《生物物理学》复习重点
《生物物理学》复习重点
【名词解释】
1.熔球中间态（molten globule state）
在一定的条件下，许多蛋白质处于既不是完全地折叠也不是完全地去折叠状态，它们的这种状态被称为熔球中间态（molten globule state）。
2.细胞的自稳作用
①指各个细胞本身具有调节细胞内环境的能力和作用，以有利于实施其生理功能和对应细胞外环境的变化。
它主要包括细胞体积、膜电位和细胞内成分的调节；
②是各种输运机制以及与输运机制相连的细胞浆内的各种反应的整合，因此比个别的输运机制要复杂得多。
3.驰豫过程（荧光的产生）
吸收光能后分子处于激发态。处于激发态的分子可以通过多种途径，将多余的能量释放，使分子又回到稳定的基态，这些释放多余能量的过程就是驰豫过程。
内转换：当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，如第一激发单重态的
较高能级与第二激发态单重态的某一较低能级位能相同会发生电子由高电子能级以
无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上，称为内转换，转换速度10-13～10-11 s（快）。
系间跨越：指激发单重态与三重态之间的无辐射跃迁，原因：激发态电子自旋反转，
造成多重复改变，可能单重态（S1）低振动能级与三重态T1的较高振动能量有重叠。
外转换（猝灭）：激发分子与溶剂分子或其它溶液分子相互作用，发生能量转移，使
荧光或磷光强度减弱甚至消失现象称为猝灭。
→产生荧光、磷光：
荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光称为荧光。
磷光：某种物质被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光，则称这种光为磷光。
4.非辐射共振能量转移（non-radiative resonance energy transfer）
两个分子具有相同的激发能量变化（或受体比供体激发能级稍低），达到一定的距离时，通过两个分子在空间产生的电磁相互作用，供体分子可以将其激发能转移给受体分子，回到基态；接受能量的受体分子则被激发，即形成非辐射共振能量转移。【电磁相互作用】
【区分】不同于：
①激发态分子与另一基态分子发生碰撞产生的能量转移；【碰撞】
②激发态分子释放光子、另一基态分子吸收光子而激发（重吸收）等形式的辐射能量转移。【传光子】
5.群体感应（quorum sensing，QS）
微生物间通过分泌、释放一些特定的信号分子，感知浓度变化，监测菌群密度、调控菌群生理功能，从而适应环境条件的一种信号交流机制，又称细胞交流或自诱导。感应现象在细菌密度达到一定阈值后发生，这一现象也被称为细胞密度基因表达。
群体感应调节：
细菌释放自诱导物质（AI）的信号分子，
→临界浓度时，AI 能启动细菌相关基因表达，
→调控细菌的生物行为（产生毒素、生物膜、抗生素、孢子、荧光等），使其调节自身行为以适应环境变化。
6.侧向散射角（及前向散射角）
前向散射光 (foword scatter，FSC)：信号的强弱与细胞的大小相关。在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。
侧向散射光（side scatter，SSC）：与激光束正交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。
* 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关。散射光信号波长与激光相同。
7.辐射敏感性
辐射敏感性代表以细胞、组织和器官作为一个整体，在一定剂量照射下，在形态和机能上相应变化的大小。P.S：以半致死剂量 (LD50/30)作为机体放射敏感的指标，即受照机体在受照射后30天内引起50%死亡的辐射剂量；如把观察时间定为60天,则以LD50/60表示之。
8.传能线密度（linear energy transfer）
是指直接电离粒子在其单位长度径迹上损失的平均能量，是描述射线与物质相互作用能力大小的重要物理量，单位J/m.
9.原癌基因
在正常细胞中以非激活状态存在的细胞癌基因，称为原癌基因，与细胞增殖相关，是维持机体正常生命活动所必须的，对细胞无害。当原癌基因在理化因素刺激下发生基因突变而被过度激活，则会引起细胞过度增殖、转化为癌细胞、形成肿瘤。
10.旁观者效应
当少数细胞受到射线照射后, 没有受到直接照射的细胞也表现出诸如细胞死亡、基因突变、染色体不稳定（姐妹染色体交换，SCE）等类似直接受照细胞出现的反应。这个效应被称为“放射诱导的旁观者效应”。还可以表现出微核率、转化率的提高，子代细胞中延迟出现的基因组不稳定等多种生物效应。
【适应性反应】（削弱旁观）直接接受低剂量率照射的细胞能诱导一种增强的放射抗拒，这种现象成为“适应性反应”，一种特殊的旁观者效应。这种效应是由于受照细胞产生了可溶性的扩散因子作用于旁观者细胞而引起的。
这种效应伴随着旁观者细胞内AP内切核酸酶的增加，且发生在细胞TP53蛋白的早期下降和细胞内ROS增加之前，结果是削弱了旁观者效应。
【填空与问答】
1.蛋白质结晶的几种方法
①悬滴法：最常用，气相扩散技术；
②微量透析法；
③微量批处理法。
2.蛋白质结晶过程中的影响因素
①蛋白质：蛋白质浓度、蛋白质纯度；
②沉淀剂：沉淀剂种类和浓度；
③溶液：溶液过饱和度、温度、pH值、离子强度和反离子；
④压力、外加物理场、添加剂、提取剂（膜结晶）等。
4.生物膜的生物学功能
①区间化：质膜把整个细胞包裹起来，核膜和细胞内膜系统以及线粒体、叶绿体膜等把细胞分隔成一个个相
对独立的区间。在这些分隔开来的区间中，分别实施着不同类型的特异性活力。使多种活性作用相互干扰减少到最低。
②物质通透和输运的调节：质膜提供的是一种选择性通透的屏障，保证适宜的物质从外环境进人细胞质而排
除不适宜物质的进入。
③对细胞外信号的响应：质膜在细胞对外部刺激的级联响应中起关键作用，即信号传递、放大与转换作用。
质膜上的受体与外部配体（激素、生长因子和神经递质）相互作用使膜产生新的信号，以刺激或抑制细胞内部活力。
④细胞间的相互作用：如细胞间的识别、粘附和交流物质与信息。
⑤生化活性的定位：膜提供一种方式使细胞内进行的各种生命活动有组织地有序地进行。细胞内膜提供细胞
伸延着的网络或支架，把参与反应的多个元件有序地定位安置，以便于相互作用在正确的时间，正确的位点上高效地进行。
⑥能量转换：膜在细胞的能量转换中起着重要作用。光合作用中发生着最大量的能量转换，太阳光能由膜结
合的色素吸收并转换为以碳氢化合物形式储存的化学能。膜还涉及从碳氢化合物或脂肪到ATP的能量转换。
5.膜蛋白的生物学功能
（1）与膜脂分子共同维持膜的完整性、多样性和不对称性。
（2）①细胞质膜的蛋白，主要与涉及胞外环境的细胞活力有关；
②而细胞内膜系统的蛋白则主要与代谢活力有关；
（3）发挥酶的作用(如3—磷酸甘油醛脱氢酶)，
（4）作为输运载体(通道、载体和离子泵)；
（5）信息传递者或能量转导者的功能；
（6）构成细胞膜骨架等。
6.离子通道的类型
①电压门控通道(voltage gated channels): 它们的构象状态依赖于膜两侧离子电荷的差别；
②配体门控通道(ligand gated channel): 它们的构象状态依赖于特异分子(配体)的结合；
③机械门控通道：感应机械力的作用而调控通道的启闭。
7.检测蛋白质互作的方法有哪些？哪些可以进行高通量检测？
检测互作：
1）酵母双杂交（Y2H）
将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如
GAL4 等）的 DNA 结合结构域（BD）基因和转录激活因子（如 GAL4 等）激活结构域
（AD）基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。
2）噬菌体展示
3）亲和纯化质谱分析（TAP-MS）
4）免疫共沉淀（Co-IP）
5）分子成像：无创方法（FRET、BRET、BiFC等）
6）BN-PAGE：blue-native 双向电泳
使用温和的非离子表面活性剂将蛋白质复合物与脂分离，考马斯亮蓝G-250利用其疏水的特性同蛋白质复合物结合，使复合物表面区域丧失疏水特性而呈现水溶性，同时复合物表面足够多的负电荷使其能够在电泳中向阳极泳动。此外，表面的负电荷使得膜蛋白之间发生聚集的能力被显著减弱并降低了被表面活性剂变性的风险。BNPAGE电泳之后，可以将所需的泳道切下来，转到第二向常规SDS-PAGE上分离复合物的组成部分。
7）蛋白质芯片
8）Far-Western Blot
9）交联（Cross-Linking）：迅速、微弱
10）计算分析：推理。
【高通量】
GST pull-down：一个东西把另一个拉下来；Co-IP免疫共沉淀
①酵母双杂时应用Library Screen：The library is a collection of plasmids that each contain a DIFFERENT
TARGET PROTEIN fused to an activation domain.
②噬菌体展示：将靶标分子（抗体）固定在固定相载体，加入噬菌体展示肽库，利用抗原-抗体特异性亲和力将与
抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，反复数轮扩增、淘选，可将有用基因从百万以上的噬菌体克隆中分离。
③亲和纯化：敏感的高通量质谱技术的出现推动了采用全细胞蛋白质组装的生物化学纯化的方法的发展。
④蛋白质芯片：大规模筛选，超高通量分析
⑤计算分析
8.Co-IP非特异性原因分析
（抗体非特异性）
9.BiFC or FRET or BRET的工作原理
1)双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术
【BiFC原理】将荧光蛋白分子的两个互补片段（各自不能发光）分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用。可以在接近活细胞生理状态的条件下观察互作发生时间、位置、强弱。2)荧光共振能量传递FRET - fluorescence resonance energy transfer
【FRET原理】当两个蛋白分子相互作用，各自标记的两个荧光发色基团非常接近（1-10nm），受激态的供体荧光素将其能量向受体荧光素传递，使后者被激发，即发生能量共振转移.
3)生物发光共振能量转移BRET-Bioluminescence Resonance Energy Transfer
【BRET原理】一个蛋白融合表达的供体荧光素酶蛋白跟底物反应生物发光，如水母发光蛋白中：荧光素酶+ CTZ腔肠素→发光。当这个蛋白与另一蛋白互作、距离很近，发光信号与另一蛋白标记的受体荧光基团的激发光谱相重叠，发生共振能量转移，使受体分子发出荧光。
10.泛素化修饰的生物学意义？
泛素化修饰在以下生物学行为中起作用：
1）抗原加工、免疫应答和炎症、病毒感染；
2）调节细胞表面受体、离子通道和分泌途径，胁迫反应和胞外调节；
3）细胞凋亡、细胞周期和分裂；
4）细胞器合成、核糖体生物合成；
5）DNA 转录和修复、分化和发育，神经网络的形态发生、神经和肌肉退化；P.S.泛素化修饰过程：
11.磷酸化修饰的生物学意义？
1）需能反应中的生物热力学调节
2）调节酶反应（抑制）：磷酸化激活/去磷酸化关闭
3）通过识别结构域来帮助蛋白质的互作
4）蛋白质降解
12.如何富集磷酸化修饰的蛋白？
（1）磷酸化抗体：
Anti-pY quite successful.
Anti-pS and anti-pT not as successful, but may be used.
（2）固定化金属亲和层析（IMAC）：带负电的磷酸基团与带正电的金属离子结合（如 Fe3+、 Ga3+）固定到色谱。
缺点：非特异性结合酸性侧链
（3）其它的分离和富集的方法：
①2D-PP 双向磷酸化多肽图谱
②RP-HPLC反相高效液相色谱（磷酸肽的疏水性）
③CE毛细管电泳
④化学修饰法（beta消除反应和二亚胺缩合反应）
⑤CHIP
13.光生物学与辐射生物学的区别？
1）能量：
①辐射生物学是研究高能辐射，如x射线与γ射线等对机体的作用；
②光生物学是研究低能辐射(可见光、紫外光等）对机体的作用；
2）与物质的互作：
①高能辐射因其能量大，与物质的相互作用会引起电离与激发，而主要是引起电离作用，从而启动一系列的
原初与继发的复杂反应；
②可见光、紫外光与物质的相互作用主要是引起激发，激发的分子由于比原来的分子有较高的能量所以不稳
定，会发生一系列的弛豫过程，将多余能量以不同形式释放，分子本身又回到稳定的基态。这些激发分子的各种弛豫过程，就是光生物物理所要研究的一些基本的原初光反应及其规律；
3）能量吸收物质：
①光生物物理还有一特征，就是光对机体的照射，机体中必须有能吸收这些波长光的物质分子存在才能发生
反应。这些能吸收相应可见光和紫外光波长的物质分子就叫做生色团(chromophore)：生色团又叫光感受体，如光合作用中的叶绿素，植物光形态建成中的光敏色素，嗜盐菌的菌紫质，视觉过程中的视紫质等等。
②在高能辐射作用中，因为辐射能量大，只要撞击物质分子都会发生电离，无需机体中有特殊结构的物质分
子来吸收。
14.影响荧光光谱参数的环境因素有哪些？
【参数：λmax，荧光量子产率和荧光强度，荧光寿命，荧光偏振。】
（1）溶剂的极性
①环境极性增加，λmax红移（但不绝对）。一般来说，激发态的极性比基态强，因此被激发的荧光分子将趋
向于与极性溶剂(或极性环境)相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移。
②影响荧光量子产率和荧光强度：量子产率(荧光强度)会随着溶剂(或环境)极性的减小而增加。一种可能的
机制是：在非极性的溶剂中系间交连(转移到另外的激发态)的速率会减少。
（2）环境(如溶剂)的pH值
①如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对λmax有影响。这是因为弱酸和弱碱分子和其离子在
电子结构上有所不同，因而荧光λmax也可能发生变化。例如，1—萘胺—5—磺酸在不同pH值时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离子的荧光波长是不同的。
②pH值也会对荧光量子产率和荧光强度有重要影响。利用荧光物质（弱酸或弱碱）对pH值的敏感性，可以将
它们用作pH指示剂。
（3）溶液粘度
①影响λmax；
②也影响荧光量子产率和荧光强度：荧光强度一般随介质粘度的升高而增强；
③粘度提高，荧光偏振度上升
（4）溶液中的生色团-共振能量转移
①两种生色团荧光频率接近，当两种基团足够接近，处于激发态的生色团将激发能转移到另一种生色团，使
之进入激发态，产生第二种生色团特有的荧光。共振能量转移对λmax可能造成影响；
②和杂质互作→杂质淬灭，荧光强度下降；
③一些荧光染料的荧光寿命随着生色团浓度的增加而延长。（经历了二次激发或多次激发）生色团在分子内的
环境也会影响荧光寿命，寿命才因此用来分析分子内不同生色团所处环境。
（5）光照
对荧光量子产率和荧光强度有重要影响的因素。荧光物质吸收光能，可能造成某一键断裂，这一现象称为光化分解，光化分解会造成荧光逐渐减弱。
（6）温度（影响粘度）
①一般：溶液的荧光强度随温度的降低而增强，温度的升高与荧光强度的减弱在一定范围内是线性关系。温
度每升高1℃，荧光减弱的百分数称为温度系数。一般荧光物质的温度系数大约为1％，但有些荧光物质可大到5％。温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减小，溶剂与溶质分子的动能增加，使得荧光分子的其他分子之间的碰撞几率增加，激发态荧光分子通过分子间碰撞或分子内能量的转移，将自己的能量转移出去。以非荧光发射的形式回到基态，这就造成荧光淬灭，量于产率降低的情况。
②温度升高，荧光偏振度下降。
（7）样品浓度
在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系。浓度过大时常常发生淬灭现象，还可能形成样品分子的二聚体或多聚体，荧光强度大大低于接近饱和时的荧光强度。（8）样品中的杂质
溶液中微生物的产生、分液漏斗上的润滑油、滤纸中的杂质，都可能造成荧光污染。杂质分子与荧光分子的相互作用使荧光量子产率减少的现象统称为杂质淬灭。
15.蛋白质中的荧光生色团？
色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸：蛋白质发光决定于三种芳香氨基酸, 因为它们具有共扼结构易于激发。
16.流式细胞仪的基本构造？
流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)的结构分五部分：
①流动室及液流驱动系统
（负压启动样本流，正压实现样本流）
②激光光源及光束成形系统
③电路和信号转换系统
④计算机和数据处理系统
⑤细胞分选及浓缩系统
17.检测流式细胞仪荧光信号的滤光片类型？
18.影响流式细胞仪荧光信号的因素？
（1）细胞的荧光染色：
①细胞对荧光染料分子的亲和性是否一致；
②细胞结合的荧光分子量；
③染色液的浓度、pH值；染色时间、温度；
④细胞数等；
（2）激光光源的稳定性
（3）细胞流速的稳定性
（4）细胞悬液样品的质量：细胞粘连、重叠、杂质过多等。【荧光补偿】
19.鞘液的作用？
①将样品环形包绕，约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度；
②保持细胞活性；
③避免堵塞喷孔。
20.脂质过氧化
（补充理解：自由基链式反应分为引发，扩展，终止三个阶段；反应起始，新生成的自由基形成许多链的开端。扩展阶段是整个反应的主体。终止价段，自由基越来越少，最后反应停止。不断产生的氢过氧化物ROOH经断裂、重排和氧化，生成多种脂质过氧化物。生物膜脂质过氧化后果使膜的结构和功能发生改变，如不饱和脂肪酸减少、磷脂组成发生变化、膜流动性降低、通透性增加，最终造成细胞结构与功能的损伤。）
Eg1：自由基导致脂质过氧化和生物膜的损伤。皮肤在老年时出现色素沉着，这种色素称脂褐质，俗称老年斑．它是不饱和脂肪酸过氧化物与蛋白质组成的复合物。它的积聚是细胞衰老的基本特征。
1）脂质过氧化产物均有毒性：可引起多种细胞功能的损伤，与多种疾病的发生和发展有关；
2）生物膜上脂质过氧化，对膜损伤是严重的：使膜的流动性下降，使膜坚固性破坏等；
3）脂质过氧化可使质粒DNA单链断裂，质粒的转化活力降低：脂质过氧化可引起DNA损伤，具有碱基特异性，即鸟嘌呤是主要受损部位。脂质过氧化产生的多种自由基可与DNA中的鸟嘌呤发生抽氢反应或加成反应而产生鸟嘌呤自由基；
4）MDA，是脂质过氧化的终产物，能与蛋白质的-SH和-NH2作用：既可产生蛋白质分子内交联，也可产生分子间交联，使依赖-SH或-NH2维持活性的酶失活，使激素受体损伤。
21.电离辐射导致蛋白质一级结构的变化
蛋白质一级结构：蛋白质（包括酶）分子是由20多种氨基酸连接而成的共价多肽链，氨基酸在肽链中的排列顺序决定着蛋白质和多肽的一级结构。
电离辐射蛋白质一级结构的变化，包括：肽链电离、肽键断裂、巯基氧化、二硫键还原、旁侧羟基被氧化等。
22.肿瘤细胞乏氧产生原因？
（补充理解：受照组织、细胞或溶液系统, 其辐射效应应随周围介质中氧浓度的增加而增加, 这种现象称为氧效应 (Oxygen Effects)。）
①氧需求增加：恶性肿瘤生长迅速，肿瘤细胞凋亡的速度明显低于其所对应的正常组织，故导致它对氧及其他能
量物质如葡萄糖等的需求增加，而肿瘤组织内的血液供应则相对不足。
②肿瘤组织远离血管：肿瘤体积高速膨胀，在肿瘤中的一部分肿瘤组织由于离最近的血管的距离越来越远故导致
了它血液供应的不足，最终导致了这一部分肿瘤组织的缺氧。（因此在临床上大部分恶性肿瘤在它的生长、发展过程中都有内部的缺氧区域存在，并且这些缺氧区域最终常常出现坏死，这与在临床手术切除的标本以及各种影像学检查的结果是相符合的。）
P.S：肿瘤内乏氧细胞的形成：
乏氧细胞的存在是导致肿瘤细胞放射抗拒的重要原因，对它的研究是放射生物学领域的热点。急性乏氧会增加肿瘤转移的机会，而慢性乏氧则不会，提示二者生物效应有所不同。
23.原子力显微镜（AFM）的系统可分成几个部分？
原子力显微镜的系统可分成三个部分：力检测部分、位置检测部分、反馈系统。
（1）力检测（还可以检测蛋白质间的相互作用力）
在水溶液中操作时，通过调节尖端-样品之间的距离，这个力一般维持在0.1-1nN 的范围内。生理条件下的AFM 中通常使用的悬臂是用Si3N4做成的，在其固定端有一个锥形的尖端，悬臂在0.01-1 N/m的范围内具有弹性常数。（2）位置检测
AFM系统使用压电陶瓷管制作的扫描器精确控制微小的扫描移动。可以通过改变电压来控制压电陶瓷的微小伸缩。通常把三个分别代表X，Y，Z方向的压电陶瓷块组成三角架的形状，通过控制X，Y方向伸缩达到驱动探针在样品表面扫描的目的；通过控制Z方向压电陶瓷的伸缩达到控制探针与样品之间距离的目的。
（3）反馈系统
样品对于悬臂的反射由一套包括一个激光二极管和一个光电二极管的光学系统进行放大。
24.电子顺磁共振（EPR）和核磁共振（NMR）仪器技术的区别
【概念简介】
1.电子顺磁共振（Electron Paramagnetic Resonance 简称EPR)或称电子自旋共振(Electron Spin Resonance
简称ESR)是利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特性，对顺磁性物质进行检测与分析。
2.核磁共振现象(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)，利用的是原子核的磁矩。
【技术区别】
（1）研究对象：
①EPR 是研究电子磁矩与外磁场的相互作用，即通常认为的电子塞曼效应引起的；
②而NMR 是研究核在外磁场中核塞曼能级间的跃迁。
换言之，EPR 和NMR 是分别研究电子磁矩和核磁矩在外磁场中重新取向所需的能量。
（2）灵敏度：
EPR的灵敏度比NMR 的灵敏度高，EPR检出所需自由基的绝对浓度约在10-8M数量级。
（3）EPR 和NMR 仪器结构上的差别：
③EPR是恒定频率，采取扫场法（射频波不变）；
④NMR是恒定磁场，采取扫频法（固定场强）。