基于非标记核酸适配体可视化检测黄曲霉毒素B1的方法研究
第5卷 第3期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 3
2014年3月
Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2014
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(201003008)、北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX201103002)和农业部农产品质量安全风险评估实验室（北京）开放课题项目（ATFM-KFKT2013003）
Fund: Supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest, the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China (201003008) and Innovation, Capacity-building Projects by Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (KJCX20140302) and the Open Project of Beijing Research Center for Agricultural Standards and Testing (ATFM-KFKT2013003)
*通讯作者: 王纪华, 博士, 研究员, 主要研究方向为农产品质量检测技术与信息技术的交叉与集成。E-mail: wangjh@https://www.wendangku.net/doc/b316458771.html,
*Corresponding author: WANG Ji-Hua, Associate Professor, College of Engineering and Technology, Southwest University, No. 2, Tiansheng Road, Beibei District, Chongqing China 400715. E-mail: bbwangji@https://www.wendangku.net/doc/b316458771.html,
基于非标记核酸适配体可视化检测黄曲霉毒素B 1
的方法研究
栾云霞, 陈佳祎, 陆安祥, 李 成, 马智宏, 王纪华*
(北京农业质量标准与检测技术研究中心, 北京 100097)
摘 要: 目的 利用纳米金在盐诱导下凝聚后引起的颜色变化, 建立基于非标记的AFB 1特异性结合适配体, 针对AFB 1的灵敏快速可视化检测方法。方法 通过对适配体DNA 浓度、NaCl 盐溶液、pH 值等条件的优化, 确定最佳反应体系并进行特异性实验。结果 本方法具有良好的灵敏度和特异性, 线性范围和检测限分别是0.025～10 ng/mL 和0.025 ng/mL, 可以满足中国和欧盟的最大残留限量(MRL)的检测要求。结论 该方法实现了对黄曲霉毒素B 1的可视化检测, 简单、高效、可行, 具有较高的分析灵敏度和较好的特异性。 关键词: 黄曲霉毒素B 1(AFB 1); 适配体; 非标记; 纳米金; 可视化检测
Colorimetric detection of aflatoxin B 1 using aptamer-functionalized gold nanoparticles
LUAN Yun-Xia, CHEN Jia-Yi, LU An-Xiang, LI Cheng, MA Zhi-Hong,WANG Ji-Hua *
(Beijing Research Center for Agricultural Standards and Testing, Beijing 100097, China )
ABSTRACT: Objective The colorimetric detection of AFB 1 based on a label-free the AFB 1 aptasensor using
unmodified gold nanoparticles(AuNPs) was developed in the present study. Methods Concentration of DNA and NaCl was optimized, as well as the pH values , to determine the optimal reaction system. Specific experi-ment was carried out with the interference of OTA. Results The linear dynamic range and detection sensitiv-ity were found to be 0.025-10 ng/mL and 0.025 ng/mL of AFB 1 respectively, which were lower than the maxi-mum residue limit (MRL) in edible food, as set by China and the European Commission. Conclusion This study provides a simple, sensitive and visible detection method for AFB 1 analysis, which can be applied in fu-ture on-site detection for food and agricultural products.
KEY WORDS: aflatoxin B 1 (AFB 1); aptamer; label-free; gold nanoparticles; visual detection
食品质量安全状况是一个国家经济发展水平和人民生活质量的重要标志。随着人民生活水平的不断
提高, 全社会的食品安全意识明显增强, 农产品质量安全作为食品安全工作的重要组成部分不容忽视。近
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年来, 由真菌毒素引起的农产品安全问题在世界范围内日益突出。真菌毒素(mycotoxins)是由不同种属的丝状真菌产生的次生有毒代谢产物, 严重威胁人类及动物的健康和生命安全。比较有代表性的真菌毒素主要有黄曲霉毒素(aflatoxins)、赭曲霉毒素A(ochratox in A)、烟曲霉毒(fumonisins)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)等, 其中黄曲霉毒素B1(图1)是黄曲霉毒素家族中毒性最强的一种[1,2]。因此, 世界各国均对农产品以及其他食品相关产品中的黄曲霉毒素B1制定了严格的限量标准。
在农产品安全领域, 在每克农作物中的黄曲霉毒素自然污染水平是以10-9克(1 ng)为单位度量的, 具有几率大、比率小、不均匀、隐蔽性和微量性等特点, 因此, 针对限量标准要求的毒性评价和检测技术提出了更高的要求。目前黄曲霉毒素B1的常规仪器检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPCL)、气相质谱法(GCMS)和液相质谱法(LCMS)等仪器分析方法[3-6], 这些方法灵敏度高、选择性好, 但由于样品前处理较复杂, 仪器设备昂贵, 需专门操作人员, 耗时耗力, 限制了其应用。特别是对大量样品进行检测时, 还要求实验室具备适当的存储条件, 故此常规的仪器检测方法不能满足现场快速筛查分析的需求[7]。因此, 发展高效的真菌毒素检测前处理和新型快速检测技术及装备显得尤为重要。
对真菌毒素的快速检测方法应用最多的是抗原抗体法即免疫学方法, 但这种方法需要制备特异性的抗体, 抗体具有不稳定性, 制备的成本较高而且不宜保存, 受免疫原性等的限制[8]，这些不足制约了免疫学方法在真菌毒素领域中的应用。而且目前存在的检测方法检测限普遍较高, 不适合真菌毒素隐蔽性和微量性的特点。不断提高检测方法的灵敏度, 增强抗干扰能力, 提高检测速度, 降低检测成本一直都是真菌毒素快检技术开发的源动力。
核酸适配体 (aptamer), 又称适体, 是应用新型组合化学技术-指数富集配基的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)体外筛选得到单链寡聚DNA或RNA分子[9]。其特殊而稳定的三维结构, 可以通过空间构型互补高亲和力、高特异性与不同靶物质结合, 这种结合方式与抗体和抗原结合类似, 但又不同于抗体, 是一种具有很高的选择性、特异性、亲和性的特殊“化学抗体”, 可以区分结构及其相似的物质, 因此受到众多国内外学者的极大关注。本研究以纳米金作为介质, 以非标记的AFB1特异性识别核酸适配体为识别分子, 建立了AFB1的新型可视化检测方法。
1材料与方法
1.1仪器
UV-Vis(-NIR)UVProbe 2.33 版分光光度计, 购自日本岛津公司; JEM-2100HR 透射电镜(TEM), 购自日本JEOL 公司; DF-101S 型集热式磁力加热搅拌器, 购自河南巩义市予华仪器厂; 台式高速冷冻离心机器, 美国Sigma公司产品; Millipore纯水机, 美国Bedford公司产品; EOS 6D 数码相机, 佳能公司产品; 96孔板, Coring公司。
1.2 试剂
黄曲霉毒素B1的适配体寡聚核苷酸序列在“上海生工”合成, 5’-GCATCACTACAGTCATTACGCA
TCGGGTAAGCGGAACTGA-GGAGTGGGAGGTAA ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC-3’[10], 用含1 mmol/L MgCl2 (pH 8.5)的10 mmol/L 的PBS(pH 7.4)溶液来稀释, -20 ℃保存。黄曲霉毒素B1标准品、氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸三钠购自美国Sigma公司, NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgCl2等其他试剂均购于上海化学试剂公司, 实验所用试剂均为分析纯。
1.3 纳米金的制备
实验采用Frens等[11]在1973年创立的柠檬酸三钠还原法制备胶体金, 在三口圆底烧瓶中加入95.8 mL 超纯水, 再加入4.2 mL 质量分数1%氯金酸溶液, 磁力、回流加热搅拌, 持续煮沸10 min, 然后迅速加入10 mL 质量分数1%柠檬酸三钠溶液, 溶液颜色在1 min内变红, 继续沸腾20 min, 搅拌状态下自然冷却至室温, 得到的酒红色液体, 即为纳米金。主要通过紫外、可见吸收图谱、透射电子显微镜对其进行了表征。
1.4 黄曲霉毒素Ｂ1的检测
取50 μL 浓度为10 μmol/L 的AFB1适配体DNA, 加入96孔板中, 加入50 μL不同浓度(0、0.025、0.1、0.4、2、4、10、20 ng/mL)的目标物, 混匀孵化5分钟, 加入50 μL的纳米金, 平衡5分钟, 加入10 μL 浓度为2 mol/L NaCl, 平衡5分钟后400
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nm到 750 nm 以水做参照进行比色, 并拍照。
2结果
2.1 AFB1检测的原理
利用AFB1适配体和纳米金的可视化检测方法原理基于纳米金溶液在高浓度NaCl的作用下产生的凝聚而造成的颜色变化。纳米金一般经由柠檬酸三钠还原氯金酸制备而成, 生成的溶液是一种胶体溶液, 纳米金表面覆盖一层柠檬酸, 颗粒之间通过静电排斥作用保持胶体金溶液的稳定性, 如果在溶液中加入高浓度的盐, 即可破坏胶体溶液的稳定性, 纳米金发生凝聚, 溶液颜色由红色变为蓝色[12,13]。而单链DNA 在自由状态下通过暴露的带正电的碱基和纳米金表面的负电荷发生静电作用而直接吸附到金表面, 吸附有单链适配体DNA的纳米金在高盐浓度下仍可以保持稳定, 溶液为红色[14]。如图2所示, 当溶液中存在靶分子AFB1时, 适配体单链DNA形成特定的三维立体结构, 特异性高亲和力地与AFB1结合, 表面没有吸附DNA的纳米金在加入高浓度盐后凝聚, 溶液变为蓝色[15]。利用分光光度计对溶液的进行吸光度测定, 即可通过目标物浓度和吸光度建立线性关系。
2.2 最佳反应条件的选择
AFB1适配体的浓度和NaCl盐溶液的浓度是本检测方法反应体系的关键因素, 由于不同的适配体的长度、碱基组成均不同, 通过对不同浓度的适配体和NaCl溶液的比较, 确定了最佳反应条件[16,17]。本实验通过加入0.1、1 、5、10 μmol/L的DNA单链后, 在10 mol/L NaCl浓度下的凝聚情况, 选择了最
图1 黄曲霉毒素B1的化学结构式和黄曲霉菌的显微形态
Fig. 1 Chemical formula of AFB1 from chemoffice and micro-morphology of Aspergillus flavus
图2 基于非标记适配体和纳米金检测AFB1的原理及Mfold预测的适配体二级结构示意图
Fig. 2 Schematic diagram depicting the proposed aptasensor for detection of AFB1 using AuNPs and the secondary structure of
AFB1-DNA predicted by Mfold Web server
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佳适配体浓度为10 μmol/L 。研究发现溶液中存在高浓度过量的DNA 时, 即使加入100 ng/mL 的AFB 1, 纳米金表面仍有足够的单链DNA 吸附, 溶液在加入高盐后仍不会变蓝
[18]
。同时, 我们也对NaCl 的浓度
进行了优化, 研究了加入不同盐浓度(1、2、3 mol/L)后, 纳米金的凝集情况, 选择了10 μL 浓度为 2 mol/L NaCl 溶液, 对检测体系最为有利, 确定了AFB 1检测的反应条件。
2.3 梯度实验及线性
在保证适配体、纳米金和盐离子浓度一致的情况下, 我们通过向反应体系中加入不同浓度(0、0.025、0.1、0.2、0.4、2、4、8、10 ng/mL)的AFB 1目标物, 平衡后, 观察其在高盐条件下纳米金的凝聚情况和溶液颜色的变化并用分光光度计测定溶液的吸光度(如图3及图4)。实验发现, 随着AFB 1浓度的增加, 加入NaCl 后, 溶液的颜色从红色变为紫红色, 在520 nm 处的吸收峰也随AFB 1浓度的增加而逐渐变小。当目标物浓度达到10 ng/mL 和20 ng/mL 时, 溶液由紫红色变为蓝色, 表明纳米金几乎完全凝聚, 但目标物浓度大于20 ng/mL 时, 线性不够理想。而在没有加入适配体的对照组中, 溶液颜色自始至终(从0～100 ng/mL)均为蓝色, 这表明AFB 1的适配体在纳米金凝聚反应中发挥了关键作用。通过对溶液中AFB 1浓度和吸光度的线性关系分析发现, 溶液在520 nm 的吸光度与AFB 1的浓度呈较好的线性关系, R 2达到0.9948(图5), 这为通过标准曲线分析实际样品奠定了良好的理论基础。
2.4 特异性实验
为了研究AFB 1适配体的特异性, 本研究通过选用赭曲霉毒素OTA 作为潜在的干扰物, 在相同的条件下检测适配体对AFB 1(0.25 ng/mL) 和OTA(0.25 ng/mL )的选择特异性和灵敏度。如图6所示, 与空白对照相比, 也就是与没有目标物只有适配体DNA 的溶液相比, 加入AFB 1目标物的溶液的紫外-可见吸收光谱在520 nm 有一个明显的的下降, 而以OTA 作为目标物的溶液的光谱谱线只发生了很小的变化。数据表明, 加入AFB 1目标物的吸光度变化率显著高于OTA 。这些结果表明此方法使用的适配体序列具有较好的选择性, 基于此建立的用于检测AFB 1的可视化方法具有较好的特异性。
图3 反应体系吸光度随AFB 1浓度增加的变化 Fig. 3 Relationship between absorption and AFB 1 concen-
tration
图4 纳米金溶液不同浓度0 ng/mL(A)和10 ng/mL (B)AFB 1条件下的扫描电镜显微状态
Fig. 4 The SEM images of AuNPs in solution under the different concentration of AFB 1 of 0 ng/mL(A) and 10 ng/mL (B)
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食品安全质量检测学报 第5卷
图5 基于非标记适配体检测AFB 1的线性及可视化结果 Fig. 5 Typical calibration curves for AFB 1, obtained using the aptamer-based label-free biosensor (inset: corresponding
photographic images)
图6 适配体-纳米金检测方法的特异性(OTA 为干扰物)
Fig. 6 Specificity assays of the UV-vis spectra of
aptamer-AuNP solution in the presence of AFB 1 as well as the interference of OTA
3 讨 论
黄曲霉毒素B 1(AFB 1)是黄曲霉毒素家族中毒性最强的一种, 是涉及农产品、食品和粮食安全的重要危害因子。本研究建立了一种基于纳米金和单链DNA 适配体检测黄曲霉毒素B 1的简单、
高效可行的检测方法, 其无需对适配体分子和纳米金进行设计和修饰, 把合成好的适配体直接与未修饰的纳米金吸附结合, 然后加入高浓度的盐和目标物, 几分钟后即可检测。由于纳米金聚合后引起的红色到紫色再到蓝色的颜色变化很容易用肉眼观察或用UV-vis 光谱仪检测, 检测限可以达到0.025 ng/mL, 低于欧盟和我国制定的食品及农产品中的AFB 1不高于0.5
ng/mL 的最大残留限量标准, 且溶液在520 nm 吸光度与AFB 1浓度具有较好的线性(R 2=0.9948, 线性范围0.025～10 ng/mL)。另外, 该方法不使用有机溶剂、重金属离子、酶试剂、光敏染料和大型精密仪器, 具有操作简单, 灵敏度高, 特异性好的优势。但对于AFB 1适配体如何跟目标物结合的具体机制和构象还不完全清楚, 未来可以应用分子生物学、核磁共振和分子光谱等多种表征和检测手段对其进行深入研究
[19,20]
。AFB1适配体的浓度、NaCl 盐溶液的浓度、pH
值是本检测方法反应体系的关键因素, 通过对不同浓度的DNA 、NaCl 溶液、pH 值的比较, 确定最佳反应条件是获得理想的灵敏度、精密度和检测结果的关键。在基于比色法定量时, 由于不同批次的纳米金在520纳米的吸光度稍有差异, 溶液中适配体和盐离子浓度等条件不固定时, 吸光度都会受到影响, 虽然其变化趋势和线性的重复性非常好, 因此, 此方法用于定量检测的话, 须要保证以上要素的一致性。今后, 需要进一步从适配体碱基组成、长度、缓冲液组成等多个角度研究影响适配体检测体系的因素, 以提高检测的灵敏度和线性范围, 为建立多靶标检测方法提高基础, 并进一步改进方法实现实际样品的检测。 参考文献 [1] Stepien M, Sokol-Leszczynska B, Luczak M. Mycotoxins, food
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(责任编辑: 邓伟) 作者简介
栾云霞, 博士, 副研究员, 主要研究
方向为农产品及农田环境中污染物检测技
术研究。
E-mail: luanyunxia@https://www.wendangku.net/doc/b316458771.html,
王纪华, 博士, 研究员, 主要研究方
向为农产品质量检测技术与信息技术的交
叉与集成。
E-mail: wangjh@https://www.wendangku.net/doc/b316458771.html,
黄曲霉毒素B检测试剂盒操作办法
黄曲霉毒素B检测试剂 盒操作办法 文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
黄曲霉毒素B1检测试剂盒操作方法2/50ppb 一、样品的准备/萃取 1.获取具有代表性的样品，使用Romer系列II型研磨机研磨，使至少95%的研磨样品能够通过20目筛网，彻底混合并对样品进行二次取样。 2.称取4g研磨样品于干净并可密封的广口瓶中。加入20mL70/30（v/v）甲醇/水萃取溶液并密封广口瓶。注意：样品与萃取溶液比例应为1：5（w:v），振荡或均质3分钟。 3.静置样品，用滤纸过滤萃取上清液，收集待检滤液。 4.用提供的分析缓冲液对滤液进行1：2稀释。例如，将50μL待检滤液加入50μL分析缓冲液中，混匀准备进行随后检测。 二、检测步骤 1．将适量的标记颜色的稀释孔条放入微孔板架上，稀释条孔的数目需使每个标准品 （0,2,5,20&50ppb）或样品能够对应一个稀释孔。 2．将等量的有抗体包被的微孔条放入微孔板架上，未使用的有抗体包被的微孔条需放回装有干燥剂的原铝箔袋内并密封保存。 3．按照240μL/孔或2mL/条的体积计算所需的酶联偶合物用量。从绿色瓶盖的瓶中量取所需用量的酶联偶合物至一个酶联偶合物试剂槽中（如多道移液器所用的试剂槽）。使用8道移液枪移取100μL酶联偶合物至每个稀释孔中。 4．使用单道移液枪，移取50μL标准品和样品至已装有100μL酶联偶合物的稀释孔中。用移液枪反复吸送3次以充分混合孔中液体。每当移取一个标准品或样品时，单道移液枪必需更换上新吸头。注意确保最后将吸头中的液体排空。
5．使用换有全新吸头的8道移液枪，快速移取每个稀释孔中的液体各100μL至相应的有抗体包被的微孔中。室温下放置15分钟。注意不要摇动微孔板去混匀孔中液体，以免引起孔与孔之间的污染。 6．将孔中的液体甩入水槽中，用去离子水或蒸馏水冲洗每个孔，然后将微孔中的水甩入水槽中。如此方式反复冲洗5次。注意在冲洗过程中不要将微孔条从微孔板架上取下，每条微孔条带应被固定在微孔板架上。 7．冲洗完毕后，将几张吸水纸巾放置在平整的桌面上，使微孔板倒置扣击纸面，以尽可能地将残留的水分排出。用干布或纸巾擦干微孔板底反面的水珠。 8．按照120μL/孔或1mL/条的体积计算所需的底物用量。从蓝色瓶盖的瓶内量取所需用量的底物至一个底物试剂槽中（例如适用于8道移液枪的试剂槽中），使用8道移液枪移取100μL底物至每个微孔中，室温下放置5分钟。 9．按照120μL/孔或1mL/条的体积计算所需的终止液用量。从红色瓶盖的瓶中量取所需用量的终止液至一个终止液试剂槽中（例如适用于8道移液枪的试剂槽中），使用8道移液枪依序（顺序与加入底物的顺序相同）向每个微孔中加入100μL终止液终止反应。颜色应由蓝变黄。 10．用酶标仪在450nm滤镜及示差滤镜630nm下读取结果，记录每个微孔的吸光度OD 值。注意在读取数据前，微孔中应没有气泡，否则将影响分析结果。 三、试剂盒提供材料 96孔（12X8）抗体包被的微孔板（铝箔袋封装） 96孔（12X8）绿色稀释微孔板（标记颜色） 5瓶黄曲霉毒素标准品，各1.5mL(0,2,5,20&50ppb) 1瓶25mL黄曲霉毒素酶联偶合物（绿色瓶盖） 1瓶15mL底物溶液（蓝色瓶盖）
黄曲霉毒素B检测试剂盒操作方法
黄曲霉毒素B1检测试剂盒操作方法2/50 ppb 一、样品的准备/萃取 1. 获取具有代表性的样品，使用Romer 系列II型研磨机研磨，使至少95%的研磨样品能够通过20目筛网，彻底混合并对样品进行二次取样。 2. 称取4g 研磨样品于干净并可密封的广口瓶中。加入20mL 70/30（v/v）甲醇/水萃取溶液并密封广口瓶。注意：样品与萃取溶液比例应为1：5（w:v），振荡或均质3分钟。 3. 静置样品，用滤纸过滤萃取上清液，收集待检滤液。 4. 用提供的分析缓冲液对滤液进行1：2稀释。例如，将50μL待检滤液加入50μL分析缓冲液中，混匀准备进行随后检测。 二、检测步骤 1．将适量的标记颜色的稀释孔条放入微孔板架上，稀释条孔的数目需使每个标准品（0, 2, 5, 20 & 50ppb）或样品能够对应一个稀释孔。 2．将等量的有抗体包被的微孔条放入微孔板架上，未使用的有抗体包被的微孔条需放回装有干燥剂的原铝箔袋内并密封保存。 3．按照240 μL/孔或2 mL/条的体积计算所需的酶联偶合物用量。从绿色瓶盖的瓶中量取所需用量的酶联偶合物至一个酶联偶合物试剂槽中（如多道移液器所用的试剂槽）。使用8道移液枪移取100μL酶联偶合物至每个稀释孔中。 4．使用单道移液枪，移取50μL标准品和样品至已装有100μL酶联偶合物的稀释孔中。用移液枪反复吸送3次以充分混合孔中液体。每当移取一个标准品或样品时，单道移液枪必需更换上新吸头。注意确保最后将吸头中的液体排空。 5．使用换有全新吸头的8道移液枪，快速移取每个稀释孔中的液体各100μL至相应的有抗体包被的微孔中。室温下放置15分钟。注意不要摇动微孔板去混匀孔中液体，以免引起孔与孔之间的污染。 6．将孔中的液体甩入水槽中，用去离子水或蒸馏水冲洗每个孔，然后将微孔中的水
2015版新药典黄曲霉毒素检测方案
2015年药典黄曲霉毒素测定法 本法系用高效液相色谱法测定药材及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，流速0.8mL/min；采用柱后衍生法检测: 光化学衍生法：光化学衍生器（254nm. PriboFast-KRC光化学柱后衍生 器.Pribolab-MDU光化学柱后衍生器）；以荧光检测器检测，激发波长λex =360nm(或365nm)，发射波长λem =450nm。两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。 混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.0μg/m L、0.3μg/m L、1.0μg/m L、0.3μg/m L、）0.5mL，置10mL于量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。(Pribolab STD#1082-2 AFT混合标准品：AFT B 1 和AFT G 1：1.0μg/mL，AFT B 2 和AFT G 2 ：0.3μg/mL ） 供试品溶液的制备： 1. 取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11,000r/min, ? 真菌毒素等物质的高效粉碎、萃取，保证检测结果的准确性和精确度。 粉碎样品在不锈钢杯中通过电机旋转驱动刀同时进行劈裂、碾碎、掺合等过程。使物料搅拌粉碎,转速高达22000以上,全金属机身和不锈钢杯子,抗有机溶剂的腐蚀,可以实现在2-3分钟高效实现真菌毒素的均质、萃取等关键环节。 优点： ●高速震荡3分钟即可完成整个真菌毒素及 其他物质的萃取过程； ●转速两档可调，低速12000r/min， 高速22000r/min； ●全金属机身，不锈钢材质，抗有机溶剂腐蚀； ●可广泛应用于食品检验、科学研究、医学治疗、化工制药等行业； ●本机构造方面均合于无菌操作的要求； ●通过CE认证。 应用:
中国药典黄曲霉毒素检测过程有关问题解析
致力于打造高品质文档中国药典黄曲霉毒素检测过程有关问题解 析 黄曲霉毒素( aflatoxin，AF) 是由黄曲霉( asperillusflavus) ，寄生曲霉( asperillus parasiticus) 等真菌产生的一类分子结构相似的次级代谢产物，是一类毒性和致癌性很强的化合物，为第一类致癌物，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一。中药材在生长和储存过程中，若环境条件适宜便会滋生霉菌从而产生黄曲霉毒素。目前黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱-质谱联用法等，中国药典20XX年版第二增补本采用高效液相色谱柱后衍生法测定。本文就中国药典黄曲霉毒素检验过程中常遇到的问题以及无衍生快速检测黄曲霉毒素的方法进行初步探讨。 1 仪器与试药 Agilent1200 型高效液相色谱仪; Pickering Vector-PCX 柱后衍生装置; Waters 含FLR 检测器的ACQUITYUPLC H-Class 系统; SB-5200D 超声清洗器( 宁波新芝生物科技有限公司) ; K2042 高速离心机( 美国Kingdom) ; AE-100 电子天平( 瑞士Mettler) 。免疫亲和层析柱( A、B、C 公司) ; 玻璃纤维滤纸( 北京中检维康科技有限公司) ; 黄曲霉毒素混合对照品溶液( 美国SUPELCO 公司，批号: LB74656，黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1浓度分别为0.302、0.965、0.306、1.021 g /mL) 。甲醇、乙腈均为色谱纯，所用水为纯化水。地龙( 批号11008ZY04) 为汕头美宝制药有限公司提供; 陈皮( 批号110901) 为广州中一药业有限公司提供; 薏苡仁( 批号20XX0101B) 为广州市香雪制药股份有限公司提供; 柏子仁 A、B、C 分别购自广州大参林、广州同健和广州采芝林药店，批号自编。 2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备 取本品粉末约5 g( 过二号筛) ，精密称定，加入黄曲霉毒素( aflatoxin，AF) 是由黄曲霉( asperillusflavus) ，寄生曲霉( asperillus parasiticus) 等真菌产生的一类分子结构相似的次级代谢产物，是一类毒性和致癌性很强的化合物，为第一类致癌物，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一。中药材在生长和储存过程中，若环境条件适宜便会滋生霉菌从而产生黄曲霉毒素。目前黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱-质谱联用法等，中国药典20XX年版第二增补本采用高效液相色谱柱后衍生法测定。本文就中国药典黄曲霉毒素检验过程中常遇到的问题以及无衍生快速检测黄曲霉毒素的方法进行初步探讨。 2.2 超高效液相色谱和荧光检测器无衍生法快速检测黄曲霉毒素 2.2.1 线性关系、检测限和定量限精密吸取黄曲霉毒素混合标准品溶液( 黄曲霉毒素B1浓度为102.1 ng /mL) ，分别加50%甲醇制成浓度为每毫升含AFB10.204 2、0.408 4、2.042 0、6.126 0、20.420 0ng 的标准品溶液，摇匀，即得。分别精密吸取对照品溶液2 L，注入色谱仪中，记录峰面积，以浓度( ng /mL) 为横坐标，积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明 4 种黄曲霉毒素线性关系良好。按进样浓度分别为信噪比的3 ∶1 和10 ∶1 计算检测
黄曲霉毒素M1检测
黄曲霉毒素M1最近算是成大明星了，准备写个黄曲霉毒素M1分析方法总结，和大家一起探讨（持续更新）！ 1、结构及理化性质 不管三七二十一，还是先上个图： 先开个头，吃个饭回来写…… 为什么说黄曲霉毒素M1，都出现在与动物相关的产品中？ 黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在动物组织内的代谢产物，并能够进入乳汁（牛奶？），因此大家看到的检测黄曲霉毒素M1都是检的“动物组织：如肝肾、乳腺”以及乳及其制品等”。 再来一个黄曲霉毒素B1代谢途径图，黄曲霉毒素B1在体内羟化形成黄曲霉毒素M1（左上，相机不好，照的效果不太好，大家见谅，有空补一个好点的图）。新图如下：
2、黄曲霉毒素M1的相关限量标准 食品中的限量标准以GB 2761—2011为准：规定如下：
注：上述限量的检测方法：婴幼儿配方食品按GB 5009.24 规定的方法测定，乳及乳制品按GB 5413.37（GB 541337-2010 食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1 的测定）规定的方法测定。 3、分析方法 黄曲霉毒素M1的分析方法主要包括：薄层色谱法；酶联免疫吸附法，免疫亲和柱净化荧光光度法，液相色谱法，液质联用法等。 3.1 薄层色谱法： GB 5009.24-2010 食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定（用于替代“GB/T 5009.24-2003 食品中黄曲霉毒素M1与B1的测定”）为薄层色谱法： 适用范围：牛乳及其制品、奶油及新鲜猪组织（肝、肾、血及瘦肉）等食品中黄曲霉毒素M1 与B1 的测定。 原理：样品经提取、浓缩、薄层分离后，黄曲霉毒素M1 与B1 在紫外光（波长365nm）下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。 3.2 酶联免疫吸附法ELISA 适用范围：ELISA适用于乳，乳粉和乳酪中黄曲霉毒素M1含量的测定。 原理：黄曲霉毒素M1偶联物包被在酶标板的小孔中，将含有黄曲霉毒素M1的样品或标准液和抗M1的抗体加入到小孔中，此事固相包被的黄曲霉毒素M1和样品、标准品中游离的黄曲霉毒素M1竞争性地与抗体进行反应。反应完全之后，用稀释过的清洗液洗小孔，将未反应的物质冲掉。再在小孔中加入过氧化物酶，温育后再次清洗，加入底物溶液，温育后产生蓝色，加入停止液，终止颜色反应，颜色变为黄色，用酶标仪在450nm处测定颜色的强度，黄曲霉毒素M1的浓度与颜色强度成反比关系。 3.3 免疫亲和柱净化高效液相色谱法 适用范围：乳，乳粉，低脂乳，脱脂乳，低脂乳粉，脱脂乳；乳粉中的黄曲霉毒素M1的最低检测限大约是0.1μg/kg，乳中的最低检测限大约是0.01μg/kg。 原理：亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，含有黄曲霉毒素M1的样品通过免疫亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉毒素M1（抗原）结合，形成抗原抗体复合体。用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1，收集洗脱液。HPLC-FLD测定。 3.4 C18，硅胶柱净化高效液相色谱法
黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案
黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案 一、黄曲霉毒素介绍 黄曲霉毒素(aflatoxin，简称为AF)是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素。它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒素比较耐热，加热至230℃才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易消除。 二、黄曲霉毒素对人体的危害 1、引起急、慢性中毒： 黄曲霉毒素是剧毒物质，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素属肝脏毒，除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝脏蛋白质的合成，黄曲霉毒索引起人类的急性中毒事件，国内外均有许多报导，最典型的是印度的霉变玉米事件，该事件直接导致了数十人丧生，数百人患上不同类型的肝脏疾病。 2、致癌性： 黄曲霉毒素有极强的致癌性，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍，是目前公认的致癌性最强的物质之一。另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素含量在30~50ug/kg时为低毒，50~100ug/kg时为中毒，100~1000ug/kg时为高毒，1000ug/kg以上为极毒。鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性，我国对其在食品中的含量作了严格规定，其中，乳制品中黄曲霉毒素最高允许量为5ug/kg（即5ppb）。 三、黄曲霉毒素的种类 黄曲霉毒素主要有4种：即B1、B2、G1、G2，其中B1被认为是主要的有毒物质，有2种这些毒素的代谢产物M1和M2。其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品，动物 饲料，中药等产品中；黄曲霉毒素M 1是动物摄入黄曲霉毒素B 1 后在体内经羟基 化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、 肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。黄曲霉毒素M 1 的毒性和致癌 性与黄曲霉毒素B 1 的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食
I667-01黄曲霉毒素测定法一部检验标准操作规程
1.目的：建立黄曲霉毒素测定法(一部)检验标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。 2.依据： 2.1. 《中华人民共和国药典》2010年版一部。 3.范围：适用于所有用黄曲霉毒素测定法(一部)测定的供试品。 4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。 5.正文： 5.1. 本法系用高效液相色谱法（附录Ⅵ D）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉 毒素（以黄曲霉毒素B 1、黄曲霉毒素B 2 、黄曲霉毒素G 1 和黄曲霉毒素G 2 总量计）， 除另有规定外，按下列方法测定。 5.1.1. 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40：18：42）为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测，衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；以荧光检测器检 测，激发波长γ ex =360nm（或365nm），发射波长γ em =450nm。两个相邻色谱峰的 分离度应大于1.5。 5.1.2. 混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素 B 1、黄曲霉毒素B 2 、黄曲霉毒素G 1、 黄曲霉毒素G 2 标示浓度分别为1.0μg/ml、 0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。 5.1.3. 供试品溶液的制备：取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
黄曲霉毒素检验方法
一、目的 规范实验室检验方法。 二、内容 （一）试验准备 1、标定荧光计。 （1）、将仪器后的电源开关打开。 （2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。 （3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LID INSERT RED VIAL 打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。一定要确认标定管是 否已放到了仪器的底部。 （4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB 如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。 （5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTY OPEN THE LID INSERT GREEN VIAL 打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。一定 要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。 （6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB
如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,从 键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。 （7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LID INSERT GREEN VIAL 打开仪器盖取出绿色的标定管。 （8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY 按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。 （9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。 （11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。荧光计每 周需要标定一次。如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST 然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST 如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST， 按 ENTER键。然后，按照上面所述操作步骤进行。如果进行样品分析，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST键。 2、配制AflaTest显色液（一天配制一次）。
黄曲霉毒素标准检测规程
黄曲霉毒素标准操作规程 1、目的 为了规范亲和柱净化样本中黄曲霉毒素的操作流程，特制订本操作规程。 2、范围 本标准适用于粮食、饲料、中药中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测。 3、检出限和定量限 项目 岛津安捷伦 样本检出限 （μg/kg） 样本定量限 （μg/kg） 样本检出限 （μg/kg） 样本定量限 （μg/kg） AFG10.12 0.4 0.9 3.0 AFG20.08 0.2 0.3 0.86 AFB10.08 0.2 0.6 1.97 AFB20.04 0.12 0.2 0.63 4、职责 部门名称部门职责 质量管理部1、负责本制度的实施。 2、负责本制度的监督执行。 5、程序 5.1 原理 测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品中的黄曲霉毒素B1经过提取、过滤、稀释，然后缓慢的通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱黄曲霉毒素B1，然后注入到分析仪器中用于检测。 5.2 溶液配制 5.2.1 70%甲醇-水溶液：取700mL甲醇，加入300ml去离子水混匀即可。 5.2.2 80%乙腈-水溶液：取800m乙腈，加入200ml去离子混匀即可。 5.2.3 1% 吐温-水溶液：取1ml 吐温-20，加入去离子水并定容至100ml。 5.2.4 黄曲霉毒素混合标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到50 ng/ml、 20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0.5 ng/ml。
5.3 样品前处理 5.3 1 适用于玉米、小麦等粮食作物，花生及其制品，坚果、玉米油、花生油、饲料等 样品 ----25g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛），加入5g 氯化钠与125mL 70% 甲醇-水溶液混匀； ----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液； ----取10mL 滤液加入20mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液； ----取15mL 上样液过免疫亲和柱净化。 稀释倍数：1 5.3.2 适用于辣椒、花椒、黄豆酱等调料，面粉、麦芯粉、芝麻油及其它植物油、谷草 等样品 ----25g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛）加入125mL 80%乙腈-水溶液混匀； ----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液； ----取10mL 滤液加入40mL 蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液； ----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。 稀释倍数：1 5.3.3 适用于中药（2015 版药典规定的19 味中药等） ----15g±0.01g 样品（固体样品需粉碎，并过2mm 分样筛）加入75mL 80%乙腈-水溶液混匀； ----高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液； ----取10mL 滤液加入40mL 1% 吐温-水溶液，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液； ----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。
中药材中黄曲霉毒素检测方案
中药材中黄曲霉毒素检测方案 黄曲霉毒素介绍 黄曲霉毒素是一类真菌(如黄曲霉和寄生曲霉)的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于药材、谷物、坚果、棉籽以及动物饲料相关的产品中。其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以B1毒性最大。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。 背景 各级食品药品监管部门不断加大中药生产流通监管力度，努力保持中药质量总体稳定。 国家食品药品监督管理局关于规范中药生产经营秩序严厉查处违法违规行为的通知(国食药监安[2012]187号中，要求加强对重金属及有害元素、农药残留、黄曲霉毒素等安全性指标的检测和控制，切实保证中药材质量和安全，另要求企业具备与生产品种相适应的检验设备和能力，严把质量检验关。《国家药品安全“十二五”规划》，规划中明确提出“开展药品快速检验技术研究，搭建检验技术共享平台”、“加快推进药品快速检验技术在基层的应用，配置快速检验设备”、“加强县级机构快速检验能力建设”的要求。 中药中黄曲霉毒素的检测方法 2010版《药典》附录IX V 黄曲霉毒素测定采用高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。 原理 样品经甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱层析净化，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，用水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和柱洗脱，再经光化学衍生器柱后衍生，以提高检测准确性。 主要试剂及耗材 气控操作架：含气泵 黄曲霉毒素免疫亲和柱1ml或3ml 光化学衍生器
黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定 —免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法 1 范围 本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光 光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。 本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。 样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。 2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法 2.1 方法提要 试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。 2.2 试剂和溶液 除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。 2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯 2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水 2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水 2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水 2.2.5 苯：色谱纯 2.2.6乙腈：色谱纯 2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯
2.2.8氯化钠（NaCl） 2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4） 2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4） GB/T 18979-2003 2.2.11氯化钾（KCl） 2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。 2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。 2.2.14 pH7.0磷酸盐缓冲溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液与29.1mL 0.1mol/L 的氢氧化钠溶液混匀后，稀释到100 mL。 2.2.15 黄曲霉毒素标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2）：纯度≥99%。 2.2.16 黄曲霉毒素标准贮备溶液：用苯-乙腈（98+2）溶液分别配制0.100mg/mL的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准贮备液，保存于4oC备用。 2.2.17 黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准贮备液，用苯-乙腈（98+2）溶液稀释成混合标准工作液。 2.2.18 柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）：称取0.1g碘，溶解于20mL甲醇后，加纯水定容至200mL，以0.45μm的尼龙滤膜过滤，4℃避光保存。 2.3 仪器和设备 实验室常规仪器、设备、材料及下列各项。 2.3.1 高速均质器：18,000 r/min ~22,000 r/min。 2.3.2 黄曲霉毒素免疫亲和柱。 2.3.3 玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。 2.3.4 玻璃注射器：10 mL，20mL。 2.3.5 玻璃试管：直径12 mm ，长75mm，无荧光特性。 2.3.6 高效液相色谱仪：具有360nm激发波长和大于420nm发射波长的荧光检测器。 2.3.7 空气压力泵。
黄曲霉毒素的危害限量标准及快速定量检测方法
黄曲霉毒素的危害、限量标准及快速定量检测方法 黄曲霉毒素（Aflatoxins，简写 AF）主要为黄曲霉和寄生曲霉的次生代谢产物。在温暖与潮湿的气候地区粮食和饲料凡是被黄曲霉和寄生曲霉污染的都可能存在黄曲霉毒素。黄曲霉毒素最易污染的有花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯，大豆粕被黄曲霉毒素污染的程度轻些。 在我国，粮食和饲料被黄曲毒素污染的 概率很高， 给饲料企业以及养殖业主带来了很大的损失，人 们食用含有黄曲霉毒素的食物危害到人体健康。 一、黄曲霉毒素的理化特性 目前已经确定的黄曲霉毒素的结构有AFB1、AFB2、AFM1等 18 种， 它们的基本结构中都含有二呋喃环和氧杂萘邻酮（又名香豆素）， 前者为其具有毒性的结构，后者可能与其的致癌性有关。黄曲霉毒素很难溶解于水、己烷、乙醚和石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿以及二甲基甲酰胺（DMF）等有机溶剂中。分子量为 312-346，熔点为 200-300℃，黄曲霉毒素耐高温，通常加热处理方式对其的破坏很小， 只有在熔点的温度下才能发生分解。 黄曲霉毒素遇碱情况下能迅速分解， 但此应可逆， 即在酸性的条件下又能复原。一般来说，温度30℃、相对湿度80%、谷物水份在14%以上（花生的水份在9%以上）最适合黄曲霉繁殖和生长。在 24-34℃之间， 黄曲霉菌产毒量最高。 几乎所有谷物、饲草和各种食品（包括畜产品）都可作为黄曲霉基质。
二、黄曲霉毒素对动物和人的危害 2.1 黄曲霉毒素对动物的危害 黄曲霉毒素的毒性非常高，是目前已发现霉菌中毒性最大的一种。目前发现的18种黄曲霉菌毒素家族中， AFB1的毒性最为最为强烈，AFM1、AFG1 次之，AFB2、AFG2、AFM2 毒性较弱。AFB1的毒性是砒霜的68倍，其诱发肝癌的能力甚至比二甲基亚硝胺大75倍之多。其毒性的大小因动物的种类、年龄、性别、体况及营养状况的不同而有所差异，年幼动物、雄性动物较敏感。 黄曲霉毒素具有很强的诱导突变、抑制免疫以及强致癌的作用。黄曲霉毒素起作用的靶器官主要是肝脏，动物的中毒症状以全身性出血、消化机能发生障碍及神经系统的紊乱为特征。急性中毒症状主要表现为食欲废绝，运动失调，排泄停止，肝炎，黄疸，肝脏充血、出血、肿大、变性和坏死，并且伴有比较严重的血管和中枢神经的损伤，动物中毒后几小时至几天内发生死亡。慢性中毒的早期症状表现为食欲不佳，体重减轻，生产性能降低，胴体和蛋壳品质出现下降，后期出现黄疸，脂肪肝、肝损伤以及抑制动物的免疫机能和致癌等作用。 2.2 黄曲霉毒素对人类健康的危害 黄曲霉毒素被公认为强致肝癌的物质，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的致癌性最强。如果长期食用含有低水平黄曲霉毒素的食物的人，其肝脏将受到较大的损害。最近在第三世界的国家报道了人许多黄曲霉毒素急性中毒的新证据，其综合病症的显著特征为呕吐、腹痛、肺水肿、惊厥痉挛、昏迷、大脑水肿而引起死亡和肝脏、肾形矿脉和心脏的脂肪过多。1988年国际癌症研究中心（IARC）将黄曲霉毒素B1列为人类的强烈致癌物之一，这已经被许多亚洲和非洲的流行病研究者证明在日粮黄曲霉毒素和肝细胞癌（LCC）有正效应得到证实。另外，人因黄曲霉毒素而致癌可能与年龄、性别、营养状况以及肝或者寄生虫感染有关。Shank 等（1972）在泰国调查市售的食品和家庭的熟食（膳食），计算出每人每日平均摄入的黄曲霉毒素量，发现黄曲霉毒素的摄入量与肝癌发病率的地区分布相一致。菲律宾的玉米和自制花生酱黄曲霉毒素污染严重，其中一个以玉米做为主食的地区
黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案
. 黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案 一、黄曲霉毒素介绍 黄曲霉毒素(aflatoxin，简称为AF)是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素。 它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒 素比较耐热，加热至230℃才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易消除。 二、黄曲霉毒素对人体的危害 1、引起急、慢性中毒： 黄曲霉毒素是剧毒物质，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素属肝脏毒，除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝脏蛋白质的合成，黄曲 霉毒索引起人类的急性中毒事件，国内外均有许多报导，最典型的是印度的霉变玉米事件，该事件直接导致了数十人丧生，数百人患上不同类型的肝脏疾病。 2、致癌性： 黄曲霉毒素有极强的致癌性，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍，是目前公认的致癌性最强的物质之一。另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素含量在30~50ug/kg时为低毒，50~100ug/kg时为中毒，100~1000ug/kg时为高毒，1000ug/kg以上为极毒。鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性，我国对其在食品中的含量作了严格规定，其中，乳制品中黄曲霉毒素最高允许量为5ug/kg（即5ppb）。 三、黄曲霉毒素的种类 . .
黄曲霉毒素主要有4种：即B、B、G、G，其中B被认为是主要的有毒物质，12121有2种这些毒素的代谢产物M和M。其中黄曲霉毒素B主要存在于农产品，动物112饲料，中药等产品中；黄曲霉毒素M是动物摄入黄曲霉毒素B后在体内 经羟基11化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。黄曲霉毒素M的毒性和致癌1性与黄曲霉毒素B的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿 的主要食1品，所以其危害性更大。 四、最新政策及国标（含国外一些政策） 1、自2003年8月1日起，凡在我国境内从事米、面、油、酱油、醋生产加工的企业，其产品须经检验合格后方可上市。国家质检总局发布的《关于印发小麦粉等5类食品生产许可证实施细则的通知》中明确规定，黄曲霉毒素B必须1 检测。 2、在第八期《中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局公报》中发布关于黄曲霉毒素检测方法的最新国标： （1）、GB/T 18979-2003 《食品中黄曲霉毒素的测定——免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》 （2）、GB/T 18980-2003 《乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定——免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》 以上两项国标均在2003年8月1日开始实施 3、2002年2月4日欧盟决议对从中国进口或委托从中国进口的花生和花生制 品实施黄曲霉毒素强制性检测的特殊条件 五、中国及国际上对黄曲霉毒素的检测标准 . . 1、主要国家：
饲料中检测黄曲霉毒素的解决方案
黄曲霉毒素属剧毒物质，是迄今发现的最强的化学致癌物，并且具有强烈的致畸、致突变作用。动物饲料中玉米、花生饼、棉籽饼等黄曲霉毒素的含量常常超过国家《饲料卫生标准》中的最高限量。因此，在饲料生产过程中对黄曲霉毒素的含量及其毒性进行有效的系统控制显得尤为重要。 严格控制生产到销售的各个环节，认真做好饲料的安全检测，可起到防微杜渐的作用。 真菌毒素是由产毒真菌产生的代谢物，其广泛存在于饲料中。在适宜的温、湿度条件下，这些产毒真菌就会生长繁殖，产生真菌毒素；真菌毒素也可能因畜禽食用了含真菌毒素的粮食而进入其乳、蛋中从而再次带入食物链。 在众多真菌毒素中，黄曲霉毒素是目前发现存在范围最广、毒性最大的毒素。饲料被黄曲霉毒素污染后，主要引起三个方面的危害：▲ 由黄曲霉毒素引起的饲料变质 ▲ 因黄曲霉毒素而引起的动物中毒，奶牛中毒将影响到其代谢物——牛奶及其奶制品安全。▲ 可能通过食物链而对人体产生危害。 国家《饲料卫生标准》中饲料产品黄曲霉毒素的标准如下： 真菌毒素检测法 真菌毒素的检测方法可以分为三类： ● 胶体金免疫层析方法：胶体金检测卡、胶体金快速检测试纸条；● 酶联免疫吸附测定法：ELISA 试剂盒；● 高效液相色谱法：免疫亲和柱。 饲料中检测黄曲霉毒素的解决方案 黄曲霉毒素B1允许量 产品名称 检测限（ug/kg） 玉米、花生粕、棉籽粕、菜籽粕 ≤50豆粕 ≤30仔猪配合饲料及浓缩饲料 ≤10生长肥育猪、种猪配合饲料及浓缩料≤20肉用仔鸡/鸭前期、雏鸡/鸭配合料及浓缩料≤10肉用仔鸡后期、生长鸡、产蛋鸡配合料及浓缩料≤20肉用仔鸭后期、生长鸭、产蛋鸭配合料及浓缩料 ≤15奶牛精补料≤10肉牛精补料 ≤50 胶体金检测卡／试纸条免疫亲和柱 ＥＬＩＳＡ试剂盒
2015版药典黄曲霉毒素测定法
2351 黄曲霉毒素测定法
第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 - 乙腈 - 水
(40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测， （1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g， 加入甲醇 100ml 使溶解， 用水稀释至 1000ml 制成)， 衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃； （2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm） ；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。 混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、 黄曲霉毒素
B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。 供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于
均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 分别精密吸取上述混合对照品溶液 5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色
谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述 供试品溶液 20~25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄 曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 的量，计算，即得。 【附注】 (1)本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
(2)残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器(装有 10％次氯酸 钠溶液)内，浸泡 24 小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
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2010 年版药典第二增补本修订该法，增加光化学衍生法。
2010版药典 黄曲霉毒素检验法
2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版） 附录ⅨV 黄曲霉毒素测定法 本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。 混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。 供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。即得。 测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。 【附注】（1）本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。 （2）残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
黄曲霉毒素M1如何检测
黄曲霉毒素M1如何检测 黄曲霉毒素M1是一种强致癌物，它一度存在于一些纯牛奶中，引起食品安全隐患的讨论。相比三聚氰胺，黄曲霉素是否更难检测?这里，环凯技术整理出全套的专业检测方法，让乳和乳制品中黄曲霉毒素M1无处遁形。 检测范围 牛奶，奶粉，发酵乳，干酪，奶油等乳制品 检测原理 黄曲霉毒素M1易溶于极性溶剂，因此均匀基质中的黄曲霉毒素M1可以通过甲醇/水震荡分散提取，对于高脂肪/油含量的样品基质加入正己烷予以脱脂。本方法采用免疫亲和柱净化，荧光检测器测定乳制品中黄曲霉毒素M1。 设备耗材 黄曲霉毒素免疫亲和柱 高效液相装置带荧光检测器 均质机 水平振荡器 SPE转接头及50ml大容量上样器 分析天平(精度0.02 g) SPE装置带抽真空系统 黄曲霉毒素M1标准品 PBS 缓冲溶液：称取1.16 g Na2HPO4，0.20 g KH2 PO4，8 g NaCl和0.2 g KCl 溶于900ml水中，用HCL或NaOH调节pH至7.4，然后定容至1000ml; 甲醇(色谱纯) 乙腈(色谱纯) 正己烷(分析纯) 样品前处理
牛奶样品 1. 称取25g(精确至0.01 g)混匀的样品，置于50 mL具塞离心管中，水浴加热至35℃～37 ℃，6000 r/min下离心10 min。收集全部上清液，待净化; 2. 发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型) 3. 称取25 g(精确至0.01 g)混匀的样品，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，9500r/min下均质5 min，水浴加热至35℃～37 ℃，6000 r/min 下离心10 min。收集全部上清液，待净化。 4. 乳粉和粉状婴幼儿配方乳制品 5. 称取10 g(精确至0.01 g)样品置于250 mL烧杯中，加入50 mL约50 ℃的水于乳粉中，玻璃棒搅拌均匀。溶解后冷却至室温，移入100 mL容量瓶中，水洗烧杯并转移洗涤液，用PBS定容至刻度后装入离心管6000转/分钟下离心15 min，混合上清液，取50mL上清液待净化。 干酪 食品检测方法：切取均质的样品5g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇，9500 r/min下匀浆5 min，超声提取30 min，6000r/min 下离心10 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中，同时加入30 mL正己烷，振摇2 min，分层后，弃去正己烷层。重复用正己烷提取2次。提取液减压浓缩至约2 mL，转移浓缩液至离心管，烧瓶用甲醇-水溶液(1+4)5 mL分2次洗涤并倒入50 mL离心管中，加PBS溶液稀释至50 mL，6000r/min下离心5 min，上清液待净化。 奶油 食品检测方法：称取5g(精确至0.01 g)试样，置于50 mL烧杯中，用20 mL 正己烷将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中，待分层后，将下层溶液全部移到100 mL 圆底烧瓶中，旋转蒸发仪减压浓缩至约5 mL，加PBS稀释至约50mL，待净化。 免疫亲和柱净化 1.将IAC装于固相萃取装置上，接上大体积上样器，10ml PBS溶液活化柱子，流速保持在2–3 ml/min，确保上样前柱子保留少量(0.5ml)的PBS溶液，活化液不收集; 2.将待净化液加入免疫亲和柱，流速不超过5 mL/min，不收集流出液; 3.用约20ml去离子水淋洗柱子，流速不超过5 mL/min，抽真空1分钟，不收集流出液;