丹皮酚对小鼠体内药动学及组织分布情况的研究

丹皮酚对小鼠体内药动学及组织分布情况的研究

李清侠,赵春阳,莫家钰,刘晓华,富志军,冯 锋(中国药科大学中药制剂教研室南京211198)

摘要:目的 探讨丹皮酚在小鼠体内的药动学及组织分布情况。方法 采用HPLC 法测定丹皮酚在血浆、组织中含量。结果 小鼠一次性

灌胃丹皮酚(65mg #kg -1

)后,体内药动学呈单室模型,其主要分布在肝,其次是脾、小肠上端、肾、结肠、心、肺。结论 本研究为设计丹皮酚新型

给药系统提供可靠的生物药剂学依据。

关键词:丹皮酚;H PLC 法;血浆;组织分布

中图分类号:R96911 文献标识码:A 文章编号:1006-3765(2011)-07-0045-03

作者简介:李清侠,女(1985105-),中国药科大学中药制剂专业硕士研究生。联系电话:151********。E -mail:jvclixin@1631com 通讯作者:富志军,副教授。E -mail:fuzhijun562@yahoo 1com 1cn

牡丹皮为毛茛科植物牡丹P aeonia suffr uticosa A ndr 1的干燥根皮,其主要生物活性物质为丹皮酚(Paeonia,Pae)112。Pae 药理活性广泛,其中枢镇痛作用与吗啡相比无耐受性、不被纳洛酮影响,其镇痛作用与脑内单胺类递质水平密切相关,是一种非麻醉性镇痛药,适用于慢性钝痛12,32。目前Pae 在小鼠体内药动学研究已有报道,但尚未发现有报道P ae 在小鼠组织中分布特点的研究。本实验采用HPLC 法测定给药后Pae 在小鼠血浆及组织中的分布,探讨Pae 在小鼠体内的药代动力学特点。1 材料

111 仪器 T L G -16冷冻高速离心机(湘仪集团);F innpipette 移液枪(美国T hermo F isher 公司);AE240型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);玻璃匀浆器;美国A gillent1100液相色谱仪系统。

112 试药 Pae 标准品(中国药品生物制品检定所,批号:110708-200506);Pae 提取物(实验室自制,纯度:951504%);乐百氏纯净水;甲醇、乙腈为色谱纯;CM C -Na 、氯仿、盐酸等为分析纯。

113 动物 小鼠体重为20~25g,雌雄各半,南京青龙山动物繁殖厂提供,实验室饲养3天后实验。2 方法

211 实验溶液的配制

21111 标准品溶液的制备:精密称取Pae 标准品10mg,于100mL 容量瓶中,用甲醇溶解、混匀,定容至刻度,即得标准品贮备液。分别量取该贮备液1、2、5、10、15、20mL 于100mL 容量瓶中,甲醇定容至刻度,即得浓度为110、210、510、1010、

1510、2010L g #mL -1

的标准品系列溶液。21112 Pae 混悬液的配制:取适量Pae 提取物充分研细,精称650mg 置100mL 量瓶中,加015%CM C -Na 水溶液至刻度、摇匀,即得615mg #mL -1Pae 混悬液。212 血浆样品及组织样品的处理方法

21211 空白血浆加标准品制备:取一定体积Pae 标准品溶液置干燥试管中,氮气流干,加空白血浆200L L,涡旋2min,加入

400L L 乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,4000r #min -1离心15min,上清液于15000r #min -1离心12min,取上清液20L L 进样分析。21212 血浆样品制备:取各小鼠给药后血浆200L L,加入400L L 乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,4000r #min -1离心15min,上清液于15000r #min -1离心12min,取上清液20L L 进样分析。21213 空白组织匀浆液加标准品制备:取一定体积Pae 标准品溶液置干燥试管中,用氮气吹干,分别加各空白组织匀浆液200L L ,涡旋2min,加入400L L 乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,4000r #min -1

离心15min,上清液于15000r #min -1

离心12min,

取上清液20L L 进样分析。

21214 组织匀浆样品制备:取给药后小鼠心、肝、脾、肺、肾、小肠上端、结肠匀浆液200L L ,分别加400L L 乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,4000r #min -1

离心15min,上清液于15000r #min -1

离心12min,取上清液20L L 进样分析。213 HPL C 方法学考察

21311 色谱条件:色谱柱:I nertsil ODS -SP (416@150mm,5L m);流动相:甲醇-水(60B 40);检测波长:274nm;流速:110mL #min -1;柱温:30e ;进样量:20L L 。

21312 检测方法专属性考察:分别取标准品溶液、空白血浆样品、空白血浆加标准品、血浆样品、空白肾组织样品、肾组织样品,按/213110项色谱条件分析,结果(见图1)。

由色谱图知此色谱条件下,血浆及各组织中内源性物质对P ae 测定无干扰,样品中Pae 得到较好分离,其色谱峰的保留时间与对照品一致。

21313 检测限考察:精密量取110L g #mL -1的Pae 标准品溶液10L L,置干燥试管中,氮气吹干。分别加血浆和各组织匀浆液200L L ,制成含Pae 为0105L g #mL -1的样品,同时制备空白血浆样品和空白组织匀浆样品,按/2120项处理后,各取20L L 进行分析,用信噪比法,取峰高为基线噪音3倍时的浓度为最低检测浓度,得Pae 最低检测浓度为0105L g #mL -1。21314 标准曲线的制备:精密量取各P ae 标准品溶液80L L,置干燥试管中,用氮气流吹干,加空白血浆012mL ,涡旋2min,制备成014、018、210、410、610、810L g #mL -1的系列空白血浆标准品溶液,按/212120项方法处理。按/213110项色谱条件,测定不同浓度样品中Pae 的峰面积。以峰面积(Y )对

样品浓度(X )作线性回归,得回归方程为Y =501245X -251389,r =019995,n=6,表明Pae 在014~810L g #mL -1范围内线性关系良好。

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45#Strait Pharmaceutical Journal Vol 23No 172011

图1A1Pae标准品溶液、B1空白血浆样品、C1空白血浆加标准品、D1血浆样品、E1空白肾组织样品、F1肾组织样品(Pae保留时间在6135min左右)

按照/212130项办法处理、制备空白组织匀浆液加标准品,按/213110项色谱条件,制备P ae在心、肝、脾、肺、肾、小肠、结肠中的标准曲线,分别为:1心Y=381784X-715064, (011~410L g#mL-1),r=019996,n=6;o肝Y=31109X-210028,(011~810L g#mL-1),r=019996,n=6;?脾Y= 871818X-291116,(011~810L g#mL-1),r=019997,n=6;?肺Y=771341X+018087,(011~410L g#mL-1)r=019997,n =6;?肾Y=651282X-217899,(011~410L g#mL-1)r= 019995,n=6;?小肠Y=691065X-17185,(011~810L g# mL-1),r=019999,n=6;?结肠Y=271249X-101771,(011 ~810L g#mL-1)r=019999,n=6。

21315精密度试验:分别精密量取410L g#mL-1的血浆标准品溶液20L L,按/213110项色谱条件,连续进样分析6次,峰面积的RSD为1189%(n=6)。

21316稳定性试验:分别制备浓度为110、810、1610L g#mL-1的空白血浆加标准品溶液,按照/212110的方法处理,-20e条件下保存,于0、1、2、4、8、12、24h进样分析,峰面积的RSD为1167%(n=6)。

214动物分组及生物样品预处理小鼠55只,随机分为11组,每组5只,给药前禁食12h,Pae按65mg#kg-1的剂量灌胃给药,于给药后3、5、7、10、15、30、45、60、90、150、240min眼球取血约1mL,置肝素抗凝的离心管内,4000r#min-1条件下离心15min,制备血浆样品,于-20e冰箱保存。将取血后的小鼠立即处死、解剖,分别取出心、肝、脾、肺、肾、小肠上端、结肠,用生理盐水洗去表面浮血、滤纸吸干水分后,各组织精密称重。分别取等量小鼠各组织样品于干燥的玻璃匀浆器中,加入117mL生理盐水充分研磨,组织匀浆液于4000r#min-1条件下离心15min,上清液置-20e冰箱保存。

215生物样品H PLC检测分别取/2140项预处理的血浆样品和组织样品各200L L,按/2120项办法处理,样品按/213110项的色谱条件进样分析。

3结果

实验数据以/均数?标准差(X?S)0表示,血药浓度与时间数据用药物和统计软件(DA S110)进行房室模型拟合并计算药动学参数。

311小鼠血浆中Pae含量HP LC法测定血浆中Pae浓度,见表1,平均血药浓度-时间曲线(见图2)。

表1小鼠灌胃给药后血浆中Pae浓度(ng#mL-1),n=5,X?S t#min-1X?S(ng#mL-1)

3m i n13851657?1291845

5m i n56741641?1791201

7m i n17641467?1171818

10min9471139?1031493

15min8121466?521368

30min768168?211466

45min7331519?221634

60min6871743?111491

90min6641524?3019

150m i n560147?28117

240m i n4501587?171

949

图2小鼠灌胃Pae后血药浓度-时间曲线,n=5,X?S

表2小鼠一次性灌胃Pae65mg#kg-1药动学参数,n=5,X?S

参数X?S

Ke#min-111126?0106

Ka#min-111107?01039

t1/2ka#min-10162?012

t1/2ke#min-16115?213

M RT#min-153121?4151

Cmax/(mg#L)61461?21045

Tmax#min-15133?01152

AUCt/min/(m g#L)17812273?10134

AUCi/min(mg#L)1781943?10135

312小鼠灌胃给药房室模型判断及体内药动学参数将小鼠灌胃后血药浓度-时间数据用DAS110药动学程序软件进

# 46 #海峡药学2011年第23卷第7期

行处理,经模型拟合,结果既有一室型又有二室型。以AI C (拟合精度判据)最小原则为指标,本实验最小A IC=12192,结果显示:最佳房室模型为一室模型,拟合权重系数W=1,从而确定Pae灌胃给药后在小鼠体内药动学过程符合单室模型。

按单室模型,用DAS110药动学程序软件计算小鼠灌胃给药的药动学参数(见表2)。

313小鼠组织中Pae的浓度及组织分布情况HPL C法测定给药后心、肝、脾、肺、肾、小肠上端、结肠匀浆液中Pae含量(见表3)。以Pae在各组织中浓度变化的A UC为依据绘制组织分布曲线(见图3)。

表3小鼠灌胃给药组织匀浆液中的Pae浓度(ng#mL-1),n=5,X?S

t#min-1心肝脾肺肾小肠结肠338816?9630?1431745615?4514256144?16629113?57797156?6311524713?8111 541614?12312121418?55954614?4911575114?16815650712?1231003164?188********?16512 72020?134********?31411673011?311311067134?25918370317?1252027169?1871371514?17111 101192?223554714?3089992177?29148596128?31219387318?2664721140?1074108102913?4911 15634?4472614?12231578183?402169529171?881481284?811355197?303154137717?36012 3042911?117191510?630197312?339108459107?66168848?4361001123?1761791910?7718 4538612?12916947?8111841132?116174457179?47135523?238813?135103107216?10817 6032719?14917913?57714166?55183271143?29180337?170712113?12911370515?18912 9028013?381261817?22114593132?64138160113?28184301?160514125?54120547?19614 150221?3045719?14518407168?62108118118?20177198?71498132?2418430414?9612

24016512?1091117217?6511217123?9120103131?40183105?1511366156?2114615?561

1

图3给药4h后小鼠体内Pae的分布,n=5,X?S

4结论

411小鼠一次性灌胃给药后,Pae在小鼠体内呈单室模型,其血药浓度-时间曲线类似于静脉给药,即给药后血药浓度很快达到峰值。Pae灌胃给药后1min即可在小鼠血浆中测到原形药,513min血药浓度达到峰值,表明Pae口服吸收迅速; 150min后血药浓度降至Cmax1/10以下,240min时血药浓度已接近检测限,表明P ae在体内清除速率较快。

Pae经灌胃给药后,在小鼠各组织中的t max与血药浓度t max接近,各组织中药物浓度达峰后很快下降,表明P ae在组织中分布快,消除也快;Pae在小鼠体内主要分布在肝,其次是脾、小肠上端、肾、结肠、心、肺。

412中药有效成分含量通常较低,进入体内后浓度更低,因此考察不同生物样品处理方法极为重要。生物样品处理方法有蛋白沉淀法、液-固相萃取法、化学衍生化法等142。本实验采用蛋白沉淀法,对三氯乙酸、甲醇、乙腈、乙醚4种蛋白沉淀剂进行考察,发现乙腈处理时,杂质对P ae测定干扰少,方法简便、准确,重复性好,可满足样品分析要求;实验对乙腈用量进行考察,发现2倍量时既充分沉淀蛋白,且加入体积少,不影响样品测定。

413口服药物在设计剂型时要充分考虑到药物的吸收特性:若药物主要在胃肠道上、中部吸收,制剂时主要考虑延长药物在胃肠道上、中部滞留时间;如果药物在全程都有良好吸收,主要考虑使药物均匀释放即可。实验数据显示Pae在小鼠胃肠道全程均有良好吸收特性,但其消除相半衰期较短,在给药后4h,小鼠体内的P ae浓度已接近检测限。Pae及其复方制剂已有片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等多种剂型,服用这些制剂时易出现血药浓度峰谷现象明显等问题。将Pae应用于治疗胃肠道疾病,尤其是结肠部位疾病时,药物在消化道上端吸收速度较快,肝分布较多,使得药物到达结肠局部浓度较低,生物利用度较低,治疗效果较差,故用于肠道疾病治疗时可以考虑将Pae设计为靶向/缓释制剂。

参考文献

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Strait Pharmaceutical Journal Vol23No172011