慢性乙型肝炎患者血清细胞因子检测的临床意义

[作者简介] 周力(1960-),女,本科,主任医师,主要从事肝病

诊断与治疗工作。

=临床检验>

慢性乙型肝炎患者血清细胞因子检测的临床意义

周力,王亮

(吉林省人民医院,长春 130021)

[摘要] 目的:了解慢性乙肝患者血清细胞因子变化与肝脏功能、HBV DNA 含量的相关性。方法:选取2008年1月~2009年1月我院肝病科住院的慢性乙肝患者80例,并选取50例门诊体检者作为对照组,两组性别年龄无明显差异。所有研究对象均采静脉血5m ,l 采用双抗体夹心EL IS A 方法,进行细胞因子:肿瘤坏死因子A (TNF -A )、C 干扰素(C -IFN )、白细胞介素-6(IL -6)、白细胞介素-10(I L -10)水平测定和乙型肝炎标志物及肝功能分析;观察组同时用实时荧光定量PCR 方法进行HBV DNA 含量检测。结果:观察组为H bs A g 和HbeA g 阳性,A LT 增高;血清HBV -DNA 含量与A LT 水平呈正相关(r =0157,t =6113);慢性乙肝患者TNF -A 、C -IFN 、I L -6、I L -10含量均较正常对照组高,其中TN F -A 、IL -6、I L -10含量明显增高,与正常对照组比较差异显著,有统计学意义;慢性乙肝患者TN F-A 、C -IFN 、IL -6、IL -10含量与A LT 水平和HBV -DNA 含量均呈正相关且有统计学意义。结论:慢性乙肝患者存在T 淋巴细胞调控网络失衡。了解细胞因子在慢性乙肝发病中的作用,对于判断慢性乙肝病情及指导治疗有重要意义。[关键词] 慢性;乙型肝炎;细胞因子[中图分类号] R 519

[文献标识码] B [文章编号] 1004-8685(2009)12-2866-03

C linical significance of deter m ination of seru m cytokine in patients w it h chronic hepatitis B

Z H OU L i ,WAN G L iang

(The People c sH o spita l o f Jili n P rov i nce ,Changchun 130021,China)

[Abstract] O bjective :T o explore se ru m cytokine changes and liver functi on ,HBV DNA con tent of re levance i n pa ti ents w it h chron ic hepatitis B 1M ethod s :Select 2008~2009y ea r i n January i npa ti ent ho spita l liver disease 80cases o f chron i c hepa titis B patients ,and 50cases o f out-pa ti ent physica l ex a m i nati on w ere se lected as the control group ,no s i gnificant difference i n sex and age g roups 1H ave b l ood taken f o r a ll sub jects 5m ,l usi ng doub l e anti body sand w i ch EL ISA m ethod ,t he cell factor :t u m or necrosis factor-A (TNF -A ),C i nte rferon (C -IFN ),i nte rleuki n -6(I L -6),Inter l euk i n -10(I L -10)leve lsm easured and hep -a titi s B m arke rs and li ve r function ana l ys i s ;the observa ti on group at t he sa m e ti m e usi ng rea l-ti m e fl uorescence quantitati v e PCR m ethod o f de tecti on o fH B V DNA levels 1R es u lts :The observation g roup ofH bs Ag and H beA g are pos i tive ,ALT i ncreased ;seru m HBV -DNA l eve ls and A LT levels w ere positively correlated (r =0157,t =6113,);chron i c hepatitis B patien ts w ith TN F -A ,C -IFN,IL -6,IL -10lev els h i ghe r than those i n nor m a l contro l group ,i n which TNF -A ,I L -6,I L -10w ere si gn ifi cantl y h i gher com pared w it h the nor m al contro l g roup ,significant difference ,the re i s sta ti sti ca l s i gnificance ;chronic hepatitis B pa ti ents w it h TNF -A ,C -I FN,IL-6,IL -10levels and A LT leve ls and HBV -DNA levels w ere positi ve l y correlated and t here is sta -ti stica ll y si gnificant 1Con clusi on :Ex istence of T l ymphocytes i n patien ts w it h chronic hepatitis B regu l a t o ry ne t w orks i m ba-l ance 1Understand i ng of cy tok i nes in the pathog enesis o f chronic hepatiti s B ,for j udg i ng the condition and gu i de the treat m ent of chron ic hepatitis B are i m portant 1[K ey words] Chronic ;H epatitis B ;Cy tok i ne

我国是乙肝病毒(H B V )感染的高发国家和乙型肝炎的发病大国,约113亿人成为慢性H B V 感染者,其中慢性乙型肝炎患者近3000万人[1]。每年约30万人死于HBV 慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝癌等疾病。乙型肝炎的发病机制迄今尚未完全阐明。人感染HBV 后,可引起细胞免疫和体液免疫应答,并激发自身免疫反应及免疫调节功能紊乱。本研究对2008年1月~2009年1月我院肝病科住院的80例慢性乙肝患者血清细胞因子:肿瘤坏死因子A (TN F -A )、C 干扰素

(C -IFN )、白细胞介素-6(I L -6)、白细胞介素-10(IL -10)水平、乙型肝炎标志物、肝功能进行测定,同时用实时荧光

定量PCR 方法进行H BV DNA 含量检测。现报道如下。1 对象与方法

111 研究对象

11111 观察组 2008年1月~2009年1月在我院肝病科住院的慢性乙型肝炎患者。年龄40~60岁,中位年龄:(49158?10132)岁,其中男性53例,女性27例。所有观察对象均于入院次日晨留取静脉血进行细胞因子、乙肝标志物、肝功能及H BV DNA 检查。慢性乙型肝炎诊断符合2005年中华医学会

肝病学及感染病学分会联合制定的5慢性乙型肝炎防治指南6[2]标准。乙肝五项中H bs A g阳性,其它项不限;HBV DNA 为阳性;ALT升高。半年内未用过免疫调节剂。排除乙肝病毒外其它病毒、细菌、真菌感染。

11112对照组同一时期我院门诊体检的健康志愿者。共50例,年龄:40~60岁,中位年龄:(4315?519)岁;男:25例,女:25例。于体检时取静脉血5m,l分离血清进行细胞因子、乙肝标志物、肝功能及HBV DNA检查。

112研究方法

11211主要试剂细胞因子酶联免疫试剂盒为北京鼎国公司产品;血生化试剂盒为北京九强生物技术有限公司产品;HB-VM试剂盒为美国亚培公司产品;HBV DNA荧光定量PCR试剂为上海科华公司产品。

11212主要仪器设备酶标仪为雷博公司生产;生化分析仪为日本O l ympus-7540;HBVM分析仪为美国亚培公司AR-C H ITECT I2000;荧光定量PCR仪为杭州博日产品。

11213实验方法1TNF-A、C-IFN、IL-6、IL-10含量测定,用EL IS A方法,严格按照试剂盒说明书进行。oALT、血清乙肝病毒标志物:HB s Ag、H Bs Ab、HBeA g、H Be A b、H be A b按仪器、试剂说明操作。?HBV DNA检测用适时荧光定量PCR 方法,按试剂说明,用荧光定量PCR仪检测。

11214统计学处理检验数据以均数士标准差(x?s)表示,各均数间比较用t检验,相关性分析采用直线相关分析,以a= 0105为检验水准。

2结果

211慢性乙肝患者肝功能变化

80例患者H bs Ag、H BV-DNA均阳性,ALT均升高;其中有21例抗-H be和HB e A g阴性、有23例抗-HBe阳性和HBeA g阴性、36例同时伴有H be A g阳性。这三组患者血清A lt 依次增高。

212慢性乙肝患者H B V-DNA含量与ALT水平的关系80例慢性乙肝患者血清H BV DNA含量从3101@103拷贝/m l~9175@107拷贝/m,l规定H BV DNA含量\105拷贝/ m l为高病毒含量组,105拷贝/m l~104拷贝/m l为中含量组, <104拷贝/m l为低含量组[3]。结果高含量组30例,中含量组27例,低含量组23例。慢性乙肝患者血清A LT值为63~ 486I U/L。血清H B V-DNA含量多少与ALT水平高低成正相关,r=0157,t=6113,P<01001。

213慢性乙肝患者细胞因子的变化

慢性乙肝患者TN F-A、C-IFN、I L-6、IL-10含量均较正常对照组高,其中TNF-A、I L-6、I L-10含量明显增高,与正常对照组比较差异显著,有统计学意义,见表1。

表1慢性乙型肝炎患者细胞因子水平(pg/m l)组别例数TNF-A C-I F N I L-6I L-10(ng/L)观察组8016147?313221198?7108125166?3016017122?313

对照组5010109?017920130?513156161?171766117?1139 t值1312911451414522155

P值<01001>0105<01001<01001214慢性乙肝患者细胞因子含量与A lt水平和HBV-DNA 含量的相关性

慢性乙肝患者TN F-A、C-IFN、IL-6、I L-10含量与ALT水平和HBV-DNA含量均呈正相关且有统计学意义,见表2。

表2慢性乙肝患者细胞因子含量与A lt

水平和H BV-DNA载量的关系

T N F-A C-I F N IL-6I L-10(ng/L) r与Alt水平0173016701820181

t值914871981216212127

P值<01001<01001<01001<01001 r与H BV-DNA载量0149015001630155 t值5100510971175179

P值<01001<01001<01001<01001

3讨论

我国病毒性肝炎的发病率增长较快,已由2000年的64191/10万人上升至2006年的102109/10万人,慢性乙肝患者已达2000多万人,约占人口总数的116%左右。世界卫生组织报告,每年因乙肝死亡约75万例。乙肝是全球疾病死因的第7位,被列为要加强控制并最终消灭的传染病[3]。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。

H BV是一种嗜肝病毒,人体感染HBV后导致慢性乙型肝炎的机制目前还不清楚。主要有病原学、免疫学、遗传因素等学说假设。

乙型肝炎病毒基因(HBV DNA)位于HBV核心部位,随着分子生物学的进展,采用PCR技术检测HBV病毒的基因,具有高度的敏感性和特异性。是HBV感染最直接、特异和灵敏的指标。本研究80例慢性乙肝患者血清HBV DNA含量从3101@103拷贝/m l~9175@107拷贝/m,l且H BV-DNA含量与肝功能损害程度呈正相关。

近年来,国内外学者的研究表明:机体感染HBV后疾病发展与转归与机体免疫功能有关,T h1/T h2细胞失衡可能是H BV感染慢性化的机制之一。研究认为:那些最终从急性H BV感染恢复的人表现为T h1型反应,而慢性HBV感染者表现出T h2型反应占优势[4~6]。细胞因子在T h1和T h2型免疫反应中起重要作用。在免疫应答中,特异性抗原经抗原呈递细胞(A PC)呈递给T h细胞后,Th细胞由Th0向T h1和T h2细胞亚群分化。T h1是一类辅助性CD4T细胞,主要分泌IFN-C、TNF-C等细胞因子;T h2类细胞与B细胞增殖、分化、成熟有关,主要分泌IL-6、I L-10等细胞因子。近年研究表明Th细胞与细胞免疫、体液免疫、免疫抑制和炎症反应相关,因此各类细胞因子与慢性乙肝的关系成为国内外学者研究的热点。

本研究慢性乙肝患者TNF-A、I FN-C、IL-6、IL-10含量均较正常对照组高,其中TNF-A、I L-6、I L-10含量明显增高,与正常对照组比较差异显著,有统计学意义。I L-6、I L -10为T h2类细胞,表明慢性乙肝患者Th2型反应占优势。肝组织中有大量枯否细胞。当肝细胞受到HBV感染时,枯否

(下转第2924页)

在感染人类的三种流感病毒中,甲型流感病毒有着极强的变异性,乙型次之,而丙型流感病毒的抗原性非常稳定[3]。甲型流感病毒是变异最为频繁的一个类型,每隔十几年就会发生一个抗原性大变异,产生一个新的毒株,这种变化称作抗原转变亦称抗原的质变;在甲型流感亚型内还会发生抗原的小变异,其表现形式主要是抗原氨基酸序列的点突变,称作抗原漂移亦称抗原的量变。抗原转变可能是血凝素抗原和神经氨酸酶抗原同时转变,称作大族变异;也可能仅是血凝素抗原变异,而神经氨酸酶抗原则不发生变化或仅发生小变异,称作亚型变异。乙型流感病毒的变异会产生新的主流毒株,但是新毒株与旧毒株之间存在交叉免疫,即针对旧毒株的免疫反应对新毒株依然有效。

R ea l-ti m e PCR技术于1996年由美国A ppli ed B iosyste m s 公司推出,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,对整个PCR反应扩增过程进行实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[4]。鉴于近期甲型H1N1流感病毒的全球性流行,本实验室将R ea l-ti m e PCR技术运用于流感样呼吸道标本的检测工作,为流感临床确诊提供实验室依据。

对2007年至2008年220份呼吸道标本进行回顾性甲型H1N1流感病毒检测,结果均为阴性,说明甲型H1N1流感病毒以前在丽水是不存在的,是新输入性流感病毒;市区93(92+ 1)份密切接触者呼吸道标本甲型H1N1流感病毒核酸检测,结果为阴性,说明在密切接触者中感染率不高,建议不间断的对密切接触者开展甲型H1N1流感病毒的检测,以明确病毒排放窗口期,缩短以潜伏期为依据的隔离观察时间,为确定合理的医学观察时间提供依据。检测结果还表明2007年至2009年我市学校流感爆发疫情以乙型流感为主。

青田县7月15日5份异常流感样病例呼吸道标本甲型H1N1流感病毒核酸检测,结果阳性,结合临床表现、流行病学调查诊断该5例为同源感染引起的输入性甲型H1N1流感确诊病例,这是我市首次发现输入性甲型H1N1流感病例。7月21日莲都区1份异常流感样病例呼吸道标本甲型H1N1流感病毒核酸检测,结果阳性,结合临床表现、流行病学调查诊断该病例为输入性甲型H1N1流感确诊病例,说明我市已存在甲型H1N1流感病毒病人,甲型H1N1流感防控已进入实践阶段。该6例输入性甲型H1N1流感确诊病例的密切接触者目前甲型H1N1流感病毒核酸检测阴性,显示我市甲型H1N1流感防控已取得阶段性成果。

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(收稿日期:2009-08-05)

(上接第2867页)

细胞大量增殖并释放大量TNF-A。细胞因子以网络形势发生相互作用,TNF-A水平升高可能与细胞因子间的相互作用有关。慢性乙肝患者机体的免疫状态转向Th2型免疫反应为主,Th1/T h2类细胞失衡,导致HBV持续感染,乙型肝炎慢性化。

我们还对本组慢性乙肝患者细胞因子含量与A lt水平和HBV-DNA含量的相关性进行比较,细胞因子水平与A lt水平和HBV-DNA含量均呈正相关。相关程度依次是IL-6、IL-10、TN F-A、C-IFN。说明这些细胞因子均参与了H BV持续感染导致乙型肝炎慢性化和肝脏的炎性持续损伤。

本研究检测了慢性乙肝患者血清中TNF-A、IFN-C、IL -6、I L-10的水平,分析与A LT和HBV DNA含量的相关性,探讨了血清中HBV DNA含量与肝功能的关系、细胞因子水平变化与A LT和H B V DNA含量的关系。对于了解慢性乙肝患者机体免疫功能有一定的帮助;也为探索慢性乙肝患者免疫治疗提供依据。

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(收稿日期:2009-09-16)

围术期炎症细胞因子的监测

围术期炎症细胞因子的监测 围手术期是围绕手术的一个全过程，从病人决定接受手术治疗开始，到手术治疗直至 基本康复，包含手术前、手术中及手术后的一段时间，具体是指从确定手术治疗时起，直 到与这次手术有关的治疗基本结束为止，时间约在术前5- 7天至术后7 - 12天。 炎症反应一方面通过致炎因子直接损伤血管内皮，另一方面主要是通过一系列炎症介 质来实现；多数炎症介质通过与靶细胞结合发挥活性，炎症介质作用于细胞后可进一步引起 靶细胞释放次级炎症介质从而放大或抵消初级炎症介质的作用。不管机体遭受何种刺激， 宿主对炎症反应的总体特征非常相似，然而不同的损伤涉及不同类型的细胞，导致不同炎 症介质的产生和释放从而引起系统性和局部性损伤。通常术中的炎症反应与细胞因子的释放有关，细胞因子的作用又进一步加强了手术以及术中缺血再灌注损伤，如此恶性循环终将导致组织损伤而增加手术后临床相关并发症，影响患者的预后。 目前，手术方式以及麻醉方法、药物对恶性肿瘤术后免疫功能的影响逐渐受到重视。细 胞因子是机体免疫及炎症反应中细胞之间交流的信息分子，它们通过效应细胞表面相应的 受体对细胞生长、成熟和修复产生调控作用。创伤、应激、感染等是影响围术期病死率的 重要因素，与机体免疫状态密切相关。本文旨在总结各种炎症因子的特点、围术期使用不同药物和麻醉方式对炎症细胞因子的影响，提高患者围术期安全，从而改善患者的预后。 1. 炎症细胞因子 多达20%的肿瘤源自于慢性炎症，大部分的实体瘤都有炎性渗出物。免疫细胞对肿瘤 的发生、生长和进展有着广泛的影响，并且很多这些效应都是由促炎症细胞因子介导。在所有细胞因子中，TNF和IL-6具有促进肿瘤发生的效应，这一点是可以确定的。TNF和IL-6 作为肿瘤相关炎症和肿瘤形成的主要调节因子，使得它们在癌症的辅助治疗中成为很受欢迎 的研究目标。因此在围术期对患者进行炎症细胞因子的检测具有重要的临床意义。

精选-乙型肝炎病毒抗体诊断(胶体金法SOP)标准操作程序

乙型肝炎病毒抗体诊断（胶体金法SOP） 测定标准操作程序 编写者：宿金涛 日期：2012年3月1日 一. 原理：乙型肝炎病毒表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体检测试剂盒（胶体金法）采用胶体金免疫层析分析技术、将五个诊断意义相关的试剂通过一个包装组合在一起，同时进行乙型肝炎病毒五项标志物的检测，在不影响各自性能的情况下，便于客户的储存和使用。 HBsAg检测试剂采用双抗体夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区(T)的抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的抗HBsAg抗体反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBsAg结合，随后家何物会被固定在膜上的抗HBsAg抗体结合，在测试区内（T）会出现一条紫红色带。这条带是HBsAg抗体-HBsAg-HBsAg抗体金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如是阴性，则测试区内（T）将没有紫红色带。无论HBsAg是否存在于标本中，一条紫红色带都会出现在指控内（C）。质控区内（C）所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBsAb检测试剂双抗原夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区（T）的乙肝表面抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的HBsAg反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBsAg结合，随后结合物会被固定在膜上的HBsAg抗体结合，在测试区内(T)会出现一条紫红色条带。这条带是HBsAg-HBsAb-HBsAg金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如果阴性，则测试区内(T)将没有紫红色条带。无论HBsAg是否存在于标本中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBeAg检测试剂采用双抗体夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区（T）的乙肝e抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的HBeAg抗体反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBeAg结合，随后结合物会被固定在膜上的HBeAg抗体结合，在测试区内(T)会出现一条紫红色条带。这条带是HBeAg抗体-HBeAg-HBeAg抗体金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如果阴性，则测试区内(T)将没有紫红色条带。无论HBeAg抗体是否存在于标本中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBeAb,HBcAb检测试剂才有竞争抑制法，试剂含有被事先固定于膜上测试区(T)的抗体。

乙型肝炎感染血清标志物检测结果及临床意义

乙型肝炎感染血清标志物检测结果及临床意义 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 临床意义 -- -- -- -- -- 过去和现在未感染过HBV + -- -- -- -- (1)急性HBV感染早期,急性HBV感染潜伏期；(2)慢 性HBV携带者，传染性弱。 + -- + -- + 急性或慢性乙型肝炎感染。提示HBV复制，传染强。 即俗称的“大三阳”。 + -- -- + + (1)急性HBV感染趋向恢复；(2)慢性HBsAg携带者； (3)传染性弱。即俗称的“小三 阳”。 + + -- -- + (1)亚临床型HBV感染早期；(2)不同亚型HBV二次 感染。 （3）免疫复合物的存在。 + -- -- -- + (1)急性HBV感染；(2)慢性HBsAg携带者；(3)传染 性弱。 -- + -- + + 急性HBV感后康复。 -- -- -- -- + (1)既往感染未能测出抗-HBs(2)恢复期HBsAg已消，抗 -HBs尚未出现；(3)无症 状HBsAg携带者。 -- + -- -- -- (1)注射过乙肝苗有免疫；(2)既往感染；③假阳性。 -- + -- -- + 既往感染过乙肝病毒，现病毒已基本清除，身体在康 复。 -- -- -- + + (1)既往感染过HBV； (2)急性HBV感染恢复期；(3) 少数标本仍有传染性。+ -- + + + (1)急性HBV感染趋向恢复；(2)慢性携带者。 + + -- + -- 亚临床型或非典型性感染。 + + -- -- -- (1)亚临床型HBV感染早期；(2)不同亚型HBV二次感 染。 + -- -- + -- (1)慢性HBsAg携带者易转阴；(2)急性HBV感染趋向 恢复。 -- + + -- -- 非典型性或亚临床型HBV感染。 -- -- + -- + 非典型性急性感染。注意爆发性乙肝 -- -- + + + 急性HBV感染中期。 -- -- + -- -- (1)非典型性急性感染；(2)见于抗-HBc出现之前的感 染早期，HBsAg滴度低而呈 阴性，或呈假阳性。 -- + + -- + 非典型性或亚临床型HBV感染。 + + + -- + 亚临床型或非典型性感染早期。HBsAg免疫复合物， 新的不同亚型感染。 -- + -- + -- HBV感染后已恢复

细胞因子的ELISA方法检测

实验报告

1.取已包被抗体并完成封闭的酶标条2条，分别装于酶标架上。在每条酶标条的1~6孔分别加入稀释液100微升。 2.向第6、7孔加入分别加入2000pg/ml PGFβ1标准品100微升。 3.用加样枪吹吸混匀第6孔的液体，注意避免气泡形成。混匀后其浓度约为1000pg/ml。 4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混匀。其浓度变为500pg/ml。以此类推，一直加到第2孔。吸去多余的100微升。 5.向第8、9孔各加入100微升样品1。10、11孔加入100微升样品2. 6.封口膜覆盖酶标板，防止水分挥发。 7.将酶标板置于37℃温箱孵育120min。 8.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体，注意甩动方向，避免液体流入相邻酶标孔，造成交叉污染。 9.加入洗涤液，注意不要溢出至相邻孔，造成交叉污染。静置3min后甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 10.每个孔各加入酶标记抗体100微升。封口膜覆盖酶标板，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。 11. 取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体。再加入洗涤液，静置3min后，甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 12. 每个孔各加入底物A 100微升，再加入底物B各100微升。晃动酶标板混匀。将酶标板放入37℃温箱孵育15min显色。 13. 取出孵育后的酶标板，见酶标板孔中液体呈蓝色。 14. 每个孔各加入终止液100微升，可见液体变成淡黄色。 15.用酶标仪在450nm处测OD值。结果如下： 16. 分析结果： 将2组标准品的OD值和标本1、标本2的4个副本的OD值合并得到平均值。根据各自的OD值，在半对数坐标上标出62.5、125、250、500、1000、2000这6个不同稀释度标准品所处的位置，将6个点连线集会成标准曲线。

乙肝病毒血清标志物实验室检测的临床意义

乙肝病毒血清标志物实验室检测的临床意义 乙肝病毒（以下简称HBV）血清标志物实验室检测（即乙肝两对半检测）的临床意义对临床医生和被检对象至关重要。为了解HBV血清标志物的意义更好的为服务对象提供更高质量的解释和服务工作，现就HBV五项血清标志物常见模式的临床意义和少见模式（HBsAg、抗-HBs、HBeAg /抗-HBe同时阳性）的临床意义进行解释。 一HBV五项血清标志物常见模式的临床意义 现在国内大多数的医疗机构对HBV的检测通常采用五项血清学标志物联检，并且已经习惯了把五项结果作为一种模式全面分析了解HBV感染后的免疫状态，并以此作为诊断和疗效观察的依据。现就HBV常见的十种模式及其相应的临床意义总结见表1（摘自文献1）。 表1 HBV五项血清标志物常见模式及临床意义 模式HBsAg 抗-HB s HBeA g 抗-HBe 抗-HBc 临床意义 1 - - - - - ①过去和现在未感染过HBV；②窗 口期 2 - - - - + ①既往感染未能测出抗-HBs；②恢复期HBsAg已消失，抗-HBs尚未出现；③隐匿性HBV感染 3 - - - + + ①既往感染过HBV；②急性HBV感染恢复期；③抗-HBs出现前的窗 口期 4 - + - - - ①注射过乙肝疫苗，有免疫力 5 - + - + + ①急性HBV感染后康复；②既往感 染有免疫力 6 + - - - + ①急性HBV感染；②慢性HBsAg携 带者；③传染性弱 7 - + - - + ①既往感染，有免疫力；②急性H BV感染，恢复期 8 + - - + + ①急性HBV感染趋向恢复；②慢性 HBsAg携带者 9 + - + - + ①急性或慢性乙型肝炎感染，提示 HBV复制，传染性强。 1 0 + - - - - ①急性HBV感染早期或潜伏期；② 慢性HBV携带者，传染性弱。

细胞内细胞因子的检测

细胞内细胞因子的检测 细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。 活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。 胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。应用该方法，在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被

两种方法检测乙型肝炎病毒五项指标的结果对比

两种方法检测乙型肝炎病毒五项指标的结果 对比 作者：龙青文，何建军，马家驹，何秀琳，肖金平 【关键词】酶联；血清乳胶；定性分析 ［关键词］酶联；血清乳胶；定性分析 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、e 抗原(HBsAg)、e抗体(HBeAb)、核心抗体(HBcAb)的检测在许多方面如诊断乙肝判断愈后、筛选献血员、乙肝的流行病学调查、判断人群对乙型肝炎的免疫水平，对食品、保育及饮水管理行业人员定期进行健康体检等起着重要的作用。故选择一种特异、敏感、稳定的实验室检测方法检测乙型肝炎病毒的五项指标显得尤为重要。现将56例检测者血清同时用酶联免疫法和血清乳胶层析法对比检测结果报告如下。 １材料与方法 1.1 标本来源56例受检者中，男29例，女27例，最大年龄72岁，最小年龄29岁，平均年龄46岁；来自健康体检人群15例，其中13例检测具有阳性结果，2例各项指标均为阴性、另41例为门诊检查结果有阳性的患者，均系血清标本。

1．2 方法酶联免疫法用乙型肝炎病毒(HBsAg，HBsAb，HBeAg、HBeAb，HBcAb)诊断试剂盒，由上海华泰生物工程实业有限公司生产，48人份，批号20040503，按说明书操作。乙肝两对半血清/血浆乳胶层析法检测试剂板由ACONLaboratories.Inc.SanDiegoCA92121USA提供，批号200407029，按说明书操作。 1.3 质量控制酶联免疫法每项检测项目均设阴、阳性对照各2孔，每空加入阴性对照(或阳性对照)各1滴，并设有空白对照1孔。乳胶层析法各项检删项目均设质控区(C)。 1.4 检测结果判定标准：酶联免疫法是根据颜色的变化，作定性分析。此法HBsAg、HBsAb、HBeAg呈黄色为阳性反应，无色为阴性反应，阳性对照为黄色，阴性对照为无色。HBeAb、HBcAb无色为阳性，黄色为阴性，阳性对照为无色，阴性对照为黄色。乳胶层析法HBsAG、HBsAb、HBeAg在测试区内(T)出现一条红色条带则是阳性结果，不出现红色条带则为阴性。HBeAb、HBcAb结果则相反，强阳性标本测试区内(T)将没有红色条带，弱阳性标本测试区内(T)将有一条非常弱的红色条带，阴性标本测试区(T)将会出现明显的红色条带。无论相应的待测物质是否存在于标本中，质控区(C)都会出现红色条带。两种检测方法结果对比分析用卡方检验两两比较进行统计学处理。

乙型肝炎的实验室诊断

乙型肝炎的实验室诊断 　［血清标志物］对于乙肝的病原学诊断最初、也是最常用的是乙肝病毒血清标志物（HBVM）检测。HBVM主要包括：两对半（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）、HBxAg、HBxAb、前S抗原及抗体、DNA多聚酶（DNA－P）及抗体等。通过检测HBVM可以间接的多角度了解患者HBV感染、复制以及病情恢复情况。常用血清标志物是两对半，临床意义如下： 1. 表面抗原（HBsAg）：位于病毒外壳表面，由HBV基因组S区和前S区基因编码，完整的大分子HBsAg是完整病毒的必需条件。血清HBsAg的出现，意味着HBV的现症感染，是乙肝血清学检查最重要的指标。HBsAg是虽然只是HBV存在的间接指标，但诊断乙肝的最常用也是最重要的指标，主是因它出现最早，一般在感染后3周出现，有利于早期诊断。第二，它持续时间长，急性患者至少持续5周，最长可持续5个月，并且在血液中的释放量大，非常容易检测。前S1和前S2紧随HBsAg而出现在血流中，并与HBeAg和HBV－DNA相关。 2. 表面抗体（HBsAb）:　由于病毒HBsAg抗原性诱发机体产生的保护性抗体，HBsAb是一种保护系抗体，在HBsAg消失后数周后出现，并可持续多年存在。HBsAb是所有乙肝要关抗体中出现最晚的。常与HBcAb同时存在，而很难与HBsAg同时被检出来。抗前S1抗体出现于潜伏期，是所有抗体中出现最早的。抗S3抗体出现在急性期，处于HBV复制终止前后，提示有清除病毒的作用。 3. e抗原（HBeAg）:　HBeAg是一种可溶性蛋白抗原，一般仅见于HBsAg阳性血清中，阴性中偶见。HBeAg出现在血中稍后于HBsAg，同时消失很快，所以窗口期也不能出现。HBeAg是由HBV－DNA开放读码框前C区编码，与HBV的活动性复制密切相关，是HBV传染性的重要指标。HBcAg是HBV复制的标记，而HBeAg是HBV正在复制的标记。 4. e抗体（HBeAb）:在病毒复制过程中，e抗原暴露诱发机体产生。有一定保护作用。HBeAb紧接着HBeAg消失而出现，表示HBV复制已经减少，传染性降低。HBeAb持续时间不长，几月后逐渐消退。血清中HBeAb的检出意味着病毒复制中止或减少。 5. 核心抗体（HBcAb）:　由病毒C区编码的HBcAg诱导产生，没

实验三 乙型肝炎病毒表面抗原检测

实验三乙型肝炎病毒表面抗原检测 一、目的 掌握ELISA原理和方法 二、实验原理 采用EIA双抗原夹心法检测人血清或血浆中的抗-HBs。并采用HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP，进行孵育，当标本中存有抗-HBs 时，该抗-HBs与包被的HBsAg结合并与酶结合形成酶结合物HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP复合物，洗去反应物，加入显色剂后，将有明显的颜色变化；当标本中没有抗-HBs时，加入底物后没有或只有很轻微颜色变化。 三、试剂与器材 1.试剂 酶结合物、抗-HBs阳性对照，浓缩洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止液（2mol/L H2SO4）、7号待测样品、8号待测样品 2.器材 预包被反应板（9孔）、封板胶条、移液枪、摇床 四、操作步骤 1.取7号待测样品分别填装到4孔中，每孔50μL。同样取8号待测样品分别 填装到4孔中，每孔50μL。剩余一孔装填50μL抗-HBs阳性对照。 2.加酶结合物，每孔50μL，并充分混匀，贴上标签纸，置于37℃孵育30min。 3.手工洗板：弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液350μL灌注每孔， 静置5-10秒，弃去孔内洗涤液拍干，如此反复五次。 4.加显色剂：先加显色剂A，每孔50μL；再加显色剂B，每孔50μL；充分混 匀，放置37℃避光孵育15,min。 5.终止反应：每孔加入终止液50μL，混匀。

6.观察颜色变化。 五、实验结果分析 从实验结果看出7、8号待测样品皆无明显的颜色变化，但是阳性对照组再加入显色剂A、B后立即显现蓝色，再加入终止液后立即显现黄色。表明7、8号待测样品皆无抗-HBs。 而反应显色原因为底物过氧化氢脲溶液和TMB，在HRP酶的作用下，产生蓝色的阳离子根；加入终止液后，一方面，硫酸破坏了HRP酶的活性，使酶的催化功能丧失，另一方面，pH降低，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌。但本实验并未用上酶标仪，故测定联苯醌的消光系数也无法进行。

乙型肝炎病毒检测技术的研究进展

乙型肝炎病毒检测技术的研究进展 吴淑秋 [关键词] 乙型肝炎病毒检测技术 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界范围内严重的公共卫生问题之一,约5%的世界人口现行慢性感染，在我国乙型肝炎是常见的传染病和多发病之一，主要通过血液、血制品、性传播及母婴传播，是引起肝硬化和肝癌的常见病因。我国一般人群中HBsAg阳性率约为10％左右，乙型肝炎其传染性和病死率均居高不下[1]，已经成为现在最为严重的社会公共卫生问题，严重影响着人们的身体健康。所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。随着检测技术的不断发展，对乙型肝炎血清标记物的认识也在不断深入和更新。到目前为止, 乙型肝炎病毒病原学检测主要是电子显微镜技术、免疫学技术和分子生物学技术和基因芯片技术, 现将乙型肝炎病毒几种检测技术作一综述。 1电子显微镜技术 电子显微镜技术主要包括常规电镜法(electron micros-copy, EM)和免疫电镜法(immune electron microscopy,IEM)。 1.1 常规电镜法1970年英国学者Dane等在电镜下发现了完整HBV颗粒即Danes颗粒[2],R De V os等随后用电子显微镜观察18例HBsAg阳性的慢性肝炎患者的肝组织,发现了直径约25 nm的核心抗原(HBcAg)颗粒[3]。常规电镜法的优点是标本用量小、制样速度快、观察比较直观,不过因其观察灵敏度较低而要求病毒在标本中大量存在,所以本检测技术在观察HBV方面的应用受到限制。 1.2免疫电镜法免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。Takashi等[4]对96例HBsAg阳性患者的肝组织进行免疫电镜观察,发现在肝细胞胞浆和胞核中存在HBcAg和HBeAg。胡莲美等[5]在HBV转基因小鼠血清中发现直径约22 nm的球形HBsAg,以及少量直径约42 nm的Danes颗粒。免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高,从而可增加HBV的检出率,但该检测技术的样本制备过程较复杂,对操作者的技能要求较高。 2 免疫学技术

(完整word版)乙肝血清标志物检测的临床意义

乙型肝炎病毒血清五项标志物（“两对半”）的 临床意义 1. 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) HBsAg是机体感染HBV的标志，也是在机体血清中首先出现的病毒标志物。HBsAg出现的时间，与机体感染HBV的途径和感染的剂量有关。如果系输用HBsAg 阳性血，2周后即可检测到HBsAg，如用RIA法检测，于接种后6天，血清中即可出现HBsAg阳性；如感染剂量少，HBsAg出现阳性的时间可达3～4个月，甚至6个月；一般在感染HBV后4～6周可出现HBsAg阳性。HBsAg出现阳性后1～7周(平均约4周)才出现肝炎症状和肝功能异常。经血感染者，其潜伏期约为2个月；经口感染者，其潜伏期大约为3个月。 急性乙肝病程一般持续１－３个月，80%～90%的患者可以临床治愈［1］。H BsAg阳性在血中一般持续１－６周，长者可达２０周（14－148天）；在肝炎症状出现后1～4周或血清转氨酶达高峰后1～12周消失，如果HBsAg阳性持续超过6个月仍不转阴则称为持续阳性或慢性携带状态; 如系急性乙肝，HBsAg 持续阳性超过6个月则提示慢性化。我国HBV感染(急性和慢性)的人群中每年大约有4%～10%的HBsAg阳性者转阴，同时每年又有约4%～10%的人群由易感人群成为受感染者，因而，人群HBV感染状态在不断变化［2］。HBsAg阳性持续的时间和急性乙肝慢性化的比例与感染者的年龄有关，年龄愈小，形成持续感染或病情慢性化的概率愈大；围产期感染的婴儿80%将成为HBsAg的携带者；幼儿期感染者约30%将成为持续HBsAg携带者，正常成年人感染HBV后形成持续性感染的比例可能在5%以下；社会普通人群中约35%～50%的HBsAg阳性 携带者是在母婴围产期感染的［3］。 临床上，HBsAg阳性可见于急性乙肝患者的潜伏期、急性期；慢性乙肝，无症状携带者；部分肝硬化和肝癌患者的血清中和受HBV感染的肝细胞浆中。 HBsAg阳性一般来说表明机体内存在HBV感染，但阴性也不能完全排除H BV感染。原因是：①可能由于HBV和HBsAg含量极少，检测方法不够灵敏而漏检，或因试剂质量和操作问题而出现假阴性；②S基因变异引起HBsAg的表达和分泌发生障碍，体内虽存在HBV，但血清中测不到HBsAg或很少[5,6]；③S

细胞因子检测方法综述

细胞因子检测方法综述 细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称[1]。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。 但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采用的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来一定的困难。因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素[2]。 目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类 一.生物学检测法 生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测[2]。生物活性检测法又可分为以下几类： 1．细胞增殖法 许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激t细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。 2．靶细胞杀伤法 是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。 3．细胞因子诱导的产物分析法 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。 4．细胞病变抑制法 病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。 二、免疫学检测法 细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试

乙肝病毒HBV血清学标志物检测的临床意义

乙肝病毒HBV 血清学标志物检测的临床意义 HBV 是一种小的有包膜病毒它被分类为嗜肝 DNA 病毒科中的一员。虽然HBV 在动物病 毒中有若干近亲，但人类病毒中没有与 HBV 相似者,HBV 的DNA 基因组只含四个编码病毒蛋 白的基因：编码三种形式的表面抗原的表面基因 S ,编码HBeAg 和HBcAg 的前核心/核心基 因C ,编码x 抗原的基因X 和编码HBVDNA 聚合酶的聚合酶基因 P 。 HBV 的复制 000*4^ A(n) cccDNA 转录 mRNA | 细胞核 HBV 利用一种与逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒 Human 1mmunodeficiency Virus,HIV 复 制方式相关的新复制策略?在这一过程中，将 RNA 逆转录为DNA 是复制周期中极其重要的一 步。然而 与逆转录病毒不同的是 HBVDNA 在复制时并不整合到宿主细胞的 DNA 中去。当一 个有感染性的 HBV 颗粒结合并进入肝细胞时， HBVDNA 进入肝细胞并变为共价闭合环状 DNA,cccDNA,CoValent Closed C yc1ic DNA 。这种 cccDNA 是高度稳定的， 而且是 HBV 复 制过珵中重要的中间产物，其作用是作为 RNA 拷贝的模板。这些 RNA 拷贝中最大者被称为 HBV 前基因组mRNA ，它被转运到细胞浆中，它有双重功能，一方面作为合成新的 HBVDNA 的 模板;另方面又携带遗传信息指导病毒某些蛋白质合成 ，较小的HBVmRNA 则参与其他病毒蛋 白质的合成。病毒蛋白质合成开始之后，前基因组 mRNA 、HBV 核心蛋白和HBVDNA 聚合 酶装配在起形成新的病毒颗粒。 每个颗粒中的前基因组 mRNA 被HBVDNA 聚合酶转录为DNA 负链,minus sense,同时此RNA 模板被降解。而负链 DNA 再作为模板合成正链 DNA 。当 HBVDNA 的合成正在进行时，病毒颗粒在内质网中获得包膜并从细胞中输出到细胞外 ?少量新 的HBV 颗粒仍在细胞内，并以其DNA 补充细胞核内cccDNA 的储备。 有融染性的 HBVM 粒 肝细胞 (-)-DNA 畑胞浆 细胞核 DNA 有感染性的 卜一 HBVW 粒 、逆转录/ 内质网 、有包膜的 前基因 组

细胞因子检测

细胞因子检测 细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,?在抵抗外来病原及维持机体环境平衡中均起重要作用。某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。 1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。?如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。 2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)?的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。 3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。通过检测细胞细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。 . .

一、IL-1的检测(生物活性测定) 产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。IL-1可分为IL-1α(?也称酸性IL-1,pI=5.0)和IL-1β(中性IL-1,pI=7.0)。两者的分子量和生物活性相似,?只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定法对两者都适用。IL-1?的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G 4.1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代率为指标来表示。本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。 （一）IL-1的诱生 体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用 P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1。 1、取6～10周龄BALB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。 2、用带9号针头的5ml注射器腹腔注入5ml冷的含5％小牛血清的Hanks液(5?％?NBS-HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(含腹腔细胞),反复抽吸几次。 . .

乙型肝炎病毒表面抗原胶体金法说明书

【产品名称】 通用名称：乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测试剂盒（胶体金法） 英文名称：Diagnostic Kit for Hepatitis B Surface Antigen (Colloidal Gold) 【包装规格】 条型：25人份/盒（1人份/袋×25袋）、50人份/盒（1人份/袋×50袋）、100人份/盒（1人份/袋×100袋）、 100人份/盒（25人份/筒×4筒）。 卡型：20人份/盒（1人份/袋×20袋）、40人份/盒（1人份/袋×40袋）。 【预期用途】 本产品用于体外定性检测人血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。 本产品适用于乙型肝炎病毒感染的辅助诊断。乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性传染疾病，该病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。乙肝表面抗原是乙肝病毒的外壳蛋白，伴随乙肝 病毒感染出现在血液中，是乙肝病毒感染的主要标志。乙肝表面抗原检测是该病的主要检测方法之一。【检测原理】 本试剂应用双抗体夹心法免疫层析胶体金技术检测样本中的乙肝表面抗原。试剂在检测线（T线）包被有HBsAg-1抗体，质控线（C线）包被有羊抗鼠IgG，在胶体金垫上含有胶体金标记的HBsAg-2抗体。检测时，若为阳性样本，样本中的HBsAg先与胶体金垫上的抗体反应，形成抗原-金标抗体复合物，在NC膜上层析至检测线时，会与包被HBsAg-1抗体形成抗体-抗原-金标抗体复合物，并在检测线位置显示出色带。若样本中无HBsAg，则不能形成复合物，T线位置上不出现色带。C线在检测样本时均应出现色带，否则试验无效。本试剂具有使用简便，稳定性好，特异性强、灵敏度高的特点。 【主要组成成份】 检测条/卡：在检测线包被有抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体1（小鼠来源），质控线包被有羊抗小鼠IgG抗体，在胶体金垫上含有胶体金标记的抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体2（小鼠来源）；滴管：仅适用于卡型；干燥剂。 不同批号试剂中各组份不能互换。需要用户自备计时器，如钟表等。 【储存条件及有效期】 4-30℃干燥阴凉避光保存，有效期20个月。打开内包装后检测试剂会因吸湿失效，需在30分钟内使用。 【样本要求】 1. 可用于检测血清/血浆样本。

乙型肝炎的实验室诊断

乙型肝炎的实验室诊断 ［血清标志物］对于乙肝的病原学诊断最初、也是最常用的是乙肝病毒血清标志物（HBVM）检测。HBVM主要包括：两对半（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）、HB xAg、HBxAb、前S抗原及抗体、DNA多聚酶（DNA－P）及抗体等。通过检测HBVM可以间接的多角度了解患者HB V感染、复制以及病情恢复情况。常用血清标志物是两对半，临床意义如下： 1.表面抗原（HBsAg）：位于病毒外壳表面，由HBV基因组S区和前S区基因编码，完整的大分子HBsAg是完整病毒的必需条件。血清HBsAg的出现，意味着HBV的现症感染，是乙肝血清学检查最重要的指标。H BsAg虽然只是HBV存在的间接指标，但诊断乙肝的最常用也是最重要的指标，主要因它出现最早，一般在感染后3周出现，有利于早期诊断。第二，它持续时间长，急性患者至少持续5周，最长可持续5个月，并且在血液中的释放量大，非常容易检测。前S1和前S2紧随HBsAg而出现在血流中，并与HBeAg和HBV－DNA相关。 2.表面抗体（HBsAb）: 由于病毒HBsAg抗原性诱发机体产生的保护性抗体，HBsAb是一种保护系抗体，在HBsAg 消失后数周后出现，并可持续多年存在。HBsAb是所有乙肝要关抗体中出现最晚的。常与HBcAb同时存在，而很难与H

BsAg同时被检出来。抗前S1抗体出现于潜伏期，是所有抗体中出现最早的。抗S3抗体出现在急性期，处于HBV复制终止前后，提示有清除病毒的作用。 3. e抗原（HBeAg）: HBeAg是一种可溶性蛋白抗原，一般仅见于HBsAg阳性血清中，阴性中偶见。HBeAg出现在血中稍后于HBsAg，同时消失很快，所以窗口期也不能出现。HBeAg是由HBV－DNA开放读码框前C区编码，与HBV的活动性复制密切相关，是HBV传染性的重要指标。HBcAg是HBV 复制的标记，而HBeAg是HBV正在复制的标记。 4. e抗体（HBeAb）:在病毒复制过程中，e抗原暴露诱发机体产生。有一定保护作用。HBeAb紧接着HBeAg消失而出现，表示HBV复制已经减少，传染性降低。HBeAb持续时间不长，几月后逐渐消退。血清中HBeAb的检出意味着病毒复制中止或减少。 5. 核心抗体（HBcAb）: 由病毒C区编码的HBcAg诱导产生，没有保护作用。由于HbcAg位于病毒内部，一般方法不能检出，在血清中只能检测到HbcAb。HbcAb可以作为H BV感染的标志。血清中的检出HBcAb表明病毒正在或曾经进行复制。常说的HBcAb一般是指HBcAb－IgG，是最用的两对半中最先出现的抗体，一般在HBsAg出现后2－4周出现。当HBsAg消失，而HBsAb还没有出现时，常只能检出HBcAb，因此临床将此阶段称为窗口期。HBcAb和HBsAb一样也可以

乙肝病毒HBV血清学标志物检测的临床意义

乙肝病毒HBV血清学标志物检测的临床意义 HBV是一种小的有包膜病毒它被分类为嗜肝DNA病毒科中的一员。虽然HBV在动物病毒中有若干近亲，但人类病毒中没有与HBV相似者,HBV的DNA基因组只含四个编码病毒蛋白的基因：编码三种形式的表面抗原的表面基因S，编码HBeAg和HBcAg的前核心/核心基因C，编码x抗原的基因X和编码HBVDNA聚合酶的聚合酶基因P。 HBV的复制 HBV利用一种与逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒Human 1mmunodeficiency Virus,HlV,复制方式相关的新复制策略.在这一过程中，将RNA逆转录为DNA是复制周期中极其重要的一步。然而与逆转录病毒不同的是HBVDNA在复制时并不整合到宿主细胞的DNA中去。当一个有感染性的HBV颗粒结合并进入肝细胞时，HBVDNA进入肝细胞并变为共价闭合环状DNA,cccDNA,CoValent Closed C yc1ic DNA。这种cccDNA是高度稳定的，而且是HBV复制过珵中重要的中间产物,其作用是作为RNA拷贝的模板。这些RNA拷贝中最大者被称为HBV前基因组mRNA，它被转运到细胞浆中,它有双重功能,一方面作为合成新的HBVDNA的模板;另方面又携带遗传信息指导病毒某些蛋白质合成,较小的HBVmRNA则参与其他病毒蛋白质的合成。病毒蛋白质合成开始之后，前基因组mRNA、HBV核心蛋白和HBVDNA聚合酶装配在起形成新的病毒颗粒。每个颗粒中的前基因组mRNA被HBVDNA聚合酶转录为DNA 负链,minus sense, 同时此RNA模板被降解。而负链DNA再作为模板合成正链DNA。当HBVDNA的合成正在进行时，病毒颗粒在内质网中获得包膜并从细胞中输出到细胞外.少量新的HBV颗粒仍在细胞内,并以其DNA补充细胞核内cccDNA的储备。 慢性乙型肝炎自然病史

乙型肝炎病毒表面抗原检测

乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA） 1原理： 在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。 2试剂： 2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法） 2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司 2.3包装规格：96Test/Kit 2.4试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg酶标抗体（含HRP标记HbsAb）, HbsAg阳性对照（含基因工程HbsAg），HbsAg阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含BSA缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含H2 SO4），封板膜，自封袋，说明书。 2.5试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。 3样本采集： 取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可臵于4℃冰箱保存，如长期保存需臵于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。 4所需仪器 4.1全自动酶免分析仪 4.2新鲜蒸馏水或去离子水 4.3酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm） 4.4微量移液器 4.5 37℃恒温箱或水浴箱

4.6洗板机或洗瓶 5检验方法 5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。 5.2配液：浓缩洗涤液配臵前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。 5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。 5.4稀释：每孔加入20ul样品稀释液。 5.5加样：分别在相应孔中加入100ul阴、阳性对照血清或待测样本。 5.6温育：臵37℃温育60min。 5.7加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul。 5.8温育：臵37℃温育30min。 5.9洗涤：用洗涤液充分洗涤5次、洗涤后扣干（每次应保持30~60s的浸泡时间）。 5.10显色：每孔加入底物A、B各50ul，轻拍混匀，37℃暗臵30min。 5.11终止：每孔加入终止液50ul，混匀。 5.12测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD 值（用单波长测定时，需用空白对照调零），并记录结果。 6结果判定与分析 临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD平均值*2.1；阴性对照OD均值小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样本OD值S/C.O.>=1者为HbsAg阳性样本OD值S/C.O.<1者为HbsAg阴性 阴性对照均值>0.1或阳性对照均值<0.4时，实验无效，应重新试验。 7质量控制

两种方法检测乙肝病毒血清学分析与比较

两种方法检测乙肝病毒血清学分析与比较【摘要】目的：探讨使用ELISA和TRFIA两种不同方法检测乙肝病毒血清标志物的差异。 方法：将某疾控中心收集的138份血清标本作乙肝两对半检测，每份血清分别使用ELISA和TRFIA两种不同方法进行检测，对得到的检测结果进行统计学分析。结果：两种方法检测 HBV五种血清标志物的阳性符合率分别为：HBsAg96.08%，抗-HBs为97.50%，HBeAg为 93.33%，抗-HBe为85.71%，抗-HBc为90.00%，比较发现抗-HBe和抗-HBc两种方法检测结果 差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：TRFIA相较于ELISA来说检测HBV血清标志物具有 特异性强、灵敏度高、无污染、可定量的优点，具有较好的使用价值，可在临床上推广使用。 【关键词】ELISA；TRFIA；乙肝两对半；血清学分析 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒感染后引起患者以肝脏发生炎症为主的多器官损伤的综合 性传染性疾病。本病具有较高的发病率，根据世界卫生组织统计，在全球范围内有3亿左右 的人群呈无症状乙肝病毒携带者，在我国约有1.4亿。大多数患者病程较缓，以亚临床型和 慢性为主，没有表现出明显的临床症状，仅有三分之一的患者会出现肝损伤的临床表现，如 果得不到有效的治疗会转化为肝硬化或肝癌。目前临床上使用乙肝血清学标记物（HBV-M） 检查是诊断HBV感染的有效手段之一，其中酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是临床上常用的诊断方法之一[1]。据研究报道时间分辨荧光免 疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是具有高灵敏度无环境污染的一种定量检 测HBV标志物的新检测方法。本研究选择138份临床血清标本使用ELISA和TRFIA两种进行HBV五项血清指标检测，旨在探讨两种检测方法的关系的临床应用。 1.资料与方法 1.1一般资料 选取某疾控中心自2013年10月~2015年3月间收治的患者随机抽取138份静脉血进行 检测，患者年龄18~69岁，平均年龄37.24±5.18岁；男性68例，女性70例。 1.2方法 空腹抽取患者静脉血5ml，3000r/min离心5~10min获得上层血清，每份血清标本分别 使用ELISA和TRFIA进行HBV血清标志物检测。 ELISA：操作步骤按照试剂盒说明书进行（上海科华生物技术有限公司），酶标仪测定数据。 TRFIA：操作按照说明书进行（上海新波生物技术公司），使用配套时间分辨荧光免疫 测定仪和其配套仪器进行测定。 1.3统计学方法 使用统计学软件SPSS17.0对两种方法测得的结果进行分析比较，计数资料之间使用卡方检验，以P＜0.05为差异显著，具有统计学意义。 2.结果 两种方法检测HBV五种血清标志物的阳性符合率分别为：HBsAg96.08%，抗-HBs为 97.50%，HBeAg为93.33%，抗-HBe为85.71%，抗-HBc为90.00%，比较发现抗-HBe和抗-HBc 两种方法检测结果差异具有统计学意义（P＜0.05），使用TRFIA法检测的阳性率显著高于ELISA，详见表1。 3.讨论