高保真长片段扩增，如构建基因图谱及分子遗传学研究等：Long Taq、Taq Plus

扩增基因组模板，需要降低背景：Hotstart Taq、T aq Platinum

扩增GC含量较高或二级结构较复杂的模板：T aq Plus、Long T aq、T aq Platinum

实时荧光定量PCR反应：Taq、Hotstart Taq、Taq Platinum

从菌株或质粒模板，筛选鉴定目的克隆，扩增6kb以下的片段：T aq、Taq Plus、2×Taq PCR MasterMix

模板比较复杂或目的片段丰度低，用普通T aq酶扩增不出条带：2×T aq PCR MasterMix、2×Pfu PCR MasterMix

浅谈6——植酸酶与3—植酸酶的区别

浅谈6——植酸酶与3—植酸酶的区别 植酸酶是水解植酸极其盐类的酶，属于磷酸单脂水解酶。自然界有6位和3位二种植酸酶。6—植酸酶与主要存在于植物籽实的胚中，在干燥后籽实冬眠状态下没有活性，只有在种子萌发室被激活，并水解种子中的植酸。水解反应首先是从肌醇的6碳位上催化无机磷盐，最终脂解整个植酸稳定性很差，在干燥、高温、PH值较低的情况下无活性，且易于因过多的植酸盐底物和产物而受到强烈的抑制，难以在动物胃内PH较低的情况下起作用。3—植酸酶由霉菌、酵母和细菌产生，首先从肌醇的3碳位上催化释放无机磷。目前研究较多的是无花果曲霉菌(Aspergillus fieuum)和黑曲酶（A.niger）产生的植酸酶。3—植酸酶由于性质稳定，耐酸、耐高温，已被饲料工业广泛采用。 目前中国植酸酶市场的主导产品是3—植酸酶如酶他富5000G，但也有与植物性植酸酶同源的6—植酸酶产品开始销售。6—植酸酶和—3植酸酶是二类完全不同的植酸酶产品。它们的作用机理、作用条件、利用效果和在畜禽饲料中的添加量都有很大区别。本文主要从pH作用高峰、耐热性、稳定性、生物水解效率和实际应用效果等方面对不同植树酸酶进行比较，以便饲料厂准确计算添加量和添加成本。 1. pH作用高峰 畜禽消化道正常的pH是5.5-6°在猪胃中，由于盐酸的作用使pH降至2-3°在家禽，植酸酶主要在嗉囔起作用，它的pH是4.5-5°上图是二种植酸酶在不同pH环境下活性变化的曲线。3-植酸酶他富有2.5和5.5二个pH作用高峰，而6-植酸酶仅有pH5.5一个作用高峰。在pH低于3的

酸性环境和高pH-6（相当于猪、鸡小肠）的环境中，3-植酸酶酶他富的活性明显高于6-植酸酶产品。这说明二种植酸酶在相同pH环境下作用效果不完全相同。史凯来等（2000）报道，在鸡嗉囔的pH条件下，3位的T植酸酶和6位的N植酸酶的酶活相标准酶都是100%。而在动物真胃的pH条件下，T植酸酶和N植酸酶的相对酶活分别是77.82%和49.61%63.7%。 2. 稳定性 由于采取了特殊的后镶嵌成型保护工艺，3-植酸酶酶他富500G具有很好的稳定性。在高温、高温的严酷条年下和在预混料中的稳定性都显著高于6-植酸酶产品。二种产品在温度35℃，相对温度70%，打开包装储存4周后，3-植酸酶酶他富存留51%，6-植酸酶存留仅37%。在预混料密封包装，高温35℃条件下存放4周，3-植酸酶酶他富活性存留77%，而6-植酸酶产品只有62%。

聚合酶链式反应

聚合酶链式反应 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 反应准备 其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。 PCR反应五要素： 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。 PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。 模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制

RNA的聚合酶链式反应

RNA的聚合酶链式反应：目前常用的RNA检测方法有原位杂交，点杂交，Northern印记杂交以及核酸酶保护试验等。这些方法的普遍缺点是难以检测低丰度的信使RNA，并且操作繁琐，将RNA反转录和PCR结合起来建立RNA聚合酶链式反应（RT-PCR）则可以克服上述缺点。 RT-PCR先在反转录酶的作用下以信使RNA为模板合成cDNA，再以CDNA为模板进行PCR反应。此法快速，简便，并且灵敏度高。此法可以检测单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA。 RT-PCR 应用：分析基因的转录产物 克隆cDNA及合成cDNA探针， 改造cDNA序列等 RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板必须是完整。并且不含DNA，蛋白质等杂质。若RNA模板中污染了微量DNA，扩增后会出现特异DNA的PCR产物。而cDNA扩增产物却很少，必要时可用无ＲＮａｓｅ的ＤＮａｓｅ处理反转录产物，消除ＤＮＡ后在进行ＰＣＲ。如果蛋白质未除尽可与ＲＮＡ结合，从而影响反转录和ＰＣＲ反应。 常用的反转录酶有二种，也就是ＡＭＶ，和ＭｏＭＬＶ的反转录酶 ＡＭＶ反转录酶由二个不同亚基组成，具有较强的ＲＮａｓｅＨ活性。可水解ＲＮＡ模板，以ＲＮＡ模板合成单链ＤＮＡ的酶活性最适作用温度为４２摄氏度。ＭｏＭＬＶ反转录酶由一条多肽链组成，最适作用温度为３７摄氏度。ＲＮａｓｅＨ活性较低，适于合成大片段

全长ｃＤＮＡ 但是当模板ＲＮＡ的二级结构影响反转录反应时，用ＡＭＶ反转录酶更合适，因为较高的反应温度会消除ＲＮＡ二级结构的影响。此外ｉａ这二种反转录酶的缓冲液有所不同。 最近，从嗜热栖热菌ＨＢ８中分离得到Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，９５摄氏度时该酶的半衰期为２０分钟具有５—３外切酶活性，无３—５外切酶活性，利用Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶同时具有反转录酶的特点，可以简化ＲＴ－ＰＣＲ，并且比Ｔａｑ聚合酶反应敏感度高１００倍。所以更优越。Ｔｔｈ聚合酶作用温度高，可消除ＲＮＡ的二级结构对反转录反应的影响，增加ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的反转录的活性，可增加ＲＴ－ＰＣＲ反应灵敏性。 ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的缺点：反转录酶活性需要二价锰离子，而二价锰离子会降低ＤＮＡ聚合酶的忠实性， ＴｔｈＤＮＡ聚合酶催化聚合反应的错误掺入率为１／５００

植酸酶在饲料中的应用及其研究进展(精)

植酸酶在饲料中的应用及其研究进展 植酸酶是一种新型的、可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂。它对提高饲料中磷利用率，提高动物的生产性能，以及减轻高磷粪便对环境水域的磷污染有重要意义。本文综述了植酸酶在饲料中的应用现状及工业化生产方法，讨论了其进一步的研究发展方向。 植酸酶是一种水解酶，它能将植酸磷（六磷酸肌醇）降解为肌醇和无机磷酸。此酶分两类：3-植酸酶和6-植酸酶。植酸酶广泛存在于植物和微生物中。磷在植物中的主要存在形式为植酸磷，由于植酸磷不能被单胃动物直接利用，从而造成磷源浪费和形成高磷粪便污染环境。另外，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中会与多种金属离子如Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的利用。因此，开展饲用植酸酶的研究，对提高畜禽业生产效益及降低磷对环境的污染有重要意义。１植酸酶的来源及酶学性质 早在1907年Suzuki等就在谷粮中发现了具有植酸酶活性的磷酸酶。第一个纯化的植酸来源于麸皮，研究发现它虽具有植酸酶活性，但植酸并不是它特异性底物。来源于植物的植酸酶均属于６－植酸酶，最适pH范围在5.0~7.5，在单胃动物酸性的胃环境中不起作用。60年代末植酸酶的研究转向最适pH为酸性、酶含量较高的微生物来源的植酸酶。 许多微生物都能产生植酸酶，尤其在曲霉属中。1968年Shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所用的22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于Aspergillus terreus NO.9A-1,它的最适pH为 ４.5，最适反应温度为70℃,此酶在pH1.2~9.0均能稳定维持活性。从此以后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶，其中来源于Ａ.ficcum NR-RL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶phyA具有较好的耐热性，在酸性的条件下有较高酶活性，被认为是目前最具应用前景的饲用植酸梅，其酶学性质的研究也较为深入。 植酸酶phyA属于３－植酸酶，是一种糖基化蛋白，表观分子量为85KD。它的最适pH为2.5和5.5,最适反应温度为55℃。在37℃、pH2.5的条件下，以植酸为底物的Ｋm值为50mmol,Ca2+、Fe2+对酶活性无影响,Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分别提高30%和13%。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cu+对酶活性有抑制作用，其中前两种为非竞争性抑制，后两种为竞争性抑制。对酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如Ｌ（＋）－酒石酸对它却没有抑制作用。它是目前发现的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的终产物是单磷酸肌醇和无机正磷酸。 ２植酸酶在饲料中的应用效果

聚合酶链式反应

实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。

ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。

第10章 酶的作用机制和酶的调节

第10章酶的作用机制和酶的调节 教学目的：掌握酶的活性部位结构与功能、酶活性的别构调节、酶原激活，了解酶高效性原因 教学重点：酶活性部位的结构与功能及酶的活性的别构调节 教学难点：酶活性的别构调节 教学方法：多媒体 教学内容： 一、酶的活性部位及确定方法 （一）酶活性部位概念及特点 1、酶的活性中心(活性部位):指酶分子中的表面有一个必需基团比较集中、并构成一定空间结构的微小区域。酶活性中心的基团,按其功能可分为结合基团和催化基团。 活性中心的基团都是维持酶活性的必需基团， 2、酶活性部位的共同点： （1）酶活性部位仅占酶体积的很小一部分，通常只占整个酶分子体积的1~2%，酶分子是大分子物质，由很多氨基酸构成，而活性部位仅由几个氨基酸残基组成 催化部位一般由2~3个氨基酸残基组成。 结合部位氨基酸残基数目，不同的酶有所不同。可能是一个，也可能是多个。 （2）酶的活性部位具有三维结构，构成酶活性中心的基团，可位于同一条肽链上，也可位于不同的肽链上，在一级结构上可能相距甚远，但在空间结构上位置必须相互靠近；酶的空间结构受物理或化学因素影响时，酶的活性部位可能会遭破坏，酶会失活。（3）活性中心的结合基团与底物专一性结合，这需要活性部位的基团精确排列。活性部位具有一定的柔韧性,活性部位的结构并不是与底物的结构正好互补。 在酶与底物结合过程中，酶活性中心的构象在底物的诱导下可发生形变，然后嵌合互补形成中间产物，而底物在酶活性中心的诱导下也可发生形变，变的易与酶结合，有时是两者的构象同时发生变化后才互补契合（诱导契合学说）。 （4）酶活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，底物分子或底物分子的一部分结合到裂缝中，裂缝内的非极性基团较多，形成一个疏水环境，提高与底物的结合能力，也有极性的氨基酸残基，以便与底物结合并催化底物发生反应。 （5）底物通过较弱的次级键与酶结合。 组成酶活性中心的氨基酸残基，常见的有：组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 3、研究酶活性部位的方法 （1）共价修饰 （2）亲和标记法 （3）切除法 （4）X射线晶体结构分析法 二、酶促反应机制 （一）基元催化的分子机制：酶的催化作用包括若干基元催化。 1、酸碱催化 2、共价催化 3、金属离子催化 （二）酶具有高催化能力的原因 1、底物与酶的邻近效应与定向效应 2 、底物分子中的敏感键发生“张力”与“形变”

10第十章 酶的作用机制和酶的调节

第十章酶的作用机制和酶的调节 目的和要求：理解、掌握酶活性部位的相关概念和特点；掌握酶催化高效性的相关机理；了解几种酶的催化机制，理解结构和功能的适应性；了解酶活性的调节方式，掌握酶活性的别构调节、可逆共价调节和酶原激活调节方式及生物代谢中的作用。 一、酶的活性部位 ㈠酶的活性部位的特点 1、概念：三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的结合与催化作用，这一与酶活力直 接相关的区域称酶的活性部位。 结合部位：专一性 催化部位：催化能力，对需要辅酶的酶分子，辅酶或其一部分就是活性中心的组成部分；组成酶活性部位的氨基酸数目对不同酶而言存在差异，占整个酶氨基酸残基小部分 酶活性部位的基团：亲核性基团，丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团：天冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。 2、特点 ⑴活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分（1%～2%） ⑵酶的活性部位是一个三维实体 ⑶酶的活性部位并不是和底物的形状互补的 ⑷酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂隙内 ⑸底物通过次级键结合到酶上 ⑹酶活性部位具有柔性 ㈡研究酶活性部位的方法 1、酶分子基团的侧链化学修饰 ⑴非特异性共价修饰：活力丧失程度与修饰剂浓度有正比关系；底物或可逆的抑制剂可保护共价修饰 剂的修饰作用。 ⑵特异性共价修饰：分离标记肽段，可判断活性部位的氨基酸残基，如二异丙基氟磷酸（DFP）专一 性与胰凝乳蛋白酶活性部位丝氨酸残基的羟基结合。 ⑶亲和标记：利用底物类似物和酶活性部位的特殊亲和力将酶加以修饰标记来研究酶活性部位的方法。 修饰剂的特点：①结构与底物类似，能专一性引入到酶活性部位；②具活泼化学基团，能与活性部位某一氨基酸共价结合，相应的试剂称“活性部位指示剂”。 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，TPE是酶的底物，TPCK是酶的亲和试剂，当酶与TPCK温浴后，酶活性丧失，这种结合具有空间结构的需求，同时也阻止其他试剂如DFP结合。对酶活性中心的组氨酸咪唑环进行修饰。 ⑷自杀性底物标记：底物与酶结合并被催化所生成的产物可以与活性部位的基团专一性结合从而抑制 酶的催化活性。 2、动力学参数测定法：通过动力学方法求得相关参数，作出相应判断。 3、X-射线晶体衍射法：如溶菌酶和胰蛋白酶活性中心的测定

植酸酶

植酸酶在饲料工业中的应用 大家都知道酶是具有催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。今天向我大家介绍的是饲料生产工业中非常重要的一种酶——植酸酶 植酸酶产品在动物和人类营养方面有非常广泛的应用，他可分解植酸(即肌醇六磷酸)，植酸是植物体内磷酸盐和肌醇的重要储存形式。植酸酶是一种新型的食品添加剂，能降低食物中的植酸而提高磷、锌、钙和铁等的利用率，改善动物对矿物质的吸收。其中磷是维持动物生长发育等生命活动必需的重要矿物质，同时也是饲料中最昂贵的组分之一，植酸酶可催化植酸盐水解，使植酸盐中的磷以磷酸根的形式分离出来从而被动物吸收，提高磷的利用率，降低环境污染。 1．1植酸酶的种类 1)按来源不同可分为微生物植酸酶、植物性植酸酶和动物性植酸酶。 2)按作用方式可分为3一植酸酶和6一植酸酶，其中3一植酸酶存在于 植物、霉菌和细菌中，需Mg2+参与反应，性质稳定，耐酸和耐高温，在饲料工业中已被广泛使用。而6一植酸酶只存在于植物中，适宜pH 5．0～5．5，对温度较敏感，超过60～65℃极易被破坏。 3)按加工工艺不同可分为粉状、颗粒状和液体状植酸酶。粉状植酸酶在 高温和高湿环境中易失活；脂肪包被颗粒型植酸酶在高温下脂肪膜易被融化，使植酸酶被释放出来而失活；因植酸酶在饲料中添加量极小，对喷涂精度要求高，故液体状植酸酶在饲料工业中较少使用；经特殊镶嵌的颗粒状植酸酶，热稳定性高，储存期长，在动物体内释放速度快，流动性好。 4)按酶促反应的pH有效作用范围可分为酸性植酸酶和中性植酸酶。适用 于畜禽的pH 2．5~5．5有效作用范围为酸性植酸酶，适用于鲤科鱼类的pH7．0～7．5有效作用范围为中性植酸酶。 1．2植酸酶的特性 植酸酶属于磷酸单酯水解酶，是一种特殊的酸性磷酸酶，适合pH为4～6，对温度的适应性要求较高，一般适宜温度在46～57℃，当超过60℃时，植酸

PCR(聚合酶链式反应)原理

PCR(聚合酶链式反应)原理 PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在T aq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR 的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI 诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。 发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 从PCR原理可以看出，PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进，今天的PCR 已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要，各厂家的PCR仪型号不同，着力宣传的技术指标和参数也不尽统一，编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标，希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。 PCR仪介绍及其选购 P CR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量

植酸酶的作用及其应用

植酸酶的作用及其应用 摘要：磷是畜禽营养物质中功能最多的营养素之一。家畜必须从饲料中得到充足的磷才能维持正常生命和生产活动。本文简要的介绍了植酸酶的来源、作用，并阐明了植酸酶在不同动物不同生长阶段添加植酸酶对其生产性能、饲料利用率的影响，以及植酸磷影响植酸磷作用的因素 关键词：植酸酶生产性能饲料利用率 磷是畜禽营养物质中功能最多的营养素之一。畜禽必须从饲料中得到充足的磷才能维持正常生命和生产活动,单胃动物(猪、鸡)饲料中植物性饲料所占比例很大,虽然饲料中总磷含量较高,但可被单胃动物利用的有效磷却不足。谷物饲料中磷的主要以植酸和植酸盐的形式存在,绝大多数单胃动物不能充分消化、利用植酸和植酸盐中的磷, 这不仅增加了饲养成本而且,未被动物消化吸收的磷还会对环境造成污染。此外,植酸盐能络合某些营养物质,降低其在动物体内的消化吸收率, 是一种抗营养因子。 因此，因此就需要在畜禽的饲料中需要添加一种易于被肠道消化的磷饲料。通常添加无机态的磷酸氢钙。但是磷酸氢钙是不可再生的矿物资源，并且在市场上的价格很昂贵，最近的研究表明,日粮中添加植酸酶可取代磷酸氢钙，他可分解植酸和植酸盐，促进饲料中植酸和植酸盐的分解，使与磷及磷酸根结合的内源性酶和其他营养素得以释放和利用，减少粪磷对环境的污染，节省无机磷酸盐的添加。提高植物性饲料中磷的利用率。[1] 1植酸酶 1.1植酸酶的来源 在自然界中,植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物中。相对于植物和动物来源的植酸酶说，来源于微生物的植酸酶作用范围广和稳定性较好，易规模化生产，畜禽日粮中植酸酶的来源主要有两个途径： 1) 有些植物及其加工副产品本身含有较高活性的植酸酶，如小麦和小麦麸本身

酶作用机理和调节【生物化学】

酶作用机理和调节 一、选择题 ⒈关于酶活性中心的描述，哪一项正确？（） A、所有的酶都有活性中心； B、所有酶的活性中心都含有辅酶； C、酶的必须基团都位于酶的活性中心内； D、所有的抑制剂都是由于作用于酶的活性中心； E、所有酶的活性中心都含有金属离子 ⒉酶分子中使底物转变为产物的基团是指：（） A、结合基团； B、催化基团； C、疏水基团； D、酸性基团； E、碱性基团

⒊酶原的激活是由于：（） A、氢键断裂，改变酶分子构象； B、酶蛋白和辅助因子结合； C、酶蛋白进行化学修饰； D、亚基解聚或亚基聚合； E、切割肽键，酶分子构象改变 ⒋同工酶是指（） A、辅酶相同的酶； B、活性中心的必需基团相同的酶； C、功能相同而分子结构不同的酶； D、功能和性质都相同的酶； E、功能不同而酶分子结构相似的酶 ⒌有关别构酶的结构特点，哪一项不正确？（） A、有多个亚基； B、有与底物结合的部位； C、有与调节物结合的部位； D、催化部位和别

构部位都位于同一亚基上；E、催化部位与别构部位既可以处于同一亚基也可以处于不同亚基上。 ⒍属于酶的可逆性共价修饰，哪项是正确的？ A、别构调节； B、竞争性抑制； C、酶原激活； D、酶蛋白和辅基结合； E、酶的丝氨酸羟基磷酸化 ⒎溶菌酶在催化反应时，下列因素中除哪个外，均与酶的高效率有关？（） A、底物形变； B、广义酸碱共同催化； C、临近效应与轨道定向； D、共价催化； E、无法确定 ⒏对具有正协同效应的酶，其反应速度为最大反应速度0.9时底物浓度（[S]0.9）与最大反应

旗开得胜速度为0.1时的底物浓度（[S]0.1）二者的比值[S]0.9/[S]0.1应该为（） A、＞81； B、=81； C、＜81； D、无法确定 ⒐以Hill系数判断，则具负协同效应的别构酶（） A、n＞1； B、n=1； C、n＜1； D、n≥1； E、n≤1

7、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr） 逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）可以：（1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA 高效转录系统。 实验材料：组织、细胞 试剂、试剂盒：RNA提取试剂、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一链cDNA合成试剂盒仪器、耗材：离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶

植酸酶

【原料】粉状植酸酶、液体植酸酶、包被型植酸酶与耐高温颗粒植酸酶之间的区别 植酸酶是生物技术与饲料科学相结合开发出的饲料添加剂，其主要作用是促进饲料原料中植酸的分解，释放出无机磷、肌醇及其他营养物质（金属离子、蛋白质、氨基酸、淀粉等），增加动物对这些营养物质的吸收利用率，从而降低饲料中无机磷的添加，更进一步降低饲料成本。植酸酶是具有生物活性的生物大分子，对温度、湿度、pH、金属离子等极为敏感，容易受外界环境影响而失去生物活性。目前，国内植酸酶的主要剂型包括粉状、包被、液体、耐高温颗粒等，各种剂型均有各自的优缺点。 一粉状植酸酶 市售粉状植酸酶一般有两种方式，一种是将纯化植酸酶发酵液与一定比例载体混合成一定酶活浓度的混合物，经过干燥而生产出的一次成型粉状产品；另一种是将植酸酶与载体吸附后干燥成高酶活的粉状原酶，原酶再与一定比例稀释剂混合，生产出特定酶活浓度的产品。二者的区别是前者所有粉状颗粒上均有酶活的存在，而后者仅有一部分粉状原酶上有酶活，而稀释剂上无酶活分布。 粉状植酸酶简单的加工技术决定了此产品的优势和缺点，优点是生产工艺简单，成本低廉，适用于生产对植酸酶效价破坏小的饲料产品，可在冬春季时用于粉状配合饲料。缺点是有效成分因裸露不能得到有效保护，产品贮存稳定性差，有效期短；活性成分抗逆性差；粉尘损失大，不利于生产人员身体健康，且污染环境；静电效应大，易造成静电损失，特别是用原酶二次稀释的产品，若稀释剂的容重与原酶不一致，易造成分级，流动性较差，在饲料中混合均匀度变异系数在8%~15%，远大于一次成型粉状植酸酶在饲料中6%~10%的变异系数。粉状植酸酶的裸酶在动物采食后会迅速发挥作用，但是受消化道中酸、蛋白酶等的影响，效率下降较大。 二液体植酸酶 在饲料制粒后喷涂液体植酸酶，在现代饲料工业中已广为使用，其优点是成本相对低廉，同时避免高温制粒对酶活的影响。缺点：①需要增加后喷涂设备，安装费用和日常维护成本较高；②生产过程中由于各种因素的影响，喷头易堵，造成生产被动；③用液体酶生产的产品酶活变异系数在20%~60%，远高于配合饲料要求的7%的变异系数；④植酸酶喷在颗粒料表面，在搬运过程中产生摩擦，植酸酶易随细粉落在袋底，使酶活不均匀；⑤酶在颗粒表面，对植酸酶无任何保护，酶活稳定性差；⑥雾化的植酸酶遇到饲料中的粉尘，易形成湿度大的结块，散落在饲料中，易发霉变质，影响饲料的品质，造成客户投诉；⑦对制粒质量要求高，粉率高时易使酶活不均匀，吸附在粉状饲料中植酸酶的浓度远高于颗粒料中的浓度。鉴于液体植酸酶存在的缺点，选择澄清透明、运输使用过程中不易产生沉淀、pH 值远离等电点的高品质产品是有效使用液体植酸酶的关键。

植酸酶及其生产概述

植酸酶及其生产概述 李大刚 1 张秉胜 2 张广民 1 （ 1 东北农业大学动物营养研究所哈尔滨 150030 2 大连翔大科技股份有限公司 116620 ） 磷在畜禽营养中发挥着重要的作用，是机体重要的结构成分，同时参与机体诸多重要的生理、生化过程。例如，在能量代谢、碳水化合物代谢、氨基酸和脂肪代谢、神经组织代谢、骨骼生长以及脂肪和其他脂类运输方面起着重要作用。因此，如果日粮中磷缺乏或不足，会引起生长缓慢或停滞，出现骨病，甚至死亡等严重后果。饲料原料中含有大量的磷，但一般谷物中60%以上的磷以植酸磷形式存在而不能为单胃动物所利用。而植酸酶是一类催化植酸（肌醇六磷酸酯）及植酸盐水解成无机磷和肌醇的酶的总称。植酸酶不但可以使单胃动物利用有机磷，还可减少磷的排出，减轻环境污染，所以植酸酶引起众多科研工作者的广泛关注。 1 植酸酶的应用 猪、禽等单胃动物饲料的主要原料是玉米、豆粕、糠麸、棉籽粕、菜籽粕等，它们所含的磷大部分以植酸磷形式存在，占总磷的60%～90％。但是单胃动物的饲料中，植酸具有强烈的抗营养作用，其原因是：(1)单胃动物缺乏分解植酸的酶类，因而无法利用植酸中的磷。(2)由于植酸上的磷酸基团呈负电性，它与一些阳离子如Ca 2+ 、Mg 2+ 、Zn 2+ 、Cu 2+ 、Mn 2+ 、 Fe 2+ 和K +等有很强的螯合能力，形成不溶性盐，从而影响畜禽对这些矿物元素的吸收和利用，因而降低了这些矿质元素的生物效价。(3)植酸上的磷酸基团还可以与饲料中的蛋白质、氨基酸、淀粉和脂质等物质上的阳离子基团结合，使其溶解性降低，从而影响畜禽对这些营养物质的消化率，降低蛋白质的生物有效性。(4)植酸还可以与动物体内的蛋白质，如淀粉酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶和酸性磷酸酶等结合，降低这些酶的活性，使整个日粮的养分利用率降低。(5)植酸对维生素也存在不利影响。因此动物采食高植酸含量的饲料后常表现厌食、消瘦、繁殖机能衰退等。 表1 某些饲料原料中磷的含量及利用率(NRC，1994) 植酸酶用于饲料，可以提高饲料中植酸磷的利用率，减少磷的排放量，降低环境中磷的污染，并能解除植酸抗营养作用，从而提高饲料消化利用率。表1列举了几种常用动物饲料原料中磷的存在形式和畜禽利用情况，从表中可以看出这些原料中磷的利用率比较低。如果植酸磷能够被充分利用，则日粮中的磷含量已基本可满足畜禽营养需要，可较少甚至不用再额外添加无机磷。 2 植酸酶的分子生物学特性 植酸酶属于磷酸单酯水解酶，是磷酶的一种特殊类型。植酸酶广泛分布于自然界，存在于微

1聚合酶链式反应PCR技术

实验1 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。

ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 详细 实验方法 ?逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料 ?组织或细胞样品 试剂、试剂盒 ?RNA提取试剂 ?dNTP 混合物 ?Taq DNA聚合酶 ?第一链cDNA合成试剂盒 仪器、耗材 ?离心管 ?离心机 ?水浴锅 ?PCR管 ?电泳仪 ?凝胶图像分析系统 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，R T-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript Ⅱ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶 四、操作步骤 1. 总RNA的提取：见相关内容。

生物化学(第三版)第十章 酶的作用机制和酶的调节课后习题详细解答_ 复习重点

第十章酶的作用机制和酶的调节 提要 酶的活性部位对于不需要辅酶的酶来说，就是指酶分子中在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基负责与底物的结合与催化作用的部位，对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部位的组成部分。酶活性部位有6个共同特点。研究酶活性部位的方法有：酶分子侧链基团的化学修饰法，动力学参数测定法，X射线晶体结构分析法和定点诱变法，这些方法可互相配合以判断某个酶的活性部位。 酶是催化效率很高的生物催化剂，这是由酶分子的特殊结构所决定的。经研究与酶催化效率的有关因素有7个，即底物和酶的邻近效应与定向效应，底物的形变与诱导契合，酸碱催化，共价催化，金属离子催化，多元催化和协同效应，活性部位微环境的影响。但这些因素不是同时在一个酶中其作用，也不是一种因素在所有的酶中起作用，对于某一种酶来说，可能分别主要受一种或几种因素的影响。 研究酶催化的反应机制，始终是酶学研究的一个重点，通过大量的研究工作，已经对一些酶的作用机制有深入了解，该章对溶解酶、胰核糖核酸酶A、羧肽酶A、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等的催化作用机制进行了详尽的讨论。 酶活性是受各种因素调节控制的，除了在第8章中已介绍的几种因素外，主要还有①别构调节，例如ATCase。②酶原的激活，如消化系统蛋白酶原的激活及凝血系统酶原的激活。③可逆共价修饰调控，如蛋白质的磷酸化，一系列蛋白激酶的作用。通过以上作用，使酶能在准确的时间和正确的地点表现出它们的活性。别构酶一般都是寡聚酶，有催化部位和调节部位，别构酶往往催化多酶体系的第一步反应，受反应序列的终产物抑制，终产物与别构酶的调节部位相结合，由此调节多酶体系的反应速率。别构酶有协同效应，[S]对υ的动力学曲线呈S形曲线（正协同）或表现双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程。ATCase作为别构酶的典型代表，已经测定了其三维结构，详细研究了别构机制和催化作用机制。为了解释别构酶协同效应的机制，有两种分子模型受到人们重视，即协同模型和序变模型。酶原经过蛋白水解酶专一作用释放出肽段，构象发生变化，形成酶的活性部位，变成有活性的酶，这个活化过程，是生物体的一种调控机制。可逆地共价修饰调控作用是通过共价调节酶进行的，通过其他酶对其多肽链某些基团进行可逆地共价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。共价修饰的基团主要是磷酸化、腺苷酰化、尿苷酰化及ADP-核糖基化等。 同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面不同的一组酶。同工酶是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学及医学研究中占有重要地位。LDH同工酶研究的比较清楚，是由良种不同亚基组成的四聚体，有5种同工酶，在不同组织中含量不同，反映了同工酶的组织特异性。 习题 1.阐明酶活性部位的概念。可使用那些主要方法研究酶的活性部位？ 答：酶的活性部位对于不需要辅酶的酶来说，就是指酶分子在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基负责与底物的结合与催化作用的部分；对于需要辅酶的灭来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部位的组成部分。 研究酶活性部位的方法有：酶分子侧链基团的化学修饰法、动力学参数测定法、X射线晶体结构分析法和定点诱变法。 2.简要阐明胰Rnase A的活性部位如何确定？