发光细菌

发光细菌
Photobacterium（lnminescent bacteris.luminousbacteria），进行生物发光的细菌。多数为海生，与发光浮游生物同是引起海面发光的原因。此外，在空气中，死鱼及水产加工食品的表面于暗处也会发光，这种发光现象是海生菌第二次生长繁殖的结果。用加有3％NaCl，1％甘油的普通肉汁蛋白胨培养基可以培养。
发光细菌 - 生物特性
发光菌形态虽多种多样，但生理特性却非常相似。一般对明胶不产生液化，分解蛋白质后不形成毒物，常寄生在各种动物体上引起“发光病”，即寄生发光。这些细菌通常经由寄主的卵传递给后代寄主。有些发光鱼类和乌贼是和发光细菌共生而利用了细菌的发光。
明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）可在牛马的死尸和肉中繁殖；它侵入人体则会产生发光尿。这些细菌一般好低温，最适温度约为18℃，37℃以上则不发光。发光现象是酶促氧化反应，必需FM－NH2，O2长链饱和醛，虫荧光素酶等。一般认为FMNH2就是荧光素。发光细菌有一百几十种，除上述几种外，典型的还有鱼无色杆菌（Achromobac-ter fisheri）、磷光弧菌（Vibrio phosphoresce－ns）、发光杆菌（Bacillus photogenus）等。细菌发光的生物学意义与动物发光不同，还不十分清楚。根据具有可以抑制氯高铁血红素呼吸浓度的一氧化碳或氰化物，而不能抑制其氧化过程这点来看，可以把它看作是不参与细胞色素系统的呼吸形式称为发光呼吸。发光细菌发出青白色光，如鱼无色杆菌所发出的光，最大波长为490纳米。
发光细菌 - 常见种类
目前国内常用的3种发光细菌为：明亮发光杆菌、费氏弧菌、青海弧菌。
其中以明亮发光杆菌在 GB/T15441-1995 水质 急性毒性的测定 发光细菌法中所使用；
费氏弧菌在欧盟的标准中所使用；
青海弧菌是在青海湖的鱼体内提取的菌种，属淡水菌，在测试饮用水时有较大优势，并已申请冻干粉制作专利：ZL 97106203.X
发光细菌 - 分类
发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490nm之间，在黑暗处肉眼可见。目前，全世界已命名的发光细菌有以下几种：① 属于异短杆菌属(Xenorhabdus)的有发光异短杆菌(Xenorhabdus luminescens)；② 属于发光杆菌属(Photobacterium)的有明亮发光杆菌(Photosbacterium phosphoreum)和鳆发光杆菌(P．1eiognathi)；③ 属于希瓦氏菌属(Shewanella)的有羽田希瓦氏菌(Shezoanella hanedai)，以前也曾经把它归类为交替单胞菌属(Alteromonas)的海氏交替单胞菌(Alteromonas hanedia)；④ 属于弧菌属(Vibrio)的有哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、美丽弧菌生物型I(V．splendidus biotype I)、费氏弧菌(V．fischeri)、火神弧菌(V．1ogei)和东方弧菌(V．o

rientalis)。霍乱弧菌(V．cholerae)和地中海弧菌(V．mediterranei)中的某些菌株有发光现象，曾有报道易北河弧菌(V．albensis)有发光现象，后将其重新分类归人霍乱弧菌(V．cholerae)。另外，我国学者分离到一株淡水发光细菌命名为青海弧菌（V. qinhaiensis），还没收入伯杰氏细菌手册。
在以上发光细菌中，异短杆菌和青海弧菌属于淡水发光细菌，其它都是海洋细菌。发光细菌主要分布于海洋环境中。
发光细菌 - 发光机理
发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的，是由特异性的荧光酶(LE)、还原性的黄素(FMNH2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)、氧分子(02)所参与的复杂反应，大致历程如下：
FM NH2+LE → FMNH2?LE+ O2 → LE·FM NH2·O2
+ RCH O →LE·FMNH2·O2·RCH0 → LE+ FM N +H2O+RCOOH+光
概括的说就是，细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450-490nm处的蓝绿光。其中三步反应产生三种中间产物，寿命极短，很难分离出来。
荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的单加氧酶，只有两个亚基共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取到的细菌荧光素酶其分子量差别较小。王安平等分离纯化了东方弧菌的荧光酶并对其酶学性质进行了研究，分离得到了两个分子量分别为44 kD和41 kD的亚基，该酶反应的最佳温度在l8℃ ，超过25℃酶即迅速失活。
发光细菌 - 提取
广阔的海洋是发光细菌生活的大本营，从近海沿岸到南北极；从海水表面到深达1000米的海底都可找到发光细菌，只有少数生活在淡水湖泊河流中；有的寄生于各种海洋动物如海鱼的发光器官中；有的独立生活在海水中，其数量依外界条件的变化而异，据测定夏秋季的海水中每毫升多达几十到几百个，发光细菌属于肠道菌属，分为十个种四个属，在我国海洋中也陆续分离到十个种的六种，其中包括我国特有的新种。
发光细菌可以直接从海水中和海鱼的体表和内脏中分离，所采用的培养基为：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCI3%，琼脂2%，pH6.5。高压灭菌后制成平板，将海鱼或无脊椎动物（如乌贼）切成3～4cm大小小块，或取其内脏放入灭菌培养皿中20℃培养12－18小时，在暗室中寻发光点，用接种环挑取发光点，在营养平板上，线培养后形成单个发光菌，再挑取单菌落反复划线分离几次，即可得到纯化的发光菌株，将纯化的菌株接种入同样成分的斜面培养基上，经培养12小时后，在4℃下保存，每月

转接一次，可长期保存活力，使用前接种到液体培养基中20℃下振荡培养10－12小时，用磷酸缓冲液稀释后备用。
国内外一般都用明亮发光杆菌(Photobacterium Phospholcum)作有毒有害物的检验，上海华东师范大学已将此菌种制成干燥粉剂-20℃下可长期保存，使用极为方便。
发光细菌 - 应用

发光细菌应用
发光细菌由于其独特的生理特性，在环境监测中被作为测定环境中毒物的指标。生物发光是某些生物的一种生理现象，海洋生物中更为多见。自1672年R．Boyle观察到发光的菌体所发出的光易被化学物质抑制后，许多科学家相继对细菌的发光效应进行了大量的研究。本世纪70年代至80年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。80年代初我国引进了这项技术，并先后分离出海水型和淡水型的发光细菌，用以检测环境污染物的急性生物毒性；近年来还分离出明亮发光杆菌暗变种检测环境污染物致突变性，扩大了检测范围。
发光细菌在正常的生理条件下能发出波长在450～490nm 的蓝绿色可见光，在一定的试验条件下发光强度是恒定的。与外来受试物接触后，由于毒物具有抑制发光的作用，发光细菌的发光强度即有所改变，变化的程度与受试物的浓度在一定范围内呈相关关系，同时与该物质的毒性大小有关。外来受试物主要通过下面两个途径抑制细菌发光：① 直接抑制参与发光反应的酶类活性；②抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程。凡能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定。利用发光细菌来检测有毒物质，由于有毒物质仅干扰发光细菌的发光系统，发光强度的变化可以用发光光度计测出，费时较少且灵敏度高，操作简便，结果准确，所以利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质，在国内外越来越受到重视，在环境监测中的应用也越来越广泛。
近年来，利用发光细菌毒性试验检测环境污染物急性毒性备受重视，我国于1995年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法(GB／T15441—1995)。相信这一技术会在我国的环保事业中发挥更大的作用。
利用发光细菌制作生物传感器，是人们研究的热点之一。发光细菌的发光强度与某些污染物的浓度呈较好的线性关系，能够稳定、灵敏、快速地反映环境中污染物的浓度变化，因此，利用发光细菌制备识别元件，成为国内外传感器研究和发展的热点。20世纪80年代初美国Beckman公司推出功能完备的生物毒性测试仪，它具有应用

范围广，灵敏度高，相关性好，反应速度快等优点，发光细菌毒性测试(Luminescent bacteria toxicitytest，L．B．T．)技术在世界范围内迅速推广。细菌能够稳定、高效、持续发光是其被用做生物敏感材料来制备识别元件的基础，因此筛选优良的菌种是传感器制作的关键之一。海洋发光细菌是海洋环境中的正常微生物，从海洋环境中分离优良的发光细菌菌株是可行的。
朱文杰（华东师范大学）教授带领北京滨松光子技术股份有限公司的研发团队，通过多年的潜心研究终于将发光细菌检测技术国产化，并在四川地震发生后迅速成立了抗震救灾小组赶赴灾区，同当地疾控中心合作对都江堰周边地区的饮水点进行采样普查，收到疾控和卫生监督部门的好评！
发光细菌 - 基因
发光基因(1ux gene)系统中包括结构基因luxC，D，A，B，E 和调节基因luxI和luxR 等。从不同发光细菌中分离得到的发光基因其种类和数量有所差异，例如luxF仅发现于明亮发光杆菌，但以上五个结构基因luxC，D，A，B，E 是普遍存在于已知的所有发光细菌中的。编码菌荧光素酶的基因是luxA 和luxB，在lux操纵子中，luxA 和luxB 是紧密相连的。以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为例，其luxA 基因中含有1065bp，编码的α亚基是355个氨基酸的多肽，分子量为40kD；luxB基因中含有972bp，编码的β亚基是有324个氨基酸的多肽，分子量为36kD。由α、β两亚基组成的荧光酶的分子量为76 kD。编码脂肪酸还原酶(多肽转移酶和还原酶)的luxC和luxD位于luxA、luxB基因的上游一侧，编码合成酶的luxE基因位于luxA，luxB基因的下游一侧。luxC 含有1431bp，编码的蛋白质含有477个氨基酸，分子量为55 kD；luxD 编码的蛋白质分子量为33 kD；luxE编码的蛋白质分子量为42 kD。在明亮发光杆菌中还发现有luxF基因，它通常位于luxB和luxE之间，其编码的蛋白质分子量为26 kD 左右，但lux F基因在弧菌属和异短杆菌属中的发光基因系统中尚未被发现。在以上所有菌株的操纵子中，这些基因的顺序都相同，均为lux CDAB(F)E。
在lux 系统中，结构基因上游有2个调节基因，它们是lux I和luxR。它们分别属于两个不同的操纵子之中，lux I在右面的操纵子中，右面的操纵子中还含有lux CDAB(F)E 基因，lux I位于lux C 的上游。lux 系统的整个结构如下：luxR，lux DAB(F)E。lux I编码的是发光细菌自诱导物(autoinducer)因子合成酶，luxR 编码的是发光系统的调节蛋白。研究表明，luxI和luxR 基因的表达产物都是lux 系统完整表达并产生发光的调节物质，任何一个基因的有效突变都会改变lux系统的表达水平，甚至使发光细菌变为暗变种。
发光细菌所含的发光基因(1ux gene)表达的直接结果是产生生物

发光，非常直观而且易于检测，因而被广泛应用于基因操作，作为标记(marker)基因和报告(reporter)基因来研究基因的转导、表达和调控。另外，通过基因工程而产生的很多基因工程发光细菌的研究和应用也很有价值。完整的发光基因系统已经被成功地转入其他细胞中，如原核细胞、真核细胞和哺乳动物细胞。lux基因可以作为一个很好的标记基因重组在质粒载体或其他载体上。若将发光基因系统中的结构基因放在一个被试的启动子的下游，一并插入载体DNA中进行转导实验，可通过宿主细胞是否发光确定转导是否成功，并通过宿主细胞的发光强度的高低来确定发光基因的转录表达水平和结构基因上游的启动子的活性大小。另外，还可以用发光基因来研究终止子(terminator)的活性大小，以及研究其他细胞内的某些基因的表达与调控的规律。利用含有lux系统的具有感染力的载体(噬菌体)在感染宿主细胞时能产生生物发光的现象，可以研究其感染的过程和机理
发光细菌 - 基因工程
基因工程发光细菌是指通过基因工程技术将lux系统导入其他非发光宿主细胞后，形成一类能够发光的细菌。利用基因工程发光细菌可以快速测定化学物质及环境污染物的毒性，确定生物的存活能力，快速确定环境污染的程度以及进行环境质量的评价。还可以利用基因工程发光细菌进行细菌在土壤和水体中分布的研究等。
lux 基因作为报告基因，用其构建基因工程微生物，通过对光线的检测可以对微生物在环境中的生长、分布、活性等进行实时在线监测。如利用发光酶基因标记的荧光假单胞菌检测在小麦根圈的定植动态；跟踪棉花根圈中的绿针假单胞菌；用发光酶基因标记巨大芽孢杆菌，获得稳定发光的标记菌株，用于研究其在小麦根际的定殖动态和散布规律等。
某些细菌长期生活在含有某种化学物质的环境中，细菌基因组中含有对该物质具有特异性的诱导基因和降解基因，或具有对该物质的抗性基因。将这些基因与lux 基因融合构成重组体，在特异的化学物质存在时产生诱导作用，启动诱导基因并导致lux 基因表达，而由重组体的发光与否就可得知某化学物质是否存在。研究者们利用细菌对汞的抗性是依赖于Hg 与merR(汞抗性基因的调节基因)基因产物的结合和表达激活的原理，构建了由merR基因和luxAB基因融合的质粒载体，建立了发光强度与汞含量的关系。该系统灵敏度高而且专一性很强，用这种方法可检测出环境中纳克级的汞。因此，利用这种物质依赖性的基因工程发光细菌在这种特异性物质的存在条件下高水平的表达出生物发光，且发光强度与该物质的剂量呈正相关的特

点，可以检测环境中该物质的存在量。目前，已经构建了汞、砷、苯、萘等物质依赖性的基因工程发光菌，用于环境中此类物质的检测。发光细菌经过各种理化方法诱变处理后失去发光的能力，成为暗变异株。在接触致突变物后，暗变异株可恢复一定的发光能力(通常可使暗变异株的发光强度增加1000倍左右)。利用暗变异株恢复发光的现象，可对各种遗传毒物进行筛选、检测。此法与其他微生物学方法(如Ames试验)相比有灵敏、简便、快速、无需严格无菌操作等特点。目前已开发了“Mutatox”的检测系统，这是继发光细菌急性毒性检测的“microtox”之后推出的又一项发光细菌检测技术。
另外，将lux系统导人某种噬菌体的DNA中，利用噬菌体与其宿主菌之间严格的特异性，可以检测宿主菌的分布、数量以及活性，灵敏度高而且速度很快，为环境微生物检测提供了一种灵敏有效的方法。
发光细菌的微毒检测

生物发光是某些生物的一种生理现象，海洋生物中更为多见。自1672年R．Boyle观察到发光的菌体所发出的光易被化学物质抑制后，许多科学家相继对细菌的发光效应进行了大量的研究。本世纪70年代至80年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。80年代初我国引进了这项技术，并先后分离出海水型和淡水型的发光细菌，用以检测环境污染物的急性生物毒性；近年来还分离出明亮发光杆菌暗变种检测环境污染物致突变性，扩大了检测范围。

一、发光细菌检测的原理与操作

（一）基本原理

发光菌检测法是以一种非致病的明亮发光杆菌作指示生物，以其发光强度的变化为指标，测定环境中有害有毒物质的生物毒性的一种方法。

细菌的发光过程是菌体内一种新陈代谢的生理过程，是光呼吸进程，是呼吸链上的一个侧支，即菌体是借助活体细胞内具有ATP、萤光素（FMN）和萤光素酶发光的。综合化学反应过程为：



该光波长在490nm左右。这种发光过程极易受到外界条件的影响。凡是干扰或损害细菌呼吸或生理过程的任何因素都能使细菌发光强度发生变化。当有毒有害物质与发光菌接触时，发光强度立即改变，并随着毒物浓度的增加而发光减弱。这种发光强度的变化，可用一种精密测光仪定量地测定。美国Microbics公司设计制造了一套微毒测定仪器。国内中国科学院南京土壤研究所，华东师范大学生物系也分别成功地研制了DXY－2型和SDJ－1型的生物发光光度计（生物毒性测试仪）。

（二）典型操作

1．典型操作方法 目前国

内外细菌发光的测定常用的有二种方法。

（1）新鲜发光细菌培养测定法 即将发光菌接种于液体培养基中，在适当条件下（20℃±0.5℃）振荡培养到对数生长期，配制为含3％NaCl盐度的适当浓度的菌悬液加入测试管中，再加入待测液，使之和菌种接触，作用5min～15min后，读出井记录对照管和样品管发光强度。此法操作较为简便。

（2）冷冻干燥发光细菌制剂测定法，把培养到对数生长期的发光细菌，以冷冻干燥法制成冻干粉剂，使用时加入冷的2％NaCl溶液复苏，使其恢复到原来的生理状态和发光水平，然后用于测定。这是国家标准方法，其优点是可实行测定的质量控制。冻干粉可长期保藏方便使用，操作简便，节约时间。

2．试剂与材料

（1）测试菌种 明亮发光杆菌（Ptotobacterium phosphoreum）T3小种。

①新鲜明亮发光杆菌悬浮液。

②或明亮发光杆菌冻干粉（800万Cell／g）。

（2）培养基

①液体培养基 酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl30.0g，Na2HPO45.0g，KH2PO41.0g，甘油3.0g加蒸馏水至1000ml。pH7.0±0.5。

②固体培养基 培养液（按上述配方）1000ml，琼脂169g，pH7.0±0.5。

（3）稀释液 3％NaCl，2％NaCl。

（4）参比毒物 0.02mg／L～0.24mg／L的HgC12系列标准溶液。

（5）仪器与器材

①DXY－2型生物发光光度计（中国科学院南京土壤研究所研制）及2ml或5ml比色管。

②恒温振荡器，培养箱，手提式高压消毒锅。

③10ul或20ul微量加液器，1ml注射器，移液器，容量瓶，三角瓶。

（6）检测样品 视实验目的而定。

二、发光细菌法的应用

根据发光细菌法的原理和方法，凡能干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的环境因子，例如有毒有害的物质等都可以运用发光细菌法检测生物毒性。其主要应用包括：

1．发光细菌对水、土、气中化合物的急性毒性评价及快速评价水源水和地面水的质量，渔业水体，农田灌溉水体等的检测。

2．工业废水，废气和固体废弃物的急性毒性与评价，及污染源的毒性追踪与判断，河流流经地域的排污分担率的估算，污水合格排放的稀释率的推算与评定。

3．土壤重金属急性毒性效应测定和评价，土壤金属毒性的协同或拮抗效应监测。

4．化学品的毒性评价与安全性评定，化学危险品的风险评定，以及环境污染物的致突变性的评价。

5．环境保护处理设施效果的监控。随着环境学科的发展，发光细菌法的应用范围和前景将愈来愈宽广。

三、发光细菌法测定急性毒性的操作程序

（一）发光细菌新鲜菌悬液的制备（第1法）

1．斜面菌种培养 于测定前48h取保存菌种，于新鲜斜面上接出第

一代斜面，20℃±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，20℃±0.5℃培养24h，再接出第三代斜面20℃±0.5℃培养12h后备用。每次接种量不超过一接种耳。

2．摇瓶菌液培养 取第三代斜面菌种近一环，接种于装有50ml培养液的250ml三角瓶内，20℃±0.5℃，184rpm／min下培养12h－14h备用。

3．将培养液稀释至每毫升108个细胞～109个细胞，初始发光度不低于800mV，置水浴中备用。

（二）菌液复苏（第2法）

取冷藏的发光菌冻干粉，置冰浴中，加入0.5ml冷的2％NaCl溶液，充分摇匀，复苏2min，使其具有微微绿光，初始发光度不低于800mV。

（三）样品采集与处理

1．水样

（1）从不同工业废水的各排放口，每4h采样一次，连续采集24h后，均匀混合后备用。

（2）纳污水体 取其入口，中心，出口三个断面混合水样备用。

（3）以同上方法采集清洁水，作空白对照。

浊度大的污水，需静置后取上清液。一般样品不需加任何处理。水样按3％比例投加NaCl置冰箱备用。

2．气体样品 以大气采样法取大气样品于气体吸收液中吸收5ml，按3％比例投加NaCl，置冰箱备用，同法收集清洁空气作为对照组。

3．固体样品 取固体废弃物，按《工业固体废物有害特性试验与监测分析方法》制备浸出液，以取上清液，按3％比例投加NaCl，置冰箱备用。

（四）试验浓度的选择

在预备试验的浓度范围内，按等对数间距或百分浓度取3个～5个试验浓度，同时设空白对照和参比毒物系列浓度组。

（五）发光细菌法生物毒性测定

1．工业废水或有毒物质的生物毒性测定

（1）发光菌悬液初始发光度测定取4.9ml3％NaCl溶液于比色管内，加新鲜发光菌悬液或冻干粉复苏菌悬液10ul，若测量发光度在800mv以上，允许置冰浴中备用。

（2）取已处理待测废水样品，按等对数间距或百分浓度编号，并注明采集点。

（3）按表依次加入稀释液，待测水样及参比毒物系列浓度溶液。

（4）打开生物毒性测试仪电源，预热15min调零点，备用。

（5）每管加入菌悬液0.01ml，准确作用5min或15min，依次测定其发光强度，记录毫伏数。

每个浓度设三管重复。







2．工业废气（或有害气体）的生物毒性测定

（1）气体直接通入法 用注射器直接注入气体于菌悬液中，经10min～20min测定发光菌光强度的变化。

（2）气体吸收法 方法同工业废水测定法。

（3）固体菌落法 挑选固态培养到对数生长期的发光菌单茵落，连同培养基切下，置比色管内，测定初始发光强度，然后用注射器将待测气体注入菌苔表面，经10min～20min后，测定发光度的变化。

（六）实验结果处理与评价

1．记

录工业废水，废气的生物毒性实验数据及其计算。

（1）相对发光率或相对抑光率

计算公式：





（2）EC50值 在半对数座标纸上，以横座标为对数浓度，以纵座标为相对抑或发光率，作图，求得EC50值。

2．数据处理与评价

（1）建立相对抑光率与参比毒物系列浓度的回归方程，求出样品的生物毒性相当于参比毒性的水平，以评价待测样品的生物毒性。

（2）以EC50值评定样品的生物毒性水平 总之发光细菌法是检测环境生物毒性的一种好方法，它具有快速、简便、灵敏
利用发光细菌检验水中有毒有害物质环境保护论文
作者：本站 来源：网络 发布时间：2006-9-23 22:16:00 发布人：admin
摘要：水源污染引发了一系列的问题，首先是水质检验，特别是水中有毒有害物质的检验问题，水中有毒有害物质可以通过各种水质分析方法予以检出，然后对之进行对人体健康的综合评价，检测水中有毒有害物，有时采用生物方法，如鱼毒理学生物检验，水蚤试验等；也有采用近代遗传毒理学的方法，如Ames致突变试验[1]，姐妹染色体交换试验等等，则可提供水质对人体健康影响的信息，本文则介绍利用发光细菌检验水中有毒有害物质的基本原理，检验方法和评价标准。
关键词：水质检验 发光细菌 有毒有害物质
一、发光细菌的存在，分离，纯化和培养[2]
广阔的海洋是发光细菌生活的大本营，从近海沿岸到南北极；从海水表面到深达1000米的海底都可找到发光细菌，只有少数生活在淡水湖泊河流中；有的寄生于各种海洋动物如海鱼的发光器官中；有的独立生活在海水中，其数量依外界条件的变化而异，据测定夏秋季的海水中每毫升多达几十到几百个，发光细菌属于肠道菌属，分为十个种四个属，在我国海洋中也陆续分离到十个种的六种，其中包括我国特有的新种。
发光细菌可以直接从海水中和海鱼的体表和内脏中分离，所采用的培养基为：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCI3%，琼脂2%，pH6.5。高压灭菌后制成平板，将海鱼或无脊椎动物（如乌贼）切成3～4cm大小小块，或取其内脏放入灭菌培养皿中20℃培养12－18小时，在暗室中寻发光点，用接种环挑取发光点，在营养平板上，线培养后形成单个发光菌，再挑取单菌落反复划线分离几次，即可得到纯化的发光菌株，将纯化的菌株接种入同样成分的斜面培养基上，经培养12小时后，在4℃下保存，每月转接一次，可长期保存活力，使用前接种到液体培养基中20℃下振荡培养10－12小时，用磷酸缓冲液稀释后备用。
国内外一般都用明亮发光杆菌(Photobacteri

um Phospholcum)作有毒有害物的检验，上海华东师范大学已将此菌种制成干燥粉剂-20℃下可长期保存，使用极为方便。
二、发光菌的发光机理
微生物在氧化代谢或呼吸作用过程中得到能量，呼吸作用等于生物的氧化作用，好气性细菌具有细胞色素氧化还原酶系统，由于好气性细菌的细胞色素可以作为氢的最终受体而利用空气中的氧，底物的氢传递到NAD（烟酰胺腺嘌呤核苷酸）的脱氢酶的辅基上，结果形成还原型的AAD-H2，它可以将氢传递给黄素腺嘌呤二核苷酸FAD，后者转化为FAD- H2，就可以传递给细胞色素，能量以ATP（三磷酸腺苷）的形式释放。
发光细菌的发光过程是一种光呼吸过程，是上述电子传递链上的一个侧支[2]，还原型的黄素单核苷酸，FMNH2充当反应的底物，萤光酶起催化作用，长链脂肪醛起作改变萤光酶构造的“修饰”作用。萤光酶通过分子氧催化FMNH2和脂肪醛(RCHO)的氧化，这种氧化还原反应结果便产生磷光(465～490nm之间较多)。外界条件和培养基成分pH，温度，氧浓度变化会影响细菌的发光，而有毒的化学物质，重金属离子，抗生素，化学治疗剂，农药等同样会影响细菌发光，故采用发光细菌作为敏感的指标物测定有毒有害物是可能的。
三、发光细菌检测有毒有害的方法[3]
1.仪器：SHG-1型生物化学发光测量仪（上海市技术监督局实验工厂产品）或Microtox 2055型毒物分析系统（美国MICROBICS CORPORATION产品）
2.培养基
(1)液体培养基：酵母膏5g，胰蛋白胨5g，NaCI40g，Na2HPO45g，KH2PO4lg，甘油3g，蒸馏水1000ml，pH6.5。
(2)固体培养基：上述液体培养基成份加2%琼脂即可。
(3)稀释用磷酸缓冲液：Na2HPO45g，KH2PO4lg，NaCI30g，蒸馏水100ml，pH6.5。
3.水样浓缩
作某化学物质的试验只需配制一定浓度的溶液即可，进行水样中有毒有害物质的试验则需事先进行水样中毒害物的吸附，洗脱和浓缩。
取一定体积水样V升（视水质而定），用大孔树脂(XAD系列事先分别经甲醇、乙腈、丙酮回流8小时后保存于甲醇中)，用重蒸乙醚洗脱，浓缩至残渣，用1ml重蒸过的二甲亚砜溶解之。
1ml≈1V升水样 0.1ml≈0.1V升水样
4.测定步骤
(1)菌体活化：装置为0.5ml干燥菌剂，开封后注入2～3ml冷的稀释液，在旋转混合器上振荡2～3分钟，20℃平衡5～10分钟，使其活化，待发光稳定后即为活化菌悬浮液，置4℃下备用（活化后一天可用）。
(2)菌液处理：吸取不同体积（视水质而定）二甲亚砜水样浓缩液，分别在试管中用无菌蒸馏水稀至1ml，加入1ml缓冲液，然后再加入0.1ml菌悬浮液，摇匀，在一定温度下(20

±1℃)反应10分钟。
并同时以二甲亚砜作对照试验。
(3)用SAG-1型发光测量仪测定光强度。
(4)活菌计数
在测定光强度的同时用上述加有菌悬浮液的稀释液稀释涂布营养平板，23℃培养12～16小时，计算活菌数。
(5)结果计算：
相对抑光率=对照管光强－样品管光强／对照管光强×100％
细菌死亡率=对照活菌数－样品组活菌数／对照组合菌数×100％
对于单一化学物质当达到抑光率为50%时的浓度用EC50表示，目前已有大量的有机物测得了其EC50值[4]。
对于水样试验结果只能用水样体积表示，EV50即表示抑光率为50%时所相对应的水样体积。
5.试验结果的评价标准
对于某个水样品可根据EC50评价其毒性的有无，按照25%的准则，当某个水样品的EC50≦25%时可记为有毒，按50%准则，某个水样的EC50≦50%可记为有毒[5]，还有一些其它分级方法。如何用发光细菌的检验结果来评价水质进行分类是一个有待研究的问题，目前只能用以在相同条件下比较不同水样的毒性，即加入同一水样体积后测定其抑光率，抑光率大小评价其毒性；或者测得其EV50，依EV50的大小评价其毒性。
发光菌在污水处理领域的应用
2011-02-14 15:21:42 来源：互联网
发光菌急性毒性试验具有操作简单、检测速度快、灵敏度高和成本低等优点，并且毒 性分析和化学分析结果之间存在一定的相关性，因此发光菌毒性试验常作为水质分析的筛选性试 验，是化学分析的有效补充，在污水处理领域被广泛应用。采用发光菌可以评估污水在处理前后的 毒性变化、特定化合物的毒性、各种处理工艺的处理效率，为水质毒性分析、排放水对环境的影响及 处理工艺的改造提供重要的数据支持。综述了发光菌的特征及检测原理、国内外相关检测标准及 检测系统、发光菌在污水处理中的应用、发光菌毒性指标和化学指标的联系，并展望了发光茵在未 来污水处理领域的应用及发展。
关键字：污染物；[3篇] 发光菌；[1篇] 毒性；[2篇] 发光强度[1篇]
Application of Bioluminescent Bacteria in Wastewater Treatment LI Xue—mei， KE Zhen—shan，DU Qing，TIAN Hai—zhu (Water Quality Inspection Center，Beijing Drainage Group Co．Ltd．，Beijing 100124，China) Abstract：The acute toxicity test of bioluminescent bacteria，often being chosen as the first screen— ing method in wastewater quality analysis，is a useful method supplementing chemical analysis and is widely employed in the field of wastewater treatment because of its simple operation，rapid determination， high sensitivity，low cost and certain correlations between chemical analysis and biological toxicity tests． The bioluminescent bacteria toxicity te

st can be used to assess the toxicity of untreated wastewater and treated wastewater，the toxicities of some specified compounds，and the toxicity removal efficiency of treatment technologies and then provide important supporting information for the toxicity assessment，the impact of effluent on the environment，and the reconstruction of the treatment processes．The characteris‘ tics and principle of bacterial bioluminescence test，the related standards and measurement systems，the application of bioluminescent bacteria in wastewater treatment．and the correlations between chemical a— nalysis and bioluminescent bacteria toxicity tests are summarized．Meanwhile，the application and devel— opment of bioluminescent bacterial in the field of wastewater treatment in the future are prospected． Key words：pollutants； bioluminescent bacteria；toxicity；light level





目前，评估污水毒性在处理前后的变化已成为 研究热点之一，处理出水进人生态系统后对生物产 生的影响也成为受关注的内容。 传统的理化分析方法可对污染物定性定量分析，但不能说明物质问的相互作用及其对生物的影 响。为此，人们提出了生物分析方法。目前已有多 种生物被用于水质监测，常用的有发光菌、大型蚤和 鱼类等。发光菌由于具有快速、灵敏等特点而被广 泛应用，特别是在污水处理领域。

1发光茵及检测原理

发光菌是一类在正常生理条件下能发射可见荧 光的细菌，多数为海洋菌。其发光现象是细胞体内 生化反应的结果，发射的可见光波长为450～490 nm，在黑暗处肉眼可见。常见的发光菌有发光异短 杆菌(Photorhabdus luminescens)、鳆鱼发光杆菌 (Photobacterium leiognathi)、羽田希瓦菌(ShewaneUa hanedai)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、费氏弧菌[Vib— rio fischeri，早期被命名为明亮发光杆菌(Photobacte— rium phosphoreum)] j、东方弧菌(Vibrio orientalis) 和淡水青海弧菌(Vibrio qinghaiensis，Q67) 等。发 光菌对毒物较为敏感，体内代谢受毒物干扰时，其生 理行为会发生变化，即有毒物存在时，发光菌的还原 态黄素单核苷酸会减少，发光强度降低，从而表现出 抑制效应。

2相关检测标准及检测系统

2.1 国内外标准

美国、国际标准组织(ISO)和中国等均颁布了 发光菌用于评估水质毒性的相关标准。原理都是把 样品和细菌混合在一起，经过短时间(一般为5～30 rain)的反应，测定细菌的发光强度，通过抑光率评 估样品的毒性。 ISO颁布了《水质水样对弧菌类光发射抑制影 响的测定(发光细菌试验)》(ISO 11348--2007)，该 标准分为3个部分，使用的细菌包括新制备细菌、液 体干细菌和冻干细菌。 美国已把ISO 1 1348_2007作为测定水和土壤 毒性的标准方法——《通过对

海洋发光细菌进行毒 性试验而对遭化学污染的水和土壤进行微生物解毒 予以评估的标准试验方法1》(ASTM—D一5660); 同时，加拿大批准将ISO 11348--2007作为石油钻 井过程中排水和固体废物毒性监测的标准方法 (GUIDE 50)。美国《水和废水检测标准分析方法》 (第21版)也规定了发光菌用于急性毒性评估的方 法，使用的细菌为 fischeri。