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文库构建

Step1:总RNA的提取和纯化

RNeasy Mini Kit,QIAGEN

1.从RNAlater保存的组织中剪取一块组织,确定组织的重量,并确保组织不大于30mg,将其放入容器中。

2.加入适当体积的Buffer RLT(已加入βME),快速进行匀浆处理,直到组织彻底裂解。(20–40s)

文库构建

3.13000rpm,离心3min,小心地将上清转移到一新离心管中。

4.加入1倍体积70%乙醇,立即吹吸混匀,不要离心。

5.将所有物质(包括沉淀)转移到柱子上,轻盖管盖,13000rpm离心15s。弃去流出物。(样品多时可多次收集)

6.向柱子中加入700μl Buffer RW1,轻盖管盖,13000rpm离心15s漂洗柱子。弃去流出物。

7.向柱子中加入500μl Buffer RPE,轻盖管盖,13000rpm离心15s漂洗柱子。弃去流出物。

8.重复7

9.可选择的:把柱子放入一新收集管中,全速离心1min。

10.把柱子放入一新1.5ml离心管中,加30–50 μl RNase-free water至柱子中央,静置1min,13000rpm离心1min洗脱RNA。

11.如果预期RNA产量>30 μg,用40μl RNase-free water重复步骤10或用洗脱液重复10(如果要得到高浓度RNA)

12.电泳检测RNA。

提取的总RNA保存在-20度,并在一周内进行下一步实验(-80度可以长时间保存)。

Step2:poly A+ mRNA的分离纯化

首先要确定起始RNA的量。每步反应所需RNA的量不能超过0.25mg。

计算输出量和输入量的比值。理论上mRNA的量占总RNA的1%-5%。

自备的材料:

65℃水浴无菌、无RNA酶的1.5ml离心管无菌、无RNA酶的枪头

1.探针的退火

在一个无菌、无RNA酶的1.5mL离心管中加入0.1-1.0mg的总RNA,再用RNase-free水溶解总RNA至终体积500μL,将离心管放入65℃水浴中热击10min,加入3μL生物素链接的oilgo(dT)探针和13μL 20×SSC,轻轻混匀,静置降至室温,大约10min,在此期间准备0.5×SSC和0.1×SSC。

2.准备洗涤液

1.2mL 0.5×SSC:30μL 20×SSC+1.170mL RNase-free水

1.4mL 0.1×SSC:7μL 20×SSC+1.393mL RNase-free水

3.洗涤磁珠

取出磁珠储存液,轻弹管底重悬磁珠,分散均匀后用磁力架捕获磁珠,使磁珠都吸附到管壁,大约30s,小心的除去上清(不能离心)。用0.5×SSC洗涤磁珠3次(每次300μL),每次都使用磁力架捕获磁珠,小心地移去上清。重悬磁珠与100μL的0.5×SSC中。

(磁珠洗涤完后必须在30min内使用,磁珠不能重复使用)

4.捕获并洗涤oilgo(dT)- mRNA复合物

将退火后的体系加到重悬后的磁珠缓冲液中,室温静置10min,中间每1-2min颠倒混匀一次,磁力架捕获磁珠,小心除去上清(注意不要搅动颗粒)。用0.1×SSC洗涤磁珠4次(每次300μL),期间轻弹管底直至颗粒已被重悬(最后一次漂洗后,在不搅动SA-PMPs的前提下,以8000rpm,1min,尽可能多的移出上清)。

5.洗脱mRNA

用100μL RNase-free水重悬磁珠,磁力架捕获磁珠,将上清液(含洗脱下来的

mRNA)转移到新的离心管中。再用150μL RNase-free水重悬磁珠,将两次上清液合并于一管,共250μL。

(如果这时有任何颗粒也被带到终溶液中,可用8000g,4℃,离心5-10min,小心地将RNA 转移到一新的无RNA酶的离心管)

6.mRNA的冻干及溶解

将250μL mRNA溶液冻干,大约1.5h,然后用10μL RNase-free水重新溶解。

沉淀和浓缩mRNA:

如果分离mRNA的总RNA质量大于0.5mg,那就要通过乙醇沉淀来浓缩;

1.cDNA克隆:向洗脱液中加入0.1体积3M醋酸钠(pH5.2)和

2.5体积的无水乙醇,放

到-20℃过夜。

体外翻译:向洗脱液中加入0.1体积3M醋酸钾或醋酸铵和2.5体积的无水乙醇,放到-20℃过夜。

2.12000g,离心10min,去掉上清,加入1ml70%乙醇漂洗沉淀,再次离心,去掉上清。

晾干沉淀,加入无RNA酶水溶解。

3.短期保存:真空干燥器干燥沉淀大约15min,按0.5–1.0μg/μl加入无RNA酶的去离子水,

保存在-70℃。

长期保存:把RNA保存在醋酸钠或异丙醇中,-70℃保存,用前进行离心。

如果开始用的总RNA产量少于0.5mg,先把mRNA洗脱液在-20℃冻10min,然后用真空冷冻离心机冻干,大约需要2.5h。

1)真空冷冻干燥:

2)沉淀法:

Step3:cDNA文库的合成

样品准备:浓缩poly A+ mRNA,使其浓度不要少于333 ng/μl,以下操作每50μl的反应中至少需要4μg mRNA(不多于12μl)

cDNA合成:

第一条链的合成:

1.取经过处理的无RNase的1.5mL EP (Eppendorf)管,加入以下组分:

4 μg poly A+ RNA sample,

1 μg Hind III Random Primers

x μl Nuclease-free Water

20 μl Total volume

2.混合均匀,70℃加热10min。

3.快速置于冰上,3min。

4.短暂离心,使混合物保留在管底。

5.在以上的EP管中继续加入:

10 μl 5X First Strand Buffer (5X = 250 mM Tris-HCl pH 8.3 at 25°C, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)

5 μl 100 mM DTT

2.5μl Methylation dNTP Mix

X (8.5)μl Nuclease-free Water

50 μl Total volume(包括MMLV,在第7步加)

6.轻轻混匀,37°C平衡1min。

7.加800 units (4μl)MMLV-RT,轻轻混匀,37℃平衡60min(可选择的)。

8.70℃加热10 min,置于冰上3 min,短暂离心,使内容物保留在管底。

第二条链的合成

1.在冰上加入以下试剂至第一条链反应物中(45 or 50 μl)

50μL第一链cDNA

50 μl 5X Second Strand Buffer (5X = 200 mM Tris-HCl, pH 7.5 at25°C, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl)

6 μl 100 mM DTT

2 μl 10xMethylation dNTP Mix

(0.5 μl (可选择) ~5 μCi [a-32P]dA TP (> 400 Ci/mmol) to measure second strand conversion)

x μl Nuclease-free Water

(5μl)(50 units) DNA polymerase I

(1.6μl) (1.6 units) RNase H

250 μl Total volume

2.轻轻混匀,15°C温育90min。

3.加250μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),涡旋振荡30s,12000g,4℃,;离心1min。

4.取上清于一新1.5mL中,加1μL肝糖,250μL4M醋酸胺,300μL异丙醇,颠倒数次混匀。

5.室温孵育5min。12000g,4℃,10min。

6.去上清,0.5ml 70%乙醇漂洗沉淀,0.5ml无水乙醇重复漂洗,每次漂洗后离心3min。沉淀干燥后溶于20μL TE.

7.检测浓度,量应该与mRNA的输入量一样。保存于-20℃进行末端修饰。

末端修饰

1.设计以下反应体系:

20 μl 双链cDNA

3 μl 10X Flush Buffer

1.5 μl 100 mM DTT

3 μl 1mM dNTPs(用10mM dNTP Mix和Nuclease-free Water按1:10稀释)

1.5 U(0.6μl) T4 DNA Polymerase

x μl Nuclease-free Water

30 μl Total volume

2.轻轻混匀,11℃温育20min。

3.加20μl TE,50μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),涡旋振荡30s,12000g,4℃,离心1min。

4.取上清于新1.5mL中,加50μL氯仿:异戊醇(24:1),涡旋振荡30s,12000g,4℃,离心1min。

5.取上清于新1.5mL中,加1μL肝糖,50μL4M醋酸胺,250μL异丙醇,颠倒混匀。

6.-20℃静置至少1h。

7.12000g,4℃,离心10min,去上清,0.5ml70%乙醇漂洗沉淀,0.5ml无水乙醇重复漂洗,干燥后溶于10μLTE.保存在-20℃。

Step4:EcoR1/HindIII接头连接

接头在使用前需用T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化;

1. 10 μl blunt-ended cDNA in TE

2 μl 10X Ligation Buffer (10X = 200 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM MgCl2,,240 μg/ml BSA)

2 μl 1 mM A TP (final conc. is 0.1 mM, which is recommended for blunt end ligation; make a fresh 1:10 dilution of 10 mM A TP in Nuclease-free Water provided with the DNA Ligation Kit)

2 μl 100 mM DTT

2 μl (100 pmol) Directional EcoR I/Hind III Linkers

X(0.5μl ) (5 U) T4 Polynucleotide Kinase

y μl Nuclease-free Water (if needed)

20 μl Total volume (包括在下面第三步加的连接酶)

2. 37℃温育5min。

3. 将EP管置于冰上,加入6~8Weiss Units T4 DNA ligase,16℃连接过夜。

接头消化

1.将连接产物于70℃,10 min,终止连接反应,然后缓慢降至室温。

2.加入以下反应体系:

10 μl 10X Hind III Buffer

x μl Nuclease-free Water

y μl (100U) Hind III

100 μl Total volume

3.混匀体系,37℃温育2h。

4.在上述体系中再加入:

10 μl 10X EcoR I Adjustment Buffer

100 U EcoR I

5. 37℃温育4h。

6. 用等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提蛋白,取上清于新1.5mLEP管中,然后立刻进行片段大小分离。(或者)

Step5:Size Fractionation(cDNA大小片段的分离)

按Mini Column Fractionation Kit操作说明进行。

①轻轻上下颠倒混匀瓶中的凝胶过滤树脂溶液,直至凝胶过滤树脂充分悬浮。吸取悬浮液到Mini Column中(lml的床柱体积大概需要2ml的悬浮液),进行装柱。(用Parafilm把液体轻轻推到柱的顶部,依靠重力使树脂压紧。)

②当悬浮液中的液体下降到柱床的顶部时,用lml lx柱缓冲液平衡柱子,连续5次。

③当柱缓冲液下降到柱床的顶部时,将上述中所提取的cDNA溶液加入到柱子中。(如果在这步之前,cDNA是沉淀的,在室温离心10min,弃掉上清,然后用70%的乙醇和100%乙醇分别洗涤沉淀一次,晾干,100μl TE重溶,将全部样品加到柱子中)

④当DNA进入到树脂中后,轻轻加入200μl 1x柱缓冲液(不要搅动胶的表面),让缓冲液充分流过树脂。

⑤加250μl 1x柱缓冲液,开始收集流出的液体。(这是1ml柱子的空隙部分,代表cDNA的最大片段)

⑥加1μl 10mg/ml糖原和150μl异丙醇到⑤中的收集液中(不需要加盐,柱缓冲液中已经包括盐),剧烈震荡混匀后室温放置5min。

⑦12000g离心10min,去除上清,用0.5ml 70%乙醇和0.5ml 100%乙醇分别洗涤沉淀l次,12000rpm,3min。

⑧去掉乙醇后,沉淀室温干燥后,加入20μl TE溶液,充分溶解后-20℃保存。

Step6:cDNA与T7载体连接

Ligation of Inserts and Vector Arms

1.根据T7DNA和cDNA片段所测OD值估算摩尔浓度,设计链接体系:

0–1.5 μl insert (cDNA from size fractionation, 60ng;0.02-0.06 pmol) 1μl Positive Control Insert, or no insert negative control)

1 μl T7Select? Vector Arm s (0.5 μg; 0.0

2 pmol)

0.5 μl 10X Ligase Buffer

0.5 μl 10 mM ATP (note final concentration is 1 mM, which is recommended for sticky end ligation)

0.5 μl 100 mM DTT

0 - 1.5 μl Sterile water

1 μl (0.4–0.6 Weiss units) T4 DNA Ligase (if necessary dilute enzyme 1:10 in Ligase Dilution Buffer provided with DNA Ligation Kit)

5 μl Total volume

2. 轻轻吹吸混匀,短暂离心,使反应在管底进行,16℃过夜,4℃保存。

Step7:In Vitro Packaging

1.使T7Select? Packaging Extract在冰上解冻。25μl的包装蛋白能包装1μg以上的连接产物。

2.在25μl的包装蛋白中加入5μl的连接产物,用枪轻轻混匀,不要涡旋震荡。(试剂盒中有T7Select Packaging Control DNA,是为了检测包装效率,25μl的包装蛋白中加入0.5μg 的对照DNA)

3.反应混合物在22°C温育2h。

4.加入270μl灭菌的LB或TB终止反应。进行噬菌斑实验确定重组子的数量。如果包装产物在24h以内不扩增,应加入20μl氯仿,轻轻颠倒混匀保存。可以在4度保存一周以上滴度降低不明显。

5.如果要长时间保存,包装的噬菌体必须通过平板法或液体法进行扩增。扩增的T7文库可用于生物淘洗。

Step8:文库的鉴定

1.原文库滴度测定

2.PCR鉴定文库插入片段分布情况及重组率

从原始包装文库滴度测定平板上随机挑取50个噬菌斑进行PCR鉴定

1)用灭菌牙签从平板上挑取一部分噬菌斑分别加入到含有100μl 10mM EDTA的EP管中。2)短暂震荡后,65℃热击10min。

3)冷却至室温后,14000g离心3min,取1-2μl上清作为模板。

4)在0.2ml离心管中加入以下反应体系

1-2μl Phage lysate

5μl 10×NovaTaq Buffer with MgCl2

1μl T7SelectU P Primer (5 pmol/μL)

1μl T7SelectDOWN Primer (5 pmol/μL)

1μl dNTP mix (10 mM each: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

1.25U NovaTaq DNA polymerase (Cat. No. 71003-3)

to 50μl deionized water

5)(在加入NovaTaq DNA polymerase之前先80℃预热5min,再进行PCR反应,)反应条件如下:

(94℃预变性3min) 94℃50s,50℃1min,72℃1min,35个循环后,72℃6min,4℃pause。6)每管取10-25μl进行1%琼脂糖电泳检测。

3.文库扩增

4.扩增后滴度测定