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用花药愈伤组织作为转化受体的水稻转基因植株的分析

用花药愈伤组织作为转化受体的水稻转基因植株的分析
用花药愈伤组织作为转化受体的水稻转基因植株的分析

 遗传学报 Acta Genetica S inica ,December 2004,31(12):1381~1387ISSN 0379-4172

收稿日期:2003-12-04;修回日期:2004-01-15

作者简介:蒋 苏(1978-),女,江苏溧阳人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学① 通讯作者。陈彩艳,E 2mail :caiyanchen @https://www.wendangku.net/doc/cd613686.html, ;蔡 润,E 2mail :cairun @https://www.wendangku.net/doc/cd613686.html,

Anal ys is of t he Tra ns ge nic Ric e Pla nt s De ri ve d

f r o m Tra nsf or me d Ant he r Calli

J IAN G Su 1,2,CHEN Cai 2Yan 2,①,CHEN G Zhu 2Kuan 2,

CA I Run 1,①,ZHA I Wen 2Xue 2,ZHU Li 2Huang 2

(11Depart ment of Botanical Science ,School of A gricult ure and Biology ,S hanghai Jiao Tong U niversity ,S hanghai 201101,Chi na ;

21Instit ute of Genetics and Developmental Biology ,Chi nese Academy of Sciences ,Beiji ng 100101,Chi na )

Abs t ra ct :Rice calli derived from anther culture were used as reci pient to transfer a rice blight re sistance gene ,

Xa21,into a japonica rice variety ,Taipei 309,via Agrobacterium 2mediated transformation.Seven green transgenic plants ,including one mixoploid ,two haploid ,and four diploid plants ,were regenerated.PCR ,Southern blot ,FISH and blight re sistance analysis all indicated that Xa21gene has been integrated into the T 0plant genome s.T 1generations of the four diploid T 0plants were further inve stigated for re sistance segregation.χ2te st showed that two T 1populations segregated with a ratio of 3∶1,indicating that a single copy of Xa21gene was integrated into the genome ,whereas the segregation ratio s of the other two T 1populations were non 2Mendelian.Therefore ,the four diploid transgenic plants should be heterozygous diploids.

Ke y w or ds :rice (Oryza Saltiva L 1subsp 1J aponica );calli of anther culture ;haploid ;transformation

用花药愈伤组织作为转化受体的

水稻转基因植株的分析

蒋 苏1,2,陈彩艳2,①,程祝宽2,蔡 润1,①,翟文学2,朱立煌2

(11上海交通大学农业与生物学院植物科学系,上海 201101;21中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京 100101)

摘 要:以花药愈伤组织作为转化的受体材料,利用农杆菌介导法将已克隆的Xa 21基因导入粳稻栽培品种台北

309中。共获得7个转基因株系,其中2个单倍体,4个二倍体,1个混倍体。PCR 、S outhern 、FISH 以及白叶枯病抗

性的分析结果都表明Xa 21基因已整合到T 0代受体基因组。调查了4个二倍体株系T 1代的分离情况,经χ2

测验

证明,有2个株系的分离比为3∶1,为单拷贝插入,另外2个株系不符合孟德尔分离。4个T 0代二倍体转基因株系应为杂合二倍体。

关键词:水稻;花药愈伤组织;单倍体;转基因

中图分类号:Q94312 文献标识码:A 文章编号:037924172(2004)1221381207

水稻是世界上主要的粮食作物之一,也是重要的模式植物之一,水稻的遗传转化在水稻的品种改良和功能基因组研究等方面有重要作用。目前,用于水稻基因转化的方法主要有两种:基因枪转化法

和农杆菌侵染法。农杆菌侵染法相对于基因枪转化法来说操作上简单、经济,转化的外源片段较少发生重排,可以导入较大的DNA片段,而且可以获得大

量可育的转基因植株。由于单子叶植物并非农杆菌的天然寄主,农杆菌转化水稻在早期被认为是不可行的。直到1994年,Hiei等[1]用农杆菌共培养法转化了3个粳稻品种,获得了大量形态正常的可育转化植株,并经过了分子生物学验证;随后,Rashid 等[2]用农杆菌共培养法转化籼稻获得了成功,农杆菌侵染法才逐渐成为水稻的转化方法之一。

至今为止,农杆菌侵染法转化水稻所用的受体材料多为成熟胚、幼胚等二倍体组织器官诱导而来的愈伤组织。在以这类材料作为转化受体而获得的阳性植株中,外源基因以杂合状态存在,还需进行若干代自交及严格的筛选,才能获得纯合株系。若能以单倍体组织器官为受体材料进行转化,可能会有2个优点:1)单倍体材料无同源染色体联会配对的影响,转化效率可能会较高,外源基因在基因组中的稳定性也会较好;2)经转化后获得的植株不存在显隐性问题,加倍后即可获得纯合的二倍体转化植株。 

目前,水稻的花药培养技术已较为完善,由花药培养获得的愈伤组织已成为较好的单倍体细胞组织的来源。傅亚萍[3]等人曾经对将玉米转座子Ds导入粳稻品种中花11的花粉愈伤组织的工作做了初步尝试性研究,但中花11本身是花培品种,对组织培养的感受性要强于其他常规水稻品种,因此其结果可能存在一定局限性。Xa21是1995年由Song 等[4]克隆的来自野生稻的白叶枯病抗性基因,

对由革兰氏阴性菌稻黄单孢菌(Xanthomonas oryz ae pv. O ryz ae,X oo)引起的水稻白叶枯病具有广谱抗性,而且翟文学等人已应用Xa21作为外源基因建立起了较为成熟的农杆菌转化体系[5,6]。因此,本试验选用粳稻品种中比较有代表性的台北309作为单倍体转化研究的受体,采用农杆菌转化法,将Xa21基因导入台北309的花药愈伤组织中,并对转化植株进行全面的分析,希望能逐步地建立起单倍体转化系统。

1 材料和方法

1.1 材 料

以粳稻栽培品种台北309(Taipei309)花药培养获得的愈伤组织作为转化的受体材料。转化载体为pCXK1301[5](图1)。农杆菌株系为EHA105。

图1 转化载体p CXK1301的基本框架T-BORDER(L):T-DNA左边界;T-BORDER(R):T-

DNA右边界;HYG:潮霉素磷酸转移酶基因;GUS:β-葡萄

糖苷酸酶基因;L ac Z:β-半乳糖苷酶α链基因;Kan为细菌

卡那霉素抗性基因。

Fi g11 Dia gra m of t he pla s mi d p CXK1301 T-BORDER(L):T-DNA left border;T-BORDER(R):T

-DNA right border;HYG:hygromycin phosphotransferase;

GUS:β-glucuronidase;L ac Z:β-galactosidase

alpha;Kan:kanamycin resistance gene.

1.2 转化方法

花药培养以NB[7]作为基本培养基,参照陈英[8]的方法进行花药愈伤组织诱导。带有pCXK1301的农杆菌在含有利福平25mg/L,卡那霉素50mg/L的YM固体培养基上培养48h。将固体培养基上的菌落收集,移至液体共培养基中,摇散,稀释至OD600=016。以NB为基本培养基,采用改进的翟文学等人[5,6]的方法对花药诱导出的愈伤组织进行转化、筛选及分化。分化出的绿苗经壮苗后移栽入温室。

1.3 倍性鉴定

倍性鉴定通常由田间形态鉴定与染色体计数相结合。由于水稻属于小核型小染色体,用普通的根尖压片法比较难于获得清晰的染色体中期分裂相图片。本试验除了染色体计数的方法之外还采用了荧光原位杂交(FISH)的方法,用位于第11号染色体短臂靠近着丝点处的5S rDNA序列[9]为探针,与核染色体杂交,这样即使是间期细胞也能通过杂交的

2831遗传学报 Acta G enetica Sinica Vol.31 No.12 2004

探针数目清楚的判断出细胞的倍性。

田间形态鉴定参照张承妹[10]及黄慧君[11]的描述判断,主要从株高、叶色、穗型、结实性等几方面判断。根尖压片技术在朱澄[12]、仓田の [13]的方法上有所改变,按李懋学[14]的统计标准计数,水稻单倍体为12条染色体,二倍体为24条染色体。FISH 技术采用龚志云[9]的方法,用5S探针与核染色体杂交,出现的探针亮点数表示核染色体的倍数性,单倍体有1个探针标记,二倍体有2个探针标记。

1.4 转化植株中Xa21基因的分子检测

PCR和Southern检测参照翟文学[6]、李晓兵[15]的方法进行。PCR标记的引物如图1所示的I1和U1,I1序列为5′2 A TA GCAACTG A TTGCTTGG23′,U1序列为5′2 CG A TCGGTA TAACA GCAAAAC23′。PCR反应条件为:94℃预变性6min;然后94℃1min,56℃1 min,72℃1min40s,共35个循环;最后72℃保温10min。PCR产物在115%琼脂糖凝胶上于1×TAE缓冲液中电泳检测。

5μg DNA用Eco RⅤ酶切后在018%琼脂糖凝胶上于015×TB E缓冲液中电泳,然后进行Southern杂交。所用探针是在pCXK1301质粒[5]上的Xa21基因的一个114kb的片段,如图1所示,该片段是由引物Z2和Z3通过PCR扩增产生的。Z2序列为5′2ATTG AAT AATTCACTGGGT ATTGG23′,Z3序列为5′2GTCTTG CCTTG CACTTCTG CA CG A23′。

FISH以pCXK1301质粒[5]为探针,按照龚志云、程祝宽[9]的方法与单倍体转化植株根尖细胞的核染色体进行杂交,出现有探针信号的位置即为外源基因片段的插入位点。

1.5 抗性分析

转基因T0代植株栽于温室中,T1种植于大田中。在分蘖盛期用剪叶法对充分伸展的叶片接种P6小种白叶枯菌。接种物在马铃薯培养基上于28℃培养72h,细胞浓度调节至109个/mL,接种后两周调查田间植株抗病情况。判断标准:病斑长度/叶片总长小于15%的为抗病,大于15%而小于25%的为中抗,大于25%的为感病。

2 结 果

2.1 转化植株的获得及其形态特征

由花药诱导出的愈伤组织经转化及两轮筛选后,转化率(抗性愈伤组织数/转化的愈伤组织数)可达到50%左右。本次试验共得到7株绿苗。其中T021、T024、T025、T027株高、叶色、穗型等形态与对照表型相同,能正常结实;T022、T026株高约为正常对照植株的1/222/3,穗型紧密,穗小色淡,开花时无花粉散出,不能结实;T023比对照植株略为矮壮,叶色浓绿,穗型略紧凑,开花时不散粉,不结实。推测T021、T024、T025、T027可能为二倍体植株,T022和T026可能为单倍体植株,T023可能为非整倍体植株。

2.2 转化植株的倍性分析

采用根尖压片法对转化植株根尖细胞进行染色体计数,并按照李懋学[14]的标准进行统计。T021、T024、T025、T027四株与对照未转化的台北309皆为24条染色体,T022、T026两株为12条染色体,T023有12,24,36条染色体等多种情况出现,且无法按照李懋学的标准进行统计。

由于水稻属于小核型小染色体,用普通的根尖压片法比较难于获得清晰的分裂相良好的染色体形态照片,故用处于间期的细胞为材料,并以FISH为补充,进一步确认细胞倍性。以荧光标记的5S rDNA序列为探针与间期或有丝分裂中期核染色体杂交,根据每个细胞中5S rDNA的标记数来确定细胞的染色体倍性。结果表明T021、T024、T025、T027与对照都出现2个探针标记,而T022、T026只出现1个探针标记,T023中分别有1个、2个、3个探针标记等几种情况出现。

将植株形态、染色体计数、FISH3种结果综合后加以分析,判断T021、T024、T025、T027为二倍体, T022、T026为单倍体,T023为混倍体(图2)。

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J IAN G Su et al.:Analysis of the Transgenic Rice Plants Derived from Transformed Anther Calli

图2 单倍体与二倍体比较

1:株高(左:对照;右:单倍体);2:穗型(左:对照;右:单倍体);3:5S rDNA在转化的单倍体T0植株根尖染色体上的分布;4:5S rDNA在转化的二倍体T0植株根尖染色体上的分布;5:5S rDNA在对照染色体上的分布。

Fi g.2 Comp a ris on bet w e e n c ont r ol pla nt s a n d hapl oi d pla nt s

1:The hight of plants(left:control;right:haploid);2:The shape of spike(left:control;right:haploid),3:Distribution of5S rDNA on chromesome of transformed haploid T0plant;4:Distribution of5S rDNA on chromesome of transformed diploid T0plant;5:Distribution of5S rDNA on chromesome of the control plant.

2.3 转化植株中Xa21基因的检测

2.3.1 PCR分析

I1/U1引物在阳性对照pCXK1301质粒[5]的PCR扩增产物中产生114kb的一条DNA片段,在非转基因对照植株的扩增产物中产生113kb的一条内源性的DNA片段[6,15],而在所有的阳性转化植株的扩增产物中除了113kb内源性片段外,基因组DNA还有一条与转入的外源基因相同的114kb 的DNA片段。T0代7株再生植株的PCR扩增产物中均有113kb和114kb两条DNA片段(图3),暗示外源基因片段已插入了再生植株的基因组中。

2.3.2 Southern分析

用Eco RⅤ酶切转化植株的基因组DNA。以Xa21基因的片段为探针进行杂交。如图4所示

,

图3 PCR分析结果

CK1:阴性对照;1~7:由花药愈伤组织转化体系获得的再生

植株;CK2:由二倍体转化体系获得的阳性再生植株;M:

DL2000Maker。

Fi g.3 The re s ult of PCR a nal ys is

CK1:Negative control;1~7:Plants regenerated from transformed anther culturing calli;CK2:Positive plant

regenerated

from diploid transgenic system;M:DL2000Maker.

所有的转化植株在410kb左右的片段上都出现杂

4831遗传学报 Acta G enetica Sinica Vol.31 No.12 2004

交信号。在阴性对照Taipei309植株基因组DNA 中则没有410kb 的杂交带,证明外源DNA 已经整合到再生植株基因组中。图4中在110kb 左右有一条背景带,这是因为栽培稻中有与Xa 21同源的序列[14]

图4 S out he r n 分析结果

1~7:用Eco R Ⅴ进行酶切的T 0代转化植株基因组;

CK:用Eco R Ⅴ酶切的对照台北309基因组;

M :λDNA/Hi nd ⅢMaker 。

Fi g.4 S out he r n a nal ys is

1~7:DNAs from T 0plants were digested with Eco R Ⅴ;

CK:DNA from non -transgenic Taipei 309was

digested with Eco R Ⅴ;M :λDNA/Hi

nd ⅢMaker.

2.4 单倍体转基因植株的原位分子杂交

以pCXK1301质粒[5]为探针与2个单倍体转化

植株根尖细胞染色体作荧光原位杂交。杂交信号

分别出现在一个单倍体的1号染色体上和另一个单倍体的2号染色体上,荧光信号出现的位置说明是外源基因片段的插入位点。2个单倍体转化植株的11号染色体上也都分别出现了杂交信号,初步推测可能为背景信号,因为Xa 21的同源序列位于第11号染色体上(图

5)。

图5 单倍体转化植株的荧光原位杂交

Fi g.5 FIS H of t ra ns ge nic hapl oi d pla nt

2.5 转基因植株中Xa21基因的抗性表型

接水稻白叶枯菌P6小种2周后进行田间调查。7个T 0代植株的抗性表现如下:4个二倍体植株及1个混倍体植株表现为抗病,2个单倍体植株表现为中抗,对照植株表现为感病(表1)。

表1 T 0代植株抗病情况

Ta ble 1 Re s is t a nc e of T 0

编号Number

CK 1234567病斑长度/叶片长度的平均值(%)

Average of lesion lengh/leaf length (%)

70.7

5.05

15.5

2.18

1.32

1.52

23.6

1.85

感抗程度Resistance

感病(S )

抗病(HR )中抗(MR )抗病(HR )抗病(HR )抗病(HR )中抗(MR )抗病(HR )

倍性Ploidy

2n

2n

n

n ,2n ,3n

2n

2n

n

2n

 S :Susceptible ;HR :High resistant ;MR :Middle resistant.

2.6 T 1代植株的PCR 检测及抗性表型

PCR 检测了4个二倍体株系的T 1代,每个株

系各考察了100个单株(不足100株的则全部调查),发现存在有一定的分离比(表2)。对T 1代植株接水稻白叶枯菌P6小种2周后进行田间调查,发现在T 021和T 025的后代中抗感分离比的χ2测验结果为3∶1,符合孟德尔遗传定律,说明外源基因为

单拷贝插入;但T 024和T 027的后代的抗感分离比

无法用孟德尔遗传定律解释(表2)。所有这些结果都说明了4个二倍体的T 0植株为杂合二倍体。

3 讨 论

本试验共获得7个来自水稻花药愈伤组织的阳

性转基因植株,它们的染色体倍性均经过严格的细

5

831J IAN G Su et al.:Analysis of the Transgenic Rice Plants Derived from Transformed Anther Calli

表2 T1代株系感抗分离比

Ta ble2 S e gre gati on rati o of T1

编号Number1457

抗性调查(R:S)

Segregation ratio(R:S)

70∶2886∶1375∶2359∶41 PCR(+:-)

Ratio of PCR(+:-)

70∶2887∶1278∶2060∶40χ2测验χ2test3∶1-3∶1-

 R:抗病;S:感病;+:阳性;-:阴性。

 R:Resistant;S:Susceptible;+:Positive;-:Negative.

胞学检测,其中有2个单倍体,4个二倍体,1个混倍体。T0代的PCR、Southern及FISH结果证明外源基因已插入了植物基因组中。4个二倍体株系T1代的PCR及抗性表型分析结果都存在分离,说明4个二倍体株系都为转基因的杂合二倍体。经χ2测验,T021和T025的后代抗感分离符合3∶1,说明为单拷贝插入;T024和T027的后代为非孟德尔遗传分离。

本试验获得了2个单倍体转基因植株,说明在单倍体阶段的愈伤组织是可以作为转化受体的。但转基因的单倍体植株的抗性表现不如二倍体植株,推测因为单倍体植株本身生活力弱于二倍体植株,这可能会导致其抗性降低,不过这一推论需等单倍体植株加倍后验证。

自从1994年Hiei等[1]用农杆菌共培养法成功的转化了3个粳稻品种之后,农杆菌介导的水稻转化体系成为了研究的热点之一。基因转化在种质资源改良、遗传育种及功能基因组研究等方面发挥着重要的作用。目前的水稻转化体系多是以二倍体材料为受体,得到的转基因系多为杂合体,还需经过纯合才能应用于生产。花药培养技术是目前使杂合基因快速纯合的有效手段之一。将花药培养与基因转化两种技术有机的结合起来,可在较短时期内获得纯合转基因系。花培技术与基因转化技术的结合有两种方式:一是对转基因植株进行花药培养[16],二是以花药愈伤组织为受体进行转化。前者只是单纯地对转基因系进行纯合,仍是以二倍体为受体,需经过两次组培过程,周期较长;后者是以单倍体为转化受体,只经历一次组培过程,周期相对较短。本实验的结果是初步的尝试,傅亚萍等人[3]也曾对后者做过尝试性的研究,但本试验与其结果有所不同。

以水稻的花药愈伤组织作为转化的受体材料,最主要的目的是期望最终能够获得纯合的转基因植株。纯合的转基因植株来源一般有两个:一是将得到的单倍体转基因植株人工加倍后获得纯合的二倍体转基因植株;二是在转化过程中单倍体转基因植株自然加倍成为纯合的二倍体转基因植株。在以花药愈伤组织为受体的转化过程中,自然加倍现象有可能发生在愈伤组织诱导、筛选、分化等阶段。自然加倍若发生在愈伤组织诱导阶段,原先的单倍体受体变成二倍体受体,转基因植株会出现与普通二倍体转基因植株一样的杂合体。若自然加倍发生在筛选分化等过程中,则仍是以单倍体为转化受体,在转化之后再发生自然加倍,成为纯合的二倍体转基因植株。值得注意的是本试验未能获得这样的二倍体转基因植株,其原因可能是在花药愈伤组织诱导阶段使用的渗透压高于其他阶段,由于高渗透压而导致在此阶段发生自然加倍的频率会高于其他阶段。也就是说,在此阶段获得外源基因整合的杂合二倍体的可能性要大于纯合二倍体。本试验获得的二倍体转化植株都是转基因的杂合体也验证了这一推论。既然高渗透压在花药愈伤组织诱导阶段是必需的,而高渗透压又会导致此阶段过多的自然加倍,因此寻找一个合适的渗透压,即在提高花药愈伤组织诱导率和降低此阶段自然加倍率之间寻找一个平衡点,将成为今后研究的重点。

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李晓兵,裔传灯,翟文学,杨振玉,朱立煌.经基因工程改良的

抗白叶枯病水稻粳型恢复系“C4182Xa21”及其杂交稻.生

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基因水稻经花药培养获得纯系的研究.中国水稻科学,

1999,13(1):19~24.

(责任编辑:韩玉波)

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J IAN G Su et al.:Analysis of the Transgenic Rice Plants Derived from Transformed Anther Calli

浅谈我国转基因水稻的研究(一)

浅谈我国转基因水稻的研究(一) 论文关键词]水稻转基因论文摘要]稻转基因研究是国内外植物分子遗传学研究的热点之一。目前,水稻转基因研究在我国已取得显著进展。详细介绍转基因技术,并阐明我国转基因技术在水稻上的应用及研究进展, 水稻是我国的重要经济作物和粮食作物。水稻分布极其广泛,由于生态环境的复杂性和所处地理环境的影响,水稻在漫长的进化过程中,形成了极其丰富的遗传多样性,染色体组型和数目复杂多样,成为研究稻种起源、演化和分化必不可少的材料。 植物转基因技术是利用遗传工程手段有目的地将外源基因或DNA构建,并导入植物基因组中,通过外源基因的直接表达,或者通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达,使植物获得新性状的一种品种改良技术。它是基因工程、细胞工程与育种技术的有机结合而产生的一种全新的育种技术体系。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的各种抗性或抗性相关基因转入水稻,进一步拓宽了水稻抗病基因源,为抗病育种提供了一条新途径。 一、国内外的转基因技术 转基因技术自20世纪70年代诞生以来,已经取得迅速的发展。到目前为止,中国已经是全球第4大转基因技术应用国。 转基因生物技术的应用,大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。中国是继美国之后育成转基因抗虫棉的第二个国家。现在河北省与美国孟山都合作育成33B抗虫棉(高抗棉铃虫、抗枯萎病、耐黄萎病)。由中国农科院生物中心、江苏省农科院导入Bt基因,由安徽省种子公司,安徽省东至县棉种场共同选育的抗虫棉“国抗1号”在安徽省已通过审定。国际水稻所将抗虫基因导入水稻,育成抗二化螟、纵卷叶螟的转基因水稻。中国农科院、中国农业大学、中国科学院、河南农科院等许多科研单位和高校将几丁质酶和葡聚糖酶双价基因导入小麦育成抗病转基因小麦、转基因烟草、转基因水稻等等。英国爱丁堡大学将水母发光基因导入烟草、芹菜、马铃薯等作物,获得发光作物,驱赶害虫。 至于油菜方面利用转基因工程培育雄性不育系及其恢复系的研究,亦取得了突破性的进展。比利时为了提高菜饼粗蛋白质的含量,将一种草控制的蛋白质基因转移到油菜上来,选出高蛋白质含量的转基因油菜品种。瑞典Svalow-Weibull等公司利用基因工程技术将外源基因导入甘蓝型油菜,培育成抗除草剂油菜新品种;比利时PGS公司采用基因工程手段创造出新的油菜授粉系统;法国应用原生质体融合技术将萝卜不育细胞质的恢复基因引入甘蓝型油菜,充分利用萝卜不育细胞质不育彻底的特性,实现了萝卜不育细胞质的三系配套,对推动全球杂交油菜育种具有革命性的影响。 二、我国转基因技术在水稻上的应用及研究进展 我国是农业超级国,因此,中国人吃饭问题的关键是水稻问题(高产和抗性问题),而水稻问题的核心便是转基因技术在水稻中的成功应用。 近年来,植物抗病毒基因工程的技术路线已趋向成熟,国内外相继开展了水稻东格鲁病、条纹叶枯病、黄矮病、矮缩病等8种病毒病的转基因育种研究,将各病原病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、编码结构或非结构蛋白基因干扰素CDNA等分别导入水稻,获得了抗不同病毒病的转基因株系或植株。在我国,转基因技术在水稻中的应用已经取得了惊人的成果。(一)转基因技术在提高水稻植株的抗Basra除草剂的成果 王才林等利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系“E32”,获得转基因植株。抗性鉴定表明,转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性;通过对转基因植株后代PCR分析,证实bar基因已整合到受体植株的基因组中,遗传分析表明,bar基因能在有性生殖过程中传递给后代,并在T代开始分离出抗性一致的稳定株系。段俊等利用转基因技术,

转基因作物的研究进展

生物与环境工程学院课程论文 转基因作物的研究进展 学生姓名:魏斌聪 学号:200806016139 专业/班级:生物工程081班 课程名称:生物工程原理 指导教师:陈蔚青教授 浙江树人大学生物与环境工程学院 2011年5月

转基因作物的研究进展 魏斌聪 (浙江树人大学生物与环境工程学院生工081班浙江杭州310015) 摘要:人们将所需要的外源基因(如高产、抗病虫害优质基因) 定向导入作物细胞中, 使其在新的作物中稳定遗传和表现,产生转基因作物新品种, 是大幅度提高作物产量的一项新技术。本文先描述了转基因作物的发展进程,对其基因问题的研究作了讨论,并列出转基因作物目前存在的主要问题并作分析,最后对此项技术作出展望。 关键词:转基因作物;DNA技术;基因导入;安全性 前言 转基因植物(transgenic plant),是指基因工程中运用DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质,改变生长周期等提高其经济价值或实用价值。[ 1 ]其主要范围是在作物方面,如可食用的大豆、玉米等,或者可投入生产的棉花等作物。 从表面上看来,转基因作物同普通植物似乎没有任何区别,它只是多了能使它产生额外特性的基因。从1983年以来,生物学家已经知道怎样将外来基因移植到某种植物的脱氧核糖核酸中去,以便使它具有某种新的特性:抗除莠剂的特性,抗植物病毒的特性,抗某种害虫的特性。[ 2 ]这个基因可以来自于任何一种生命体:细菌、病毒、昆虫等。这样,通过生物工程技术,人们可以给某种作物注入一种靠杂交方式根本无法获得的特性,这是人类9000年作物栽培史上的一场空前革命。[ 3 ] 1 转基因作物的发展进程 转基因作物的研究最早始于20世纪80年代初期。1983年,全球第一例转基因烟草在美国问世。1986年,首批转基因抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1996年,美国最早开始商业化生产和销售转基因作物(包括大豆、玉米、油菜、

野外试验方案

野外试验方案-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN

试验方案 一、试验目的 近年来,有关利用合理的水稻种植模式,尤其是水稻品种间栽或混作来增加稻田的生物多样性,从而控制水稻病虫害的研究报道不断增多,这方面的研究已成为国内外的一个热点,本次实验就是为了探究增加稻田生物多样性对害虫飞虱的影响,通过观察稻田生物多样性对飞虱繁殖力、抗药性、致害型、天敌数量、对水稻病虫害的等影响,从而去研究其中的相关影响机制。以期能减少化学农药的施用,减少环境污染,更好地去发展生态农业。 二、试验材料 由广东田联种业有限公司提供水稻种子,选取以下两种: 植优523:感温型三系杂交稻组合。早造平均全生育期130~132天。科高~106.3厘米,株型中散,分蘖力中强,穗大粒多。中抗稻瘟病,全群抗性频率%~%,对中B群、中C群的抗性频率分别为%~75%和85%~%;中抗白叶枯病(IV型菌3级、V型菌7级)。丰产性较好,中抗稻瘟病和白叶枯病,耐寒性中弱。 特优816:感温型三系杂交稻组合。早造平均全生育期131~132天。科高~115.6厘米,植株较高,株型中集,分蘖力和抗倒力中弱,剑叶较宽、长,穗大粒多,后期熟色好。高抗稻瘟病,全群抗性频率%,对中C群、中B群的抗性频率分别为%和%,田间监测结果表现抗叶瘟、高抗穗瘟;感白叶枯病,对C4菌群、C5菌群分别表现感和中感。 田间均无抗飞虱抗性表现。 三、试验设计 试验设三个处理,分别为A:单作植优523、B:单作特优816、混作植优523和特优816,其比例A:B=5:1设三次重复,每小区面积200 m2,总面积大概3亩左右。如下图所示

化学平衡难点(平衡转化率、等效平衡)讲解与练习【经典】3

化学平衡·难点讲解与习题 一、等效平衡 一、概念 在一定条件(恒温恒容或恒温恒压)下,同一可逆反应体系,不管是从正反应开始,还是从逆反应开始,在达到化学平衡状态时,任何相同组分的含量(体积分数、物质的量分数等)均相同,这样的化学平衡互称等效平衡(包括“相同的平衡状态”)。 概念的理解: (1)外界条件相同:通常可以是①恒温、恒容,②恒温、恒压。 (2)“等效平衡”与“完全相同的平衡状态”不同:“完全相同的平衡状态” 是指在达到平衡状态时,任何组分的物质的量分数(或体积分数)对应相等,并且反应的速率等也相同,但各组分的物质的量、浓度可能不同。而“等效平衡”只要求平衡混合物中各组分的物质的量分数(或体积分数)对应相同,反应的速率、压强等可以不同。 (3)平衡状态只与始态有关,而与途径无关,(如:①无论反应从正反应方向开始,还是从逆反应方向开始②投料是一次还是分成几次③反应容器经过扩大—缩小或缩小—扩大的过程,)只要起始浓度相当,就达到相同的平衡状态。 二、等效平衡的分类 在等效平衡中比较常见并且重要的类型主要有以下三种: I类:恒温恒容下对于反应前后气体体积发生变化的反应来说(即△V≠0的体系):等价转化后,对应各物质起始投料的物质的量与原平衡起始态相同。 II类:恒温恒容下对于反应前后气体体积没有变化的反应来说(即△V=0的体系):等价转化后,只要反应物(或生成物)的物质的量的比例与原平衡起始态相同,两平衡等效。 III类:恒温恒压下对于气体体系等效转化后,只要反应物(或生成物)的物质的量的比例与原平衡起始态相同,两平衡等效。 解题的关键,读题时注意勾画出这些条件,分清类别,用相应的方法求解。我们常采用“等价转换”的方法,分析和解决等效平衡问题 三、例题解析 I类:在恒温恒容下,对于化学反应前后气体体积发生变化的可逆反应,只改变起始加入物质的物质的量,如果通过可逆反应的化学计量数之比换算成化学方程式的同一边物质的物质的量与原平衡相同,则两平衡等效。 例1:在一定温度下,把2 mol SO2和1 mol O2通入一定容积的密闭容器中,发生如下反应,

转基因水稻潜在致敏性的安全性评价

转基因水稻潜在致敏性的安全性评价 摘要:利用基因工程技术已经成功培育出抗虫?抗病?抗逆?耐除草剂和改善营养品质的转基因水稻,其安全性问题成为研究热点?对转基因水稻上市前进行严格和科学的安全性评估是当前一个亟待解决的课题,其中一项重要内容是评估转基因食品的致敏性?对当前国内外水稻过敏原的研究?对转基因食品潜在致敏性的安全性评价以及加工处理对致敏原的影响等研究进展进行了综述? 关键词:水稻过敏原;转基因水稻;潜在致敏性;安全性评价 The Safety Evaluation on Potential Allergenicity of Genetically Modified Rice Abstract: As genetically modified rice, like insect and disease resistance, stress resistance, herbicide tolerance and improved nutritional quality, and so on, had been successfully produced by genetic engineering techniques, the security issues became a research focus. Safety assessment of transgenic rice pre-market has been a rigorous and scientific problems to be solved, an important part of which was to assess the allergenicity of genetically modified foods. The current domestic and international research on rice allergens, safety evaluation on the potential allergenicity of genetically modified food, and the impact of allergen processing research were reviewed. Key words: rice allergen; transgenic rice; potential allergenicity; safety evaluation 水稻(Oryza sativa L.)作为世界上最重要的粮食作物之一,培育高产?优质的水稻 品种对世界水稻生产具有重要的现实意义?利用基因工程技术已经成功培育出抗虫?抗病?抗逆?耐除草剂和改善营养品质的转基因水稻?转基因水稻给人类带来的经济?社会?营养等方面的效益是明显的,然而在2005年的非法转基因水稻污染中国大米事件发生后,对转基因水稻生物安全问题的关注程度日益加强,加快推进转基因水稻产业化进程中如何最大限度地降低其可能带来的风险;发展和完善蛋白致敏原的检测?鉴定和分析方法;加强对转基因水稻的致敏性评价研究,保障其健康有序地发展,是目前面临的关键问题?本文就转基因水稻的潜在致敏性的研究进展进行了综述? 1 水稻过敏原的研究 作为人类主食被消费的谷物食物如大米?小麦?玉米等发现过敏现象后,引起科学界的高度关注?1978年Shibadaki等[1]报道水稻蛋白具有过敏作用,1988年Matsuda等[2]运用HPLC?ELASA?SDS-PAGE及亲和层析法分离纯化得到一种存在于水稻种子胚乳中的过敏原,进一步研究发现该过敏原分子中脯氨酸(Pro)和半胱氨酸(Cys)含量比谷蛋白和球蛋白要高?且这种过敏蛋白在100 ℃处理60 min后仍然可保持60%的过敏反应活性?Urisu A等[3]通过进一步分离得到6种过敏蛋白,分子量分别为14?15?16?26?33?56kDa?发现14~16 kDa过敏蛋白具有α淀粉酶抑

广西水稻品种试验实施方案

年广西水稻品种实验实施方案 广西区种子管理局 广西农科院水稻研究所 一、实验目的 为了鉴定评价新选育的水稻品种(组合,下同)在我区的丰产性、稳产性、适应性、抗逆性、品质及其它重要特征特性表现,为我区品种审定、推荐参加全国南方区试等提供科学依据,根据《广西壮族自治区农作物品种管理实施办法》有关规定,特制定年广西水稻品种区域实验、生产实验和预备实验实施方案。 二、参试品种 (一)区域实验和生产实验 年开展早稻桂中、桂北早熟组(以金优和株两优为对照)、中熟组(以优和五丰优为对照)、桂南迟熟组(以特优为对照)、常规优质稻组(以柳沙油占为对照);晚稻设桂中、桂北中熟组(以优和五丰优为对照)、桂中中迟熟组(以天优华占为对照)、桂南感光组(以博优为对照);高寒山区一季中稻组(以中浙优号为对照); (二)预备(筛选)实验 开展早稻桂中、桂北早熟组(以株两优为对照)、中熟组(以五丰优为对照)、桂南迟熟组(以特优为对照);晚稻设桂中、桂北中迟熟组(以天优华占为对照)、桂南感光组(以博优为对照)、常规优质稻组(以柳沙油占为对照); 各熟组参试品种安排详见附件表~、表~。附件上没有参试品种安排的,请不要寄种子,否则当废种处理。 实验方案在“广西种业信息网()”上公布,不再印发。 三、供试种子要求 年所有参试品种(包括对照品种)在实验过程中实行实验编号管理,要求供种单位统一把参试品种的种子提供给广西农科院水稻所,进行编号后再分发到各承试点(包括抗性鉴定点)。分组编号情况报广西区种子管理局备案,对实验点和供种单位一概保密。各实验点不需再重新编号,以免发生错误。 (一)供种量 区域实验公斤个,生产实验早稻中熟组、晚稻中熟组和中迟熟组公斤个,其它熟组公斤个,预备(筛选)实验公斤个。

水稻愈伤转化

水稻愈伤组织转化 一、实验目的 1.掌握植物组织培养的基本原理; 2.学习水稻愈伤组织的诱导方法; 3.学习农杆菌转化法的原理,掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法; 4.学习转基因植株的各种鉴定方法(包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH 等),同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。 二、实验原理 1.植物组织培养 植物组织培养(plant tissue culture)是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等,在人工控制的培养基上培养,使其生长、分化以及形成完整植株的技 术。自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来,植物组织培养已有100余年历史。用于离体培养的各种植物材料称为外植体(explant)。根据外植体的类 型,又可将组织培养分为:器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。(从这个角度讲,本学期的实验属于胚胎培养。)植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。 2.基因工程 基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”,并按照人们的意愿重新组合,以改变生物的性状和功能,然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞 内,并使其在生物体内或细胞中表达,从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植 物一般称为“基因工程植物”。自1983年首次获得转基因植物以来,转基因技术发展十分迅速, 成功进行转基因的植物已达60多种,在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例,有些转基因产品已进入市场。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。 3.农杆菌转化法 转基因的方法有很多,对于植物而言,最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌,其内含Ti质粒:

转基因食品的安全性分析

转基因食品的安全性分析 ——转基因食品对免疫力的影响 摘要:在转基因食品正在走进生活时,其现状研究便极为重要。在此浅显介绍转基因食品概况、安全性的情况,及对免疫力的影响。 关键词:转基因食品安全性免疫力 随着我国加入世贸组织,对外贸易及农产品进出口步伐将大大加快,转基因食品也将越来越走进人们的生活.转基因食品是指利用分子生物技术,将某些生物的基因转移到其他物种中去,改造生物的遗传物质使其在性状、营养品质、消费品质方面向人们所需要的目标转变,以转基因生物为食物或为原料加工生产的食品就是转基因食品。 1.转基因食品概况 1.1 转基因食品的定义 转基因食品是指利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂。 1.2 转基因食品的分类 转基因食品大体上可分3类:(1)转基因植物食品。如转基因的大豆、玉米、番茄等,是转基因食品中种类较多的一类,主要是为了提高食品的营养及抗虫、抗病毒、抗除草剂和抗逆境生存以降低农作物的生产成本和改良品种,以及提高产量。(2)转基因动物食品。由于技术方面的原因,转基因动物的产业化进程远远落后于转基因植物。转基因动物经处理后可以生产更多具有优良品质的奶和肉。(3)转基因微生物食品。如利用基因工程菌发酵而制得的高品质的葡萄酒、啤酒、酱油和面包等。 2.安全性问题 转基因食品是利用新技术创造的产品,也是一种新生事物,人们自然要问,食用转基因食品安全吗? 其实,最早提出这个问题的人是英国的阿伯丁罗特研究所的普庇泰教授。1998年,他在研究中发现,幼鼠食用转基因土豆后,会使内脏和免疫系统受损。这引起了科学界的极大关注。随即,英国皇家学会对这份报告进行了审查,于1999年5月宣布此项研究“充满漏洞”。1999年英国的权威科学杂志《自然》刊登了美国康乃尔大学教授约翰·罗西的一篇论文,指出蝴蝶幼虫等田间益虫吃了撒有某种转基因玉米花粉的菜叶后会发育不良,死亡率特别高。目前尚有一些证据指出转基因食品潜在的危险。

水稻愈伤组织培养

水稻愈伤组织的诱导 李希 北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系,北京,100083 摘要:以水稻种子为外植体,研究了外植体的消毒方法和接种技术,了解了水稻愈伤组织诱导的过 程。结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm,四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm,6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm,8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm,无杂菌污染。 关键词:水稻种子外植体诱导愈伤组织 引言 自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来,水稻组织培养取得了很大的进展,如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选,遗传特性,基因工程转化体系的建立等等。水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础,因此掌握外植体的消毒方法和接种技术,了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时,在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。外植体源自自然环境均为带菌状态,在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料,有时要几种消毒剂配合使用。本次试验使用的诱导剂为2,4-D,诱导率为100%。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验材料 水稻成熟种子(用于诱导愈伤组织); 1.1.2仪器设备及用具 超净工作台培养室、培养皿:¢9cm×2 枪形镊量筒:100mL×2 三角瓶:50mL×2(无菌);废液缸;保鲜膜;标签纸 1.1.3试剂及培养基 试剂:75%酒精,2% NaCLO,无菌水(每组1瓶400mL) 培养基:诱导培养基:MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L(pH5.8) 1.2 实验方法 1.2.1 MS固体培养基配制: 由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂,所以直接按照41.5g/L的浓度配置。实验中配置50ml培养基,需依次加入2.075gMS,0.1mg2,4-D; 用NaOH或HCl调节PH=5.8; 高压蒸汽锅121℃灭菌20min。 1.2.2接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子,将培养基及用具放工作台,打开紫外灯,20分钟以表面消毒。之后关紫外灯,打开工作台风机,通风30分钟后可进行无菌操作。 1.2.3种子去壳 选取饱满、无霉变成熟水稻种子,用手工脱去谷壳(注意保持胚完整),准备20粒去壳种子,

选修4--等效平衡与转化率

第四讲等效平衡与转化率 一、等效平衡原理 在一定条件下(恒温恒容或恒温恒压),对于同一可逆反应,起始时投料方式不同,不管从正反应开始,还是从逆反应开始,只要达到平衡状态时,各组分在混合物中的百分含量相同,这样的化学平衡就互称为等效平衡。 如:恒温恒压下,对可逆反应:2SO2 + O2 2SO3 ① 2mol 1mol 0mol ② 0mol 0mol 2mol ③ 0.5mol 0.25mol 1.5mol ①从正反应开始,②从逆反应开始,③从正逆反应同时开始,由于①、②、③三种情况如果按方程式的计量关系换算成同边的物质,对应各组分的百分含量均相等,因此三者互为等效平衡。 二、等效平衡规律 根据反应条件(恒温恒容或恒温恒压)以及可逆反应的特点(反应前后气体分子数是否相等),可将等效平衡问题分成三类: ①恒温恒容时,对于反应前后气体分子数改变的可逆反应,用“一边倒”的方法将各种投料方式换算为同一边的物质,若各物质的物质的量相等,则两平衡等效。 此种情况下,两等效平衡状态中,各组分的百分含量,物质的量,物质的量浓度。 【例1】恒温恒容时,判断哪些是等效平衡?() N2 + 3H2 2NH3 (A) 2mol 6mol 0mol (B) 0mol 0mol 4mol (C) 0.5mol 1.5mol 1mol (D) 1mol 3mol 2mol 【例2】将2molSO2 (g)和2molSO3 (g)混合于某固定体积的容器中,在一定条件下达平衡,平衡时SO3(g)为w mol,同温下,分别按下列配比在相同体积的容器中反应,达平衡时SO3 (g)的物质的量仍为w mol 的是() A.2molSO2(g)+1mol O2(g) B.4mol SO2(g)+ 1mol O2(g) C.2mol SO2(g)+ 1mol O2(g)+ 2mol SO3(g) D.3mol SO2(g)+1.5mol O2(g)+ 1mol SO3(g) 【例3】在一个固定容积的密闭容器中加入2 mol A和1 mol B,发生反应2A(g)+B(g) ? 3C(g)+D(g),达到平衡时,C的浓度为w mol/L。若维持容器的容积和温度不变,按下列情况配比为开始浓度,达到平衡后C的浓度仍为w mol/L的是() A.4molA+2molB B.2molA+1molB+3molC+1molD C.3molC+1molD+1molB D.3molC+1molD E.1molA+0.5molB+1.5molC+0.5molD 【例4】在一定温度下,把2 mol SO2和1 mol O2通入固定容积的密闭容器里,发生如下反应: 2SO2+O2? ? 2SO3,当此反应进行到一定程度时,反应混合物就处于化学平衡状态。现在该容器中,维持温度不变,令a、b、c分别代表初始加入的SO2、O2和SO3的物质的量,如果a、b、c取不同的数值,它们必须满足一定的相互关系,才能保证达到平衡时反应混合物中三种气体的百分含量仍跟上述平衡时的完全相同。请填写下列空白: (1)若a=0,b=0,则c = ___________。(2)若a=0.5,则b=_________,c=?_________。(3)a、b、c取值必须满足的一般条件是,。

水稻转基因步骤

在植物转基因过程中,为了有效地识别和筛选转化子,常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存,而标记基因(尤其是抗生素抗性基因)的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因,其中最常见的是共转化法(Komari 1996,McCormac 等2001)。共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物,其中一套表达盒含有抗性选择标记基因,另一套表达盒含有目的基因,它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。转基因植株在减数分裂过程中,标记基因和目的基因发生分离,从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记,是保证人畜和环境安全的重要措施,因此受到了广泛的重视。Zhou 等(2003)认为,用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。目前关于利用双T-DNA区表达载体,获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道(唐俐等2006,张秀春等2006,于恒秀等2005)。花药培养与遗传转化技术相结合,可以快速获得纯合转基因植株(斯华敏等,1999,付亚萍等,2001),但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。 水稻是最主要的粮食作物,转基因水稻的安全显得尤为重要。本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系,将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻,由于该表达载体采用双T-DNA结构,将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株,得率为9.87%。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件,从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后,会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。 基因转化方法参照Hiei等(1994)的方法并加以修改。取开花后12-15 d左右的稻穗脱粒,表面灭菌后接种在NB培养基上,26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养,用于共培养。农杆菌于含50mg/L卡那霉素(Kam)的YM平板上划线,28℃黑暗培养3d,用金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5,加入AS(终浓度为100mΜ),即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。将继代培养4d后的愈伤组织浸于此菌液中,20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液,随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上,于26℃下暗培养2~3d。共培养后的愈伤组织在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上,26℃暗培养14d,再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14d。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/l潮霉素的分化培养基上,暗培养3天后转至15h/d 光照条件下培养,再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。选择高约10cm、根系发达的小

水稻转基因育种研究进展 7

水稻转基因育种研究进展 王彩芬,安永平,韩国敏,张文银,马 静 (宁夏农林科学院农作物研究所,宁夏永宁 750105) 摘要:对水稻转基因技术在抗虫、抗病、抗逆及改良米质等方面的进展进行了综述。 关键词:水稻; 转基因育种; 进展 中图分类号:S511.035.3 文献标识码:A 文章编号:1002-204X(2005)06-0055-03 20世纪下半叶以来,由于分子生物学研究的巨大成就,使生物学成为自然科学的带头学科,它的理论和方法已渗透到生命科学的许多领域,为生命科学的研究带来新的思维方式和研究手段。基因工程技术在植物遗传育种上应用很广泛,并取得了显著成就。 水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。据专家预测,到2025年在现有稻谷产量的基础上再增加60%才能满足需要(K hush,1995)。随着人口的增长和耕地面积的减少,世界尤其是我国将面临粮食问题的严峻挑战,培育优良品种是提高稻谷产量的主要途径。传统的育种技术已为培育水稻新品种做出了巨大贡献,并将在今后继续发挥主导作用,但由于品种资源的贫乏,单靠传统育种已很难有大的突破。基因工程技术为水稻分子标记辅助育种、水稻转基因育种提供了一条新途径。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的抗病、抗虫、抗除草剂、抗旱、耐盐、改善品质、提高产量等基因转入水稻,从而实现水稻种质创新和为生产提供优良品种。自1988年以来,国内外已得到了许多水稻转基因植株,涉及到抗虫、抗病、抗除草剂、抗旱、耐盐、改良品质等重要农艺性状,有些已进入田间试验和应用阶段。 1 水稻转基因育种进展 植物转基因育种是利用遗传工程的手段,有目的地将外源基因或DNA构建导入植物基因组,通过外源基因的直接表达,或通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达,使植物获得新的性状的一种品种改良技术。在植物分子生物学研究的众多材料中,水稻不仅是世界重要粮食作物,而且由于其基因组较小、重复序列较少的优点而成为一种重要的分子遗传学研究的单子叶模式植物,基因组测序已完成。自1988年首次获得转基因水稻以来,水稻转基因技术已获得突飞猛进的发展,目前已成功获得籼稻、粳稻、爪哇稻的转基因植物。随着基因枪转化技术的建立和根癌农杆菌介导转化法的成功,水稻基因转化技术日益完善。而且转移目标基因已从报告基因或筛选标记基因进入改良水稻抗性和适应性,以及改善品质,提高产量等重要基因的利用。 1.1 抗虫转基因水稻育种 水稻是虫害最多的大田作物,稻螟虫和稻飞虱危害最为严重,水稻中抗虫资源贫乏,转基因技术为抗虫品种的培育提供了一条新途径。自从1989年实现苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)抗虫基因转化水稻并得到再生植株以来,转抗虫基因水稻的研究取得了很大进展。转抗虫基因水稻包括转Bt基因、转蛋白酶抑制基因和转凝集素基因。在转Bt基因的研究方面,中国农科院生物技术中心杨虹等(1989)将Bt基因导入水稻品种台北309、中花8号的原生质体并获得再生植株;Fujim oto等(1993)通过电激法将cry LAb 基因导入水稻,首次报道了转Bt基因水稻对二化螟和稻纵卷叶螟的抗性。项友斌等(1999)利用农杆菌介导实现了苏云金杆菌抗虫基因cryI A(b)和cryI A(c)在水稻中的转化;黄健秋等(2000)利用农杆菌介导获得转(Bt)基因秀水11和春江11植株;薛庆中等(2002)利用农杆菌介导获得转双价抗虫基因(cryI Ac和豇豆胰蛋白酶抑制基因C pTI)浙大19植株;朱常香等(2002)获得Bt和X a21共转化水稻(C48)植株。近几年转Bt基因研究越来越多,进展很快,在籼稻、香稻、爪哇稻、杂交稻、深水稻中获得成功,选育出克螟稻1号、2号、3号(舒庆尧等,1998)。转Bt基因水稻在我国已进入环境释放阶段,有望培育出应用于生产的抗虫品种。 在转蛋白酶抑制剂基因水稻研究方面,通过电激介导原生质体转化,Xu等(1996)把豇豆胰蛋白酶抑制剂基因C pT i转入粳稻品种台北309,转基因植株对大螟和二化螟2种水稻虫害都具有抗性;通过基因枪介导马铃薯蛋白酶抑制剂基因PinⅡ转化水稻,Duan等(1996)获得了Nipponbare、台南67和Pi4等3个粳稻品种的抗大化螟转基因株系;Lee等(1999)利用PEG介导法将大豆K units胰蛋白酶抑制剂(SK TI)的cDNA转入粳稻Nagdongbyeo的原生质体,再生转基因植株的后代抗褐飞虱。曾黎琼等(2004)利用农杆菌介导将马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ)导入玉优1号、HT-7中;孔维文等(2004)利用农杆菌介导将PT A和马铃薯高赖氨酸蛋白基因(S B401)同时转入超级杂交稻亲本材料1826中。在转凝集素基因水稻研究中,主要是转雪莲花凝集素(G NA)基因,采用基因枪法,英国John Innes Centre(Maqbool等,1999;Rao等,1998;Sudhakar等,1998)把G NA基因导入AS D16、M5、M7、M12、FX92D、Basmati370等籼稻品种中,得到200多株转基因植株,G NA在水稻中呈高水平的组成性表达(用Ubi启动子)或韧皮部专一性表达(用Rssl启动子),转基因植株抗褐飞虱。在我国,傅向东等(1997)用G NA基因枪转化水稻IR72、IR76、珍汕97和秀水11等品种,部分转基因植株子代对褐飞虱有一定抗性;T ang(唐克轩等,1999)通过基因枪介导实现了G NA 基因和X a21基因的共转化,得到了转基因植株。唐克轩等(2003)利用农杆菌介导将半夏凝集素基因(pta)导入粳稻鄂宛105、中花12和籼稻E优532中,获得7个转基因纯系。 1.2 抗病转基因水稻育种 抗病转基因水稻包括转抗病毒基因、抗真菌病害基因和抗细菌病害基因。抗病毒转基因已开展了8种病毒的转基因研究,包括水稻通枯罗病毒(rice tungro disease)、水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged 收稿日期:2005-07-21 作者简介:王彩芬(1968-),女,副研究员,从事水稻花培育种研究。T el:0951-*******E-mail:caifen-68@https://www.wendangku.net/doc/cd613686.html,

实验室水稻种植方法

一个水培还有就是土培 水培就是放在水里让他们发芽的土培就是种在土里保持土层湿润就好了 种子播在准备好的秧田上,当苗龄为20~25天时移植到周围有堤的水深为5~10公分(2~4吋)的稻田内,在生长季节一直浸在水中。 耕种方式 稻米的种植技术,包括稻田和插秧,是在中国发明的。传说中是神农氏教导人们如何种稻。 目前稻的耕种除传统的人工耕种方式,亦有高度机械化的耕种方式。但仍不失下列步骤: 整地: 种稻之前,必须先将稻田的土壤翻过,使其松软,这个过程分为粗耕、细耕和盖平三个期间。过去使用兽力和犁具,主要是水牛来整地犁田,但现在多用机器整地了。 育苗: 农民先在某块田中培育秧苗,此田往往会被称为秧田,在撒下稻种后,农人多半会在土上洒一层稻壳灰;现代则多由专门的育苗中心使用育苗箱来使稻苗成长,好的稻苗是稻作成功的关键。在秧苗长高约八公分时,就可以进行插秧了。 插秧: 将秧苗仔细的插进稻田中,间格有序。传统的插秧法会使用秧绳、秧标或插秧轮,来在稻田中做记号。手工插秧时,会在左手的大拇指上戴分秧器,帮助农人将秧苗分出,并插进土里。插秧的气候相当重要,如大雨则会将秧苗打坏。现代多有插秧机插秧,但在土地起伏大,形状不是方型的稻田中,还是需要人工插秧。秧苗一般会呈南北走向。还有更为便利的抛秧。 除草除虫: 秧苗成长的时候,得时时照顾,并拔除杂草、有时也需用农药来除掉害虫(如福寿螺)。 施肥: 秧苗在抽高,长出第一节稻茎的时候称为分蘖期,这段期间往往需要施肥,让稻苗成长的健壮,并促进日后结穗米质的饱满和数量。 灌排水: 水稻比较倚赖这个程序,旱稻的话是旱田,灌排水的过程较不一样,但是一般都需在插秧后,幼穗形成时,还有抽穗开花期加强水份灌溉。 收成: 当稻穗垂下,金黄饱满时,就可以开始收成,过去是农民一束一束,用镰刀割下,再扎起,利用打谷机使稻穗分离,现代则有收割机,将稻穗卷入后,直接将稻穗与稻茎分离出来,一粒一粒的稻穗就成为稻谷。 干燥、删选: 收成的稻谷需要干燥,过去多在三合院的前院晒谷,需时时翻动,让稻谷干燥。删选则是将瘪谷等杂质删掉,用电动分谷机、风车或手工抖动分谷,利用风力将饱满有重量的稻谷自动筛选出来。

水稻愈伤组织的诱导实验报告

水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术; 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时,在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养,通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态,在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料,有时要几种消毒剂配合使用;对于多茸毛表面粗糙不平的材料,要加展著剂(吐温20)以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料:水稻成熟种子(用于诱导愈伤组织); 2、试剂:75%酒精,2% NaCLO,无菌水(每组1瓶400mL); 3、培养基:诱导培养基:NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L(pH5.8); 4、仪器设备:培养室、超净工作台、培养皿(¢9cm)2个、枪形镊、量筒(100mL)2个、三角瓶(50mL、无菌)2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤 1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子,将培养基及用具放工作台,打开紫外灯,照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯,打开工作台风机,通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子,手工脱去谷壳(注意保持胚完整),每人准备30粒去壳种子,并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒

在进入无菌室之前,各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干,然后进入无菌室,坐在超净台前位子上后,用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒,在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。(注意:酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上!) 4、超净台面的表面消毒(以下工作在超净工作台内进行) 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球,仔细把整个超净台面擦试一遍,尽量降低超净台面的带菌量,并将废棉球丢到废液缸中,然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒(分组操作,每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作) 将脱谷壳米粒转到一50mL 无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次(以没过种子为准,下同)→弃水,倒入75%酒精适量,摇动搅拌,放置30秒(过程中适当轻摇动混匀)→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO ,不时摇动搅拌,共处理30分钟→弃NaCLO →用无菌水洗3次,每次停留1分钟→倒去无菌水,将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。 6、接种与观察 将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置,每皿接10粒,每人共接种2皿。接种完成后,将培养皿盖上并用保鲜膜封口,然后将接种有材料的培养皿移出超净台,贴上标签写明日期、接种人,按照班级统一放入一篮子,再将篮子放入培养室进行25℃暗培养。注意每隔2-3天前来观察一次实验现象,1周后调查计算污染率,14天后调查计算愈伤组织诱导率。 五、实验结果 本次实验我组未出现被污染的种子,污染率均为0 。说明实验过程中,我组成员操作规范,保证所接种的种子均不受到污染。 最后,我组的2个培养皿分别可以诱导出7和8株水稻苗,诱导率分别为70% ×100% 形成愈伤组织的种子数 污染率(%)= ×100% 污染的种子数 接种的总种子数 诱导率 (%)= 接种的总种子数

化学平衡中转化率求法与规律总结

化学平衡中转化率求法与规律总结 平衡转化率= 或:平衡转化率=%100-?质的量 该反应物的起始起始物量该反应物的平衡物质的量某反应物的起始物质的 平衡转化率=%100) ()(?或物质的量的浓度质的量该反应物的起始起始物或物质的量浓度量某反应物转化的物质的 【规律】反应物用量得改变对转化率得一般规律 (1)若反应物只有一种:a A(g) b B(g) + c C(g),在不改变其她条件时(恒温恒容),增加A 得量平衡向正反应方向移动,但就是A 得转化率与气体物质得计量数有关:(可用等效平衡得方法分析)。 ①若a = b + c :A 得转化率不变;②若a > b + c : A 得转化率增大; ③若a < b + c A 得转化率减小。 (2)若反应物不只一种:a A(g) + b B(g) c C(g) + d D(g), ①在不改变其她条件时,只增加A 得量,平衡向正反应方向移动,但就是A 得转化率减小,而B 得转化率增大。 ②若按原比例同倍数地增加A 与B,平衡向正反应方向移动,但就是反应物得转化率与气体物质得计量数有关:如a +b = c + d ,A 、B 得转化率都不变;如a + b >c + d ,A 、B 得转化率都增大;如a + b < c + d ,A 、B 得转化率都减小。 3、充入“惰性气体”增大压强判断各反应物转化率变化 对于可逆反应aA(g)+bB(g) cC(g)+dD(g),(a +b ≠c +d,)在压强变化导致平衡移动时,学生感到困惑得就是充入“惰性气体”化学平衡朝哪个方向移动?转化率如何变化?可归纳为以下两方面: (1)恒温恒容条件下充入“惰性气体”,化学平衡不移动。因平衡体系得各组分浓度均未发生变化,故各反应物转化率不变。 (2)恒温恒压条件下充入“惰性气体”,化学平衡向气体体积增大得方向移动。因为此时容器容积必然增大,相当于对反应体系减压,继而可判断指定物质得转化率变化。 4、NO 2、N 2O 4平衡问题2NO 2(g) N 2O 4(g) (1)恒温、恒容得条件下,若分别向容器中通入一定量得NO 2气体或N 2O 4气体,重新达到平衡后:可视为加压,平衡都向右移动,达到新平衡时NO 2得转化率都增大,N 2O 4 得转化率将减小。NO 2体积分数减小,N 2O 4体积分数增大,混合气体相对分子质量增大。 若要求某一时刻得转化率只要把平衡时得反应物浓度(或物质得量)改为某一时刻得反应物浓度(或物质得量)即可。 现将有关平衡转化率得问题小结如下: 1、 对有多种反应物得可逆反应达到平衡后加其一。这种情况不管状态如何均认为所加物本身转化率减小其它物质转化率增大 例1:,反应达到平衡后增大得浓度,则平衡向正反应方向移动,得转化率增大,而得转化率降低。 逆向运用: 例2、反应: 3A(g)+B(g) 3C(g)+2D(g)达到平衡后加入C 求A 得转化率 分析:加入C 促使D 向A 、B 进一步转化故D 向A 、B 转化得转化率增大而A 、B 向C 、D 转化得转化率减小。 2、 对只有一种反应物得可逆反应达到平衡后再加。 由于反应只有一种所以无论往反应物加多少量都可视为等比例增加反应物得用量,故认为有两种情况: (1)恒温恒压:由于恒温恒压时等比例扩大或缩小反应物得用用量均与原平衡等效故转化率不变,各反应物与生成物得体积分数不变,各反应物与生成物物质量会跟原平衡相比,等比例增加,但浓度不变 (2)恒温恒容:此时可以瞧成反应叠加后,增大压强使平衡向气体总系数小方向移动, 例3.,反应达到平衡后,再向密闭容器中加入,反应达到平衡时NO 2、N 2O 4得物质得量(或物质得量浓度)均增大,颜色变深,NO 2转化率增大。

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