96孔培养板示意图(A4纸打印版)

细胞培养板的选择和使用

细胞培养板的选择和使用（四） 点击次数：1678 作者：clearair00 发表于：2008-07-23 10:32转载请注明来自丁香园 来源：丁香园 （一）培养板的清洗和消毒 培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。 问：只有紫外照射可以保证无菌吗?可不可以从清洗方面做点工作? 答：看你什么用途了，一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。 我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯<２０ｃｍ）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。 其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省了，留点钱还不如买点好试剂呢：） 我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯<3０ｃｍ）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过；2、到放射科照Co60，照完了尽快用。 我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板

子，也不是很贵。 我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干，用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。 永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。 紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？ 板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作台里（打开盖子）用紫外线照射半小时以上，最好一小时或两小时，盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分钟，不要时间太长，这样板子容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子！旧板子做，结果不准！ 泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸馏水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用纯的无水乙醇），用前在紫外线下照射1h。基本可保证95％以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。 1.钴60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌。 2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。 (二)方法讨论

板种细胞问题(不均匀)

细胞不均匀的问题 原因： 1.培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，建议多加液体 2.接种后不要摇晃，传统的思想认为摇一摇能使细胞均匀，但是事实上在摇晃的时候由于剪应力等多种因素的影响，细胞反而分布不均。 解决方案： 1)接种到培养瓶的细胞，轻轻地让细胞悬液流遍整个瓶底； 2)接种到培养皿或者培养板的细胞，用枪头对准中央加，让细胞悬液自行流遍整个孔，若有少量区域未能覆盖到细胞悬液，可用枪头轻轻牵引悬液，千万不要摇。细胞悬液铺满后，不宜立刻放入孵箱中，我一般静置>15min，这样接种的细胞很均匀。 3)培养皿划“十”字交叉轻轻混匀（力度不易太大，否则剪切力损伤细胞），重复一次。轻轻放入孵箱即可。 （1）平底和圆底（U型和V型）培养板的区别和选择： 贴壁细胞一般用平底培养板。悬浮型细胞的培养一般用V型。 U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞。V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。 （2）细胞培养常见问题与解答 问：我看到培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格，但不知道到底什么实验用哪种规格。 答：要根据你具体的实验要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，细胞爬片一般用24孔等，要具体根据你实验来定。

问：我想测吸光度用酶标仪，用多孔细胞培养板行吗？请问酶标板多孔细胞培养板有什么区别？ 答：用多孔细胞培养板测吸光度肯定可以拉，我们经常用它来做样品的蛋白定量和MTT检测。 区别：酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，但也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不能用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。 （3）细胞培养板的密闭和污染问题 问：96，24孔培养板或培养皿的盖子都很松，这样是方便了透气，但是细菌、霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢？ 答：1.盖子很松，属于半开放培养，这样的目的是透气（实际上是为了使培养皿外的co2能够与培养皿充分交换，维持培养基的pH值）。 2.凡事有利必有弊，这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发，这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的 a培养箱内空气必须清洁（定期紫外线照，酒精擦洗，尽量少开关培养箱） b培养箱内的湿度必须始终保持为100%（培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽）。就好像培养皿，也是一个盖倒扣的容器，也不会污染。主要是因为盖子“L”型边缘产生气流负压的缘故，灰尘上面才附着有微生物，而气流携带的灰尘是无法通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散，不会产生气流，所以只会透气不会透菌。 问：我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作（在超净台内），而其它孔中还有细胞要培养.我很担心这样会污染，不知道要注意什么?

96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤

96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤(protocol) 摘要：96孔微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）检测细菌生物膜有着许多优势。一方面，在对大批样品快速操作时能保持试验的一致性。另一方面，微量板定量检测法不仅能对细菌形成生物膜定性，而且还能定量计算细菌形成生物被的能力，因此96孔微量板法被广泛应用于定量检测细菌生物被膜的方法。 关键词：生物膜 , 菌膜 相对于其它细菌生物膜体外培养方法而言，微孔板法有着当然的批处理优势，尤其是在对大批样品快速操作时还能保持试验的一致性，使得96孔板，乃至384孔板检测法大量应用于细菌生物膜的研究。微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）不仅能定性细菌能否形成生物膜，而且和不同染色方法结合，还能定量计算细菌形成生物被的能力，这对实验室生物被膜研究工作是非常有利的，因此96孔微量板定量检测法是目前实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的方法。 主要试剂和仪器： 聚苯乙烯96孔板、PBS缓冲液、甲醇、1%结晶紫溶液、33%冰乙酸溶液、酶标仪或分光光度计。 实验步骤： (1) 在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μl培养液，接种10μl过夜培养菌液，37°C静置孵育36h； (2)将培养液吸出，每孔加入200μl无菌PBS缓冲液清洗板孔3次；

(3) 每孔加入100μl甲醇固定15min，然后吸出培养孔中的甲醇，自然风干； (4) 每孔加入100μl 1%结晶紫溶液，室温下染色5min； (5) 吸出培养孔中的结晶紫染色液后，用流水把多余的染料冲洗干净； (6) 把培养板倒置在滤纸上除去残余的水，并在37°C烘箱中烘干或室温凉干； (7) 完全干燥后，每孔加入100μl 33%冰乙酸溶液，在37°C培养箱中作用30min以溶解结晶紫； (8) 590nm条件下，用酶标仪测定培养孔中溶液的OD值； (9) 每次试验每种菌株做3个孔的重复，试验数值取3次平均值（D值）； (10) 以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(Dc)。 结果判定： 基于D值，菌株可分为3类： （1）强生物被膜形成株（D＞2×Dc）； （2）弱生物被膜形成株（Dc＜D≤2×Dc）； （3）无生物被膜形成株（D≤Dc）。

酵母菌BIOLOG 96孔板介绍 2

YT 鉴定使用 YT鉴定板提供94个生化测试反应来鉴定/特征化一系列酵母菌。 A—C行测定是颜色，以A1孔作为参照孔。 D—H行测定的是浊度，以D1孔作为参照孔。 鉴定板培养24，48，或/和72h，形成特定图谱，读取获得鉴定结果。 注意事项： 1 用纯化后的菌落 2 用特定的培养基，最好转接2代 3 无菌操作，避免污染 4 尽量用一次性玻璃器皿 5 使用前预热接种用无菌水和鉴定板至室温 6 校正浊度仪，配制特定浓度范围的菌悬液 7 biolog的化合物包含对光和温度敏感的成分。鉴定板孔颜色变为深褐色表明碳源也变质。一些孔显示黄色或粉红色是正常的。 8 鉴定板测试的是活体细胞的代谢特性，一些菌在受到一些压力选择，如温度，PH，渗透压即使几秒也会失去代谢活力。为得到最好的结果，一定确保细胞有活性，操作时也要注意。 无菌水自己制备无菌水，在无菌间将其转入biolog提供的相同的规格的玻璃管中。（20ml 容量，20×150mm），每管放入12-15ml无菌水 测试步骤 1 在BUY培养基上26℃培养待鉴定的酵母菌。凡能用YT鉴定板鉴定的菌都可以在该条件下培养生长。 2 样品准备及观察特征 利用湿法制备（水片法）或革兰氏染色（如果需要的话）来确认待鉴定菌株是酵母菌。 转到BUY培养基培养，最好培养两代。 细胞需要新鲜培养，平板培养基上培养时间为24-48h 如果菌量较少不足以接种鉴定板，多接几块平板，培养24-48h 3 接种准备 以装有空白无菌水玻璃管调100%T透光率 用标准比浊管校正，应为47%T 制备特定浓度菌悬液 接种上鉴定板，不要操作20min，每孔100ul 4 培养 放于26℃培养鉴定板

96孔板的选择指南

96孔板的选择指南： 96孔聚苯乙烯微孔板 Item No. 孔型底颜色结合 力灭菌/盖子X个/包X包/箱 650101 U型底* 硬底透 明——/— 5 20 650161 U型底硬底透 明—+/— 2 50 651101 V 型底* 硬底透 明——/— 5 20 651161 V 型底硬底透 明—+/— 2 50 655101 平底* 硬底透 明——/— 5 20 655161 平底硬底透 明—+/— 2 50 655074 平底/独立柱状* 硬底白* LUMITRAC TM600高结合力+/— 5 8 655075 平底/独立柱状硬底白LUMITRAC TM200中结合力* —/— 5 8 655076 平底/独立柱状硬底黑* FLUOTRAC TM200中结合力—/— 5 8 655077 平底/独立柱状硬底黑FLUOTRAC TM600高结合力* +/— 5 8 655094 平底/独立柱状μClear?(软）*白高结合 力+/—10 4 655095 平底/独立柱状μClear?(软）白中结合 力—/—10 4 655096 平底/独立柱状μClear?(软）黑中结合 力—/—10 4 655097 平底/独立柱状μClear?(软）黑高结合 力+/—10 4 *U型底微孔底为圆形，适用于进行凝聚实验；无死角，适用于移取液体； 直径：6.94mm,孔高：10.3mm, 板高：14.2mm 总体积：323 μl ; 工作体积：40-280μl *V 型底微孔底部为V型，适用于精准取样；适用于存储微量样品。 直径：6.18mm,孔高：10.8mm, 板高：14.1mm 总体积：324 μl ; 工作体积：40-200μl *平底底部是水平的，光透底部不会发生偏折，适用于精密光学实验（底部读取信号）； 口直径：6.96mm,底直径：6.39mm;孔高：10.9mm, 板高：14.6mm 总体积：382 μl ; 工作体积：25-340μl ;底面积：32mm2. *平底/独立柱状孔与孔之间距离大些，独立分开，能最大程度地减少交叉污染； 口直径：6.96mm,底直径：6.58mm;孔高：10.9mm, 板高：14.4mm

细胞培养板的选择与常见问题解答

细胞培养板的选择与常见问题解答 细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底（U型和V型）；培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。 （1）平底和圆底（U型和V型）培养板的区别和选择： 贴壁细胞一般用平底培养板。悬浮型细胞的培养一般用V型。 U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞。V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。 不同型状的板子自然有不同用途。平底的什么类型的细胞都可用﹐但当细胞数目较少﹐如做克隆时﹐就用96孔平底板﹐另外﹐做MTT等实验时﹐无论贴壁和悬浮细胞﹐一般均用平底板。至于U或V型板﹐一般在某些特殊要求时才使用。如在免疫学方面﹐当做两种不同淋巴细胞混合培养时﹐需要二者相互接触以刺激﹐因此﹐一般需要U型板﹐因细胞会由于重力的作用而聚集在一个很小的范围内。V型板的用途更少﹐一般用于细胞杀伤实验时﹐为了使效靶细胞紧密接触﹐常使用V型板﹐但这种试验也可用U型板替代(加入细胞后﹐低速离心)如果是养细胞的话，通常是选用平底的，另外要特别注意材质，标示"Tissue Culture (TC) Treated"就是养细胞用的。 圆底的好像没听说过拿来养细胞。圆底的通常是拿来做分析，化学反应，或是保存样品用的，因为圆底比较好将液体吸得干净，如果用平底的就不好吸了。不过，如果你是要测吸光值的话，一定要买平底的才行。大部分细胞培养都用平底培养板，便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致，还便于MTT检测。圆底培养板主要用于同位素掺入的实验，需要用细胞收集仪收集细胞的培养，如“混合淋巴细胞培养”等。 （2）细胞培养常见问题与解答 问：我看到培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格，但不知道到底什么实验用哪种规格。 答：要根据你具体的实验要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，细胞爬片一般用24孔等，要具体根据你实验来定。 问：请问哪位高手知道Terasaki板是什么培养板，与普通细胞培养板有什么区别？ 答：Terasaki plate主要是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种sitting 和handing drop两种方法，两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystal class polymer ，特殊的材料有利观察晶体结构。 细胞培养板主要是PS材料。材料是treated sufface。便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料，同时还有low binding surface，有关更多实验材料上的应用与对材料的选择。

完整word版培养瓶培养皿培养板详解及图谱

细胞培养瓶Nunc 可以完全接触到整个生长表面。符合人体工学标准。转就可以开关瓶盖,只需旋转1/3任何脚标处于向上的垂直状态则表“Y”“Y”标志可以确定瓶盖透气位置，可视性的即使示瓶盖在透气的的位置，任何脚标处于向下的垂直状态则表示瓶盖密封的，在培养瓶堆叠在培养箱中都可以轻易看见。培养瓶两旁都有标识刻度。/密封和过滤两种类型瓶盖。可以选用透气 细胞瓶面积容量工作体积细胞数目6 2ml25ml12.5cm210 5 50ml5ml25cm210 10ml 75ml35cm210 , ^. 15ml250ml75 cm210 8 o9 _8 40ml 700ml 150cm21.107 3 K* u- @( O0 O, n 补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。 培养板

l: B2 V6 k1 z5 q' i细胞培养板细胞接种量4~5×10 4 96孔板 1.孔10 548 2孔2.10 5 10 5孔1 10 6孔1. { s; ?$ q8 l# |1 l 培养皿

生长面积容量细胞数（大约）0 1×10 6 35mm培养皿 2.660mm培养皿×10 6 7×10 6 100mm培养皿 10 7 培养皿150mm ×1.8 注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。

细胞计数及铺板

用于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板 ［实验步骤］ 1、准备工作用75%的洒精擦拭双手，同时用洒精棉球擦拭超净台。2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血活、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。 2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS?W洗一遍，四个方向晃动倒掉。 3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿?内，拍血，上下左右铺匀，37°消化30 分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全. 4、加入4ml的含5%血活的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬:液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min. 5、弃上活。用PBS 3ml洗细胞，吹打或涡旋混匀，洗2次，离心1000rpm,3min.弃上活。 6、配细胞稀释液（BSA终浓度为0.1%）.每种细胞需3ml稀释液，共6个样品，所以配20ml稀释液（无血培20ml+10%BSA 200ul.） 7、细胞沉淀中加3ml细胞稀释液，吹打混匀，即得稀释过的细胞悬液。 8、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品计数2次，算均值。（8个大格总数/8=数值*104） 9、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补。 普通的细胞计数及铺板（免疫荧光，W舞不需定量） ［实验步骤］ 1、准备工作用75%的洒精擦拭双手，同时用洒精棉球擦拭超净台。2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血活、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。 2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS!活洗一遍，四个方向晃动倒掉。 3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿?内，拍血，上下左右铺匀，37°消化30 分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全. 4、加入4ml的含血活的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.若细胞较多，贝U 需稀释。 5、取上述1ml细胞悬液，在加1ml含血活的新鲜培养基，混匀。 6、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品对角线计数2次，算均值。 7、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用含血活的新鲜养基补。