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慢性乙型肝炎患者外周血Th17细胞检测及临床意义

文章编号：1673-8640（2014）01-0015-06中图分类号：Ｒ446．63文献标志码：A DOI：10．3969/j．issn．1673-8640．2014．01．004慢性乙型肝炎患者外周血Th17细胞比例和

IL-17表达水平的临床意义

丁庆莉，唐古生，贺铮雯，沈茜，秦阳华

（第二军医大学附属长海医院实验诊断科，上海200433）

摘要：目的分析临床不同疾病程度慢性乙型肝炎（CHB）患者和正常对照者外周血辅助性T细胞17（Th17）的比例和其效应分子白细胞介素17（IL-17）水平的变化与疾病严重程度、乙型肝炎病毒（HBV）DNA载量、肝脏损伤标志物等的关系，以进一步证实Th17细胞在CHB患者疾病进程中的作用。方法应用流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链反应（PCＲ）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等检测93例CHB患者（其中轻度21例、中度37例、重度35例）和28名正常对照者外周血Th17细胞比例、血清IL-17水平，纯化CD4+T细胞经功能性抗CD3、抗CD28抗体刺激后IL-17和维甲酸相关孤儿核受体C（ＲOＲC）mＲNA表达水平，纯化CD4+T细胞刺激后培养液中IL-17水平。比较和分析上述检测数据在各组间的统计学差异及与HBV DNA载量、肝脏损伤标志物等的关系。结果与正常对照组相比，CHB组外周血Th17细胞比例明显升高，且随着疾病的加重，Th17细胞的比例也随之上升。CHB重度组Th17细胞比例、IL-17和ＲOＲC mＲNA表达水平显著高于中度组、轻度组和正常对照组（P＜0．05），各组间血清IL-17水平差异无统计学意义（P＞0．05）；CHB组纯化CD4+T细胞刺激后培养液中IL-17水平显著高于正常对照组（P＜0．05）；CHB重度组培养液IL-17水平明显高于中度组和轻度组（P＜0．05）。CHB组外周血Th17细胞比例与血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平呈明显正相关（P＜0．01），而与血清HBV DNA载量无相关性。结论CHB患者体内增高的Th17细胞可能是造成肝脏炎症、肝细胞损伤的主要原因之一，并与CHB的重症化密切相关。

关键词：辅助性T细胞17；白细胞介素17；肝功能；慢性乙型肝炎

The proportion of Th17cells and IL-17expression levels in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B and their clinical significance DING Qingli，TANG Gusheng，HE Zhengwen，SHEN Qian，QIN Yanghua．（Department of Laboratory Diagnosis，Changhai Hospital，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China）

Abstract：Objective To analyze T helper17（Th17）cell proportion and interleukin17（IL-17）levels in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B（CHB）and healthy controls，and to evaluate their correlations with disease severity，serum hepatitis B virus（HBV）DNA load and liver injury markers，in order to investigate Th17cells' role in the pathogenesis of CHB．Methods The Th17cell proportion and IL-17levels in peripheral blood of93CHB patients（the mild，moderate and severe CHB patients had21，37and35cases，respectively）and28healthy controls were determined by flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）．The mＲNA expression levels of IL-17andＲAＲ-related orphan nuclear receptor C（ＲOＲC）of purified CD4+T cells after stimulating with anti-CD3and anti-CD28antibodies were analyzed by real-time fluorescence polymerase chain reaction（PCＲ）．The IL-17levels in the supernatant of purified CD4+T cells after stimulating with anti-CD3and anti-CD28antibodies were evaluated by ELISA．The data were analyzed statistically，and their relations with serum HBV DNA load，liver injury markers，and so on were analyzed．Ｒesults Compared with those of healthy control group，the proportion of Th17cells in peripheral blood of CHB group was significantly higher，and increased with disease severity．The Th17cell proportion，IL-17levels and ＲOＲC mＲNA levels in severe CHB group were significantly higher than those in moderate and mild CHB groups and healthy control group（P＜0．05）．There was no statistical significance in serum IL-17levels among the groups（P＞0．05）．The IL-17levels in the supernatant of purified CD4+T cells after stimulating with anti-CD3and anti-CD28 antibodies from CHB group were significantly higher than those from healthy control group（P＜0．05），and the IL-17

作者简介：丁庆莉，女，1982年生，硕士，主管技师，主要从事临床检验工作。

通讯作者：秦阳华，联系电话：021-********。

levels in the supernatant from severe CHB group were higher than those from moderate and mild groups（P＜0．05）．The Th17cell proportion in peripheral blood of CHB group showed a positive correlation with serum alanine aminotransferase （ALT）level（P＜0．01），and showed no correlation with serum HBV DNA load．Conclusions The increased Th17 cell proportion in CHB patients may be the one of the factors for liver inflammatory response and liver injury and cause the progression of CHB．

Key words：T helper17cell；Interleukin17；Liver function；Chronic hepatitis B

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的乙型病毒性肝炎是我国发病率较高的疾病。在感染HBV的大部分成年人中，表现为一种急性、自限性的肝脏炎症，病毒负荷的急剧下降，长久的保护性体液和细胞免疫，但在另一部分受染的成年人和大多数经垂直传播而致病的患者中，持续的病毒感染会最终导致慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）［1］。然而HBV在机体持续性感染致慢性肝炎发生的病理机制尚未完全阐明。HBV是一种非细胞毒性病毒，当其进入机体后常引起一系列复杂的免疫反应，而机体产生的免疫应答的强弱又与HBV感染所致的不同临床结果密切相关。在这一系列免疫应答中，细胞免疫应答是决定HBV感染机体后转归的最重要因素。辅助性T细胞17（T helper cell17，Th17）是近几年发现的辅助性T细胞（CD4+T细胞）新的功能亚群，主要通过分泌大量的白细胞介素17（interleukin17，IL-17）来发挥生物学效应。目前已证实Th17细胞是急性或慢性炎症环境中重要的效应细胞，在自身免疫性疾病、炎症反应、肿瘤等的发生、发展中均发挥着重要的作用。至今，有关Th17细胞与HBV致肝脏慢性免疫性炎症关系的研究在国内外已见少量报道［2-3］，研究结果均提示Th17细胞可能在病毒性肝炎慢性化过程中具有重要作用。基于上述原因，本研究拟对临床不同疾病程度CHB患者和健康人外周血Th17细胞及其效应分子IL-17的水平进行检测，分析这些变化与患者HBV DNA载量、肝脏损伤标志物等的关系，旨在进一步证实Th17细胞在CHB慢性免疫炎症损伤过程中的作用。

材料和方法

一、研究对象

随机选取2007至2008年在长海医院感染科住院或门诊治疗的93例CHB患者，男68例，女25例，平均年龄（43?15）岁，其中轻度21例、中度37例、重度35例，诊断依据2005年修订的“慢性乙型肝炎防治指南”标准［4］。所有患者没有并发丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人类免疫缺陷病毒感染和自身免疫性肝炎。28名健康者均为长海医院健康体检者，其中男17名，女11名，平均年龄（29?8）岁，无心、肝、肾等器质性疾病，亦无乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人类免疫缺陷病毒感染和自身免疫性疾病。本研究经长海医院医学伦理委员会批准，每位受试对象都签署了知情同意书。

二、标本采集

采集CHB患者血液标本时，有17例接受了核苷类抗病毒治疗，11例未接受任何治疗，其余均仅接受保肝降酶治疗，均未接受甾体类药物治疗。以无菌方式采集各试验对象晨起空腹静脉血，乙二胺四乙酸抗凝血5mL用于流式细胞仪检测细胞成分分离；不抗凝血5mL，血清用于检测肝功能、HBV DNA、IL-17等。

三、外周血Th17细胞和辅助性T细胞（T helper cell1，Th1）细胞的流式细胞仪检测

取乙二胺四乙酸抗凝血100μL，用100μL 含10%小牛血清的ＲPMI-1640培养液（Gibco公司）混合后接种于96孔培养板（Costar公司），同时加入终浓度为50ng/mL的佛波醇酯（Sigma公司）、1μg/mL离子霉素（Sigma公司）和1μL/mL 布雷菲德菌素A（Becton Dickinson公司）。在37?、5%CO

培养箱刺激培养5h。收集体外刺激活化的外周血，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤2次。加入5μL异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-抗人CD4（eBioscience公司），室温避光温育30min。加入1mL红细胞裂解液（BD公司）室温作用10min，洗涤。加入固定穿膜剂500μL（eBioscience 公司），室温作用1h，洗涤。分别加入5μL藻红蛋白（phycoerythin，PE）-抗人IL-17（eBioscience 公司）、5μL别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）-抗人γ干扰素（interferon-gamma，IFN-γ，eBio-science公司）和同型对照抗体，室温作用30min，

洗涤后立即用FACSCalibur 流式细胞仪（BD 公

司）检测。以CD4+

T 细胞设门，至少计数20000

个细胞，以CellQuest 软件分别IL-17和IFN-γ表

达阳性细胞占CD4+

T 细胞的比例。

四、外周血CD4+

T 细胞的分离和刺激培养采用无柱免疫磁珠细胞分选外周血CD4+

细

胞，试剂盒为ＲosetteSep （加拿大STEMCELL 公司），方法为抗体标记和免疫密度离心负筛选法，

具体步骤：取5mL 抗凝全血，加250μL CD4+T

细胞富集试剂后混匀，室温作用20min ，用等量PBS 进行稀释并混匀。在另一试管内加入适量淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技公司），将处理好的标本沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。置水平离心机中，

400?g 离心20min 。用滴管直接吸出CD4+

T 细胞层，加入4倍量以上

的Hank ’s 液，充分混匀，300?g 离心10min 。用含10%小牛血清的ＲPMI 1640培养液配制细胞

悬液，将细胞悬液调整到106

/mL 。取样经FITC-

抗人CD4抗体染色后流式细胞仪检测纯度，代表性结果见图1，纯度＞95%进行下一步试验。按100μL 2?105/孔的细胞接种96孔培养板，同时加入终浓度为1μg /mL CD3和2μg /mL CD28功能性抗体（eBioscience 公司），

37?、5%CO 2孵箱刺激培养5h 进行细胞总ＲNA 抽提，培养72h 收集上清液进行酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoserbent assay ，ELISA ）检测

。

图1

外周血分选CD4+

T 细胞经抗CD4-

FITC 抗体标记后流式细胞术检测结果

五、血清和培养上清液IL-17水平的检测采用ELISA 检测，试剂盒购于eBioscience 公司，操作严格按试剂盒说明书进行。

六、血清HBV DNA 和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase ，ALT ）的检测

采用荧光实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCＲ）检测患者血清HBV DNA 水平，试剂盒购自深圳匹基生物工程公司。采用速率法检测血清ALT ，

试剂盒购于科华生物工程公司，仪器为日立7600型全自动生化分析仪。

七、实时荧光定量PCＲ检测IL-17和维甲酸相关孤儿核受体（ＲAＲ-related orphan nuclear re-ceptor C ，ＲOＲC ）mＲNA 表达

取1?106个经刺激或未刺激CD4+

T 细胞，

用Trizol 试剂（Invitrogen 公司）抽提细胞总ＲNA ，

逆转录采用TaKaＲa PrimeScript TM

ＲT 试剂盒

（TaKaＲa 公司）进行。再使用SYBＲ Prime-Script TM ＲT-PCＲ试剂盒（TaKaＲa 公司）于Light-Cycler 定量PCＲ仪（Ｒoche 公司）进行实时荧光定量PCＲ。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH ）mＲNA 表达量为内参照，根据待检基因和内参照基因扩增的

循环数Ct 值，

按照公式相对值=2-ΔΔCT

计算出标本中待检基因相对于内参照基因的相对含量。引物序列采用Primer Premier 5．0软件设计，IL-17上、下游引物序列：F-TGTCCACCATGTGGCCTAA-GAG ；Ｒ-GTCCGAAATGAGGCTGTCTTTGA 。ＲOＲC 上、下游引物序列：F-ACCTCACCGAGGCCAT-TCAG ；Ｒ-TAGGCCCGGCACATCCTAAC 。GAPDH 上、下游引物序列：F-GCACCGTCAAGGCTGAG-AAC ；Ｒ-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT 。八、统计学方法

采用SPSS 17．0软件包进行分析。结果以珋x ?s 表示，各检测指标间的比较采用非参数Kruskal-Wallis U rank sum test 进行分析，指标间相关性采用Kendals tau-b 进行分析，P ＜0．05为差异有统计学意义。

结

果

一、CHB 患者外周血Th17细胞比例

与正常对照组［（0．62?0．58）%］相比，

CHB 患者外周血CD4+IFN-γ－

IL-

17+T 细胞（Th17细胞）的比例［

（1．89?1．46）%］明显升高（P ＜0．05）。随着疾病的加重，Th17细胞的比例也随之上升。重度组、中度组和轻度组外周血Th17细胞的比例分别为（2．75?2．89）%、

（1．75?

1．58）%和（1．24?0．98）%，重度组Th17细胞的比例显著高于中度组、轻度组和正常对照组（P ＜0．05），见图2、图3（a ）。CHB 中度组Th17细胞的比例也显著高于正常对照组（P ＜0．05）。然而，中度组Th17细胞的比例与轻度组、轻度组与正常对照组间差异均无统计学意义（P ＞0．05）。

同时，本研究还观察了CHB 患者外周血CD4+IFN-γ+IL-

17－T 细胞（Th1细胞）的比例变化及与疾病严重度的关系。结果显示，各组间Th1细胞

占CD4+

T 细胞的比例差异无统计学意义（P ＞

0．05）。见图2、图3（b ）。

注：图中右上角的数字代表其所占CD4+T 细胞的比例（为一次试验的代表图）

图2流式细胞术检测不同疾病程度CHB 患者和

正常对照组外周血Th17细胞和Th1

细胞的比例

注：CD4+IFN-γ－IL-17+T 细胞为Th17细胞；CD4+IFN-γ+

IL-17－细胞为Th1细胞；（a ）各组Th17细胞比例比较，*P ＜0．05；（b ）各组Th1细胞比例比较

图3不同疾病程度CHB 患者与

正常对照组外周血Th17细胞和Th1细胞的比例变化

二、

CHB 患者外周血纯化CD4+T 细胞IL-17和核转录因子ＲOＲC mＲNA 表达水平的变化

未经刺激的CD4+

T 细胞IL-

17和ＲOＲC mＲNA 表达水平各组间差异无统计学意义。然而，

CD4+T 细胞经抗CD3和抗CD28单抗刺激后，

CHB 重度组IL-17和ＲOＲC mＲNA 表达水平明显高于轻度组和正常对照组（P ＜0．05），且IL-17mＲNA 表达在中度组与正常对照组间也存在差异，

但CHB 重度组与中度组之间、轻度组与正常对照组之间的差异无统计学意义（P ＞0．05），见图4。

三、CHB 患者血清和CD4+T 细胞培养液IL-17水平的变化

各组间IL-17水平差异无统计学意义（P ＞0．05），见图5（a ）。随后，测定经纯化的CD4+T 细胞刺激后的培养液的IL-17水平。与正常对照组相比，

CHB 患者CD4+T 细胞刺激后的培养液中IL-17水平显著升高（P ＜0．05）；且随疾病严重程度的增加，

IL-17的表达水平亦随之增加。CHB 重度组CD4+

T 细胞刺激后的培养液中

IL-17的水平为（4535．69?1857．31）pg /mL ，明显高于中度组［

（2472．01?1139．43）pg /mL ］、轻度组［

（1664．38?468．20）pg /mL ］和正常对照组［

（1421．17?471．16）pg /mL ］（P ＜0．05），见图5（b ）。虽然CHB 中度组IL-17水平稍高于轻度组和正常对照组，但差异无统计学意义（P ＞

0．05）；轻度组和正常对照组之间也无差异（P ＞0．05）。

注：（a ）各组ＲOＲC mＲNA 表达水平的比较；（b ）各组IL-17mＲNA 表达水平的比较；*P ＜0．05

图4

不同疾病程度CHB 患者和正常对照组外周血

纯化CD4+

T 细胞经功能性抗CD3和抗CD28单克隆抗体

刺激后IL-

17和ＲOＲC mＲNA

的表达水平注：（a ）血清；（b ）培养上清液；*P ＜0．05

图5不同疾病程度CHB 患者与正常对照组血清和

外周血纯化CD4+

T 细胞经功能性抗CD3和抗CD28单克

隆抗体刺激72h 后培养液的IL-

17表达水平

四、CHB 患者外周血Th17比例与肝脏损伤的关系

CHB 患者外周血Th17细胞比例与血清ALT 水平呈明显正相关（P ＜0．01），见图6（a ），与血清HBV DNA 载量无相关性（P ＞0．05），见图6（b ）

。

注：（a ）Th17细胞比例与ALT 的相关性分析；（b ）Th17细胞比例与HBV DNA 载量的相关性分析

图6CHB 患者外周血Th17细胞与

血清ALT 水平及HBV DNA 载量的相关性分析

讨论

肝脏慢性炎症及继发性纤维化是CHB 的特

征。既往认为CHB 患者机体清除病毒能力降低，致使HBV 可在体内持续存在，导致HBV 感染慢性化的免疫机制与Th1和Th2免疫应答失调有关。CHB 患者体内的Th1细胞及其免疫应答降

低，

IFN-γ和IL-2等细胞因子减少，造成Th1/Th2细胞比例失衡，直接影响了细胞毒性T 淋巴细胞

（cytotoxic T lymphocyte ，CTL ）、自然杀伤（natural killer ，NK ）细胞和B 细胞功能的正常发挥。本研究发现CHB 组外周血Th1细胞比例与正常对照组无明显差异，且与疾病的严重程度也无关系，表明HBV 感染慢性化不是单一因素作用的结果，还存在其他的免疫机制。近来，大量的研究已证实Th17细胞参与了多种肝脏疾病的发生机制，在酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝

硬化等疾病中，

Th17细胞发挥了诱导固有免疫应答、中性粒细胞趋化激活、产生炎症反应等作用，在对肝脏的损伤及疾病的进展中也均起到重要作

用［5-6］

。同时，有文献报道Th17细胞不仅可以上调抗凋亡分子，促进被病毒感染的细胞存活，而且

可以抑制CTL 对靶细胞的破坏，延长病毒持续感染的时间

［7］

。

有关CHB 疾病过程中Th17细胞的变化、与

疾病的关系等研究国内外已有一些报道，但试验结果却不尽一致。杨波等

［8］

发现，

CHB 组和HBV 相关慢加急性肝功能衰竭（acute-on-chronic liver failure ，

ACLF ）组患者外周血Th17细胞频率均显著高于健康对照组，

ACLF 组又显著高于CHB 组患者。ACLF 患者外周血Th17细胞频率与国际

标准化比值和终末期肝病模型评分均呈正相关，而CHB 患者外周血Th17细胞频率与ALT 水平

呈正相关，

与HBV DNA 载量无关。Qi 等［9］

的研究也得到相似的结果，

ACLF 患者外周血Th17细胞频率和ＲOＲC mＲNA 表达水平显著高于CHB

组，而CHB 组则显著高于健康对照组。然而，Zhang 等［10］发现CHB 患者外周血增加的Th17细胞频率与ALT 水平及HBV DNA 载量均呈正相关。林振忠等

［11］

也发现CHB 患者Th17细胞的

频数明显高于健康对照组，

但与总胆红素、直接胆红素和ALT 无相关性。本研究结果显示CHB 患

者外周血Th17细胞比例明显高于正常对照组，且随着疾病的加重，

Th17细胞的比例也随之上升，表现为重度组Th17细胞比例明显高于中度组、轻度组和正常对照组，

中度组Th17细胞比例也显著高于正常对照组。为了进一步明确CHB 患者外

周血Th17细胞比例的检测结果，

我们还对Th17细胞分化特异性核转录因子ＲOＲC mＲNA 的表达

水平进行了检测，所获的结果完全佐证上述发现。升高的Th17细胞比例是否与肝脏损伤存在一定的关联？我们发现CHB 患者外周血Th17细胞的比例与血清ALT 水平呈明显正相关，而与血清

HBV DNA 载量无相关性，这与杨波等［8］

的报道完全一致。Ye 等

［12］

已证实，

CHB 患者肝内Th17细胞数量与肝脏炎症活动度呈正相关，该报道也是对本研究结果的有力支持。各文献报道结果有差异，原因可能与CHB 患者病例的入选条件不同有一定关系。在本研究和杨波等的报道中均将CHB 按疾病严重程度进行分组，其中重度组的病

例数均﹥30例；而在林振忠等［11］

的报道中均为CHB 病例，如均为轻度患者，就较难观察到外周

血Th17细胞比例与ALT 变化的关联性。

IL-17是Th17细胞分泌的特征性炎性细胞因子，具有广泛的细胞靶点，可诱导其他炎性细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，参与中性

粒细胞趋化，引起炎性细胞浸润和组织损伤

［5，13］

。国内外文献报道，CHB 、肝硬化、原发性肝癌和慢

性肝功能衰竭患者血清IL-17和外周血单个核细胞IL-17mＲNA 水平均比正常对照显著升高，在CHB 和肝硬化患者的肝组织中IL-17的表达也明

显增多［8，10-12，14］

。然而，这些结果并未获得一致的

支持，一些研究发现CHB患者血清IL-17水平与正常对照者比较无明显差异［15-16］。本研究结果也显示CHB患者血清IL-17水平与正常对照者比较无明显差异。但分析试验对象纯化CD4+T 细胞刺激后的培养液时发现，CHB患者CD4+T 细胞刺激后的培养液中IL-17的水平明显高于正常对照者，且随疾病严重程度的增加而增高。试验对象纯化CD4+T细胞经功能性抗CD3和抗CD28单克隆抗体模拟T细胞抗原受体激活CD4+T细胞时，CHB尤其是CHB重度和中度组患者CD4+T细胞趋向于分化更多的Th17细胞，致培养液中IL-17的水平高于正常对照组和CHB 轻度组。关于CHB患者血清中IL-17检测结果的差异，我们认为可能与Th17细胞在血循环中所占比例甚少，及CHB患者多存在T细胞免疫功能抑制有关。

综上所述，本研究的结果提示CHB患者体内增高的Th17细胞可能是造成肝脏炎症、促进肝细胞损伤的主要原因之一，并与CHB的重症化密切相关。调节性T细胞从CD4+T细胞分化而来，在分化中所需的部分细胞因子与Th17细胞比较类似，然而生物学功能却存在一定的拮抗。若能增加未治疗患者病例数，按治疗与否和不同治疗方案分组，并做治疗前后相关指标的比较，则可分析不同治疗方案对相关指标的影响，以期探讨可用于评价治疗效果的指标。如果在本研究中能够同时分析调节性T细胞的比例及相关转录因子、效应分子等的变化，将有助于更全面地了解CHB患者的机体免疫状态。外周血Th17细胞比例升高可否作为CHB患者疾病进展的标记？Th17细胞是否可成为治疗CHB的一个新靶点？哪些因素驱动或参与了CHB患者Th17细胞的分化？这些问题均有待于进一步探索。

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（收稿日期：2013-07-30）

（本文编辑：姜敏）

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量控制 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

流式细胞仪检测技术与质量控制【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在

三分类血液细胞分析仪与五分类区别

三分类血液细胞分析仪与五分类区别 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012

三分类血液细胞分析仪与五分类区别血液细胞分析仪又名血细胞分析仪，目前市场上的血细胞分析仪主要分为全自动的和半自动的仪器。随着该仪器成为医院临床检验的必备仪器以及近几年来计算机技术的不断发展，产品也从三分群转向五分群，从二维空间转向三维空间，对于三分类血液细胞分析仪与五分类仪器有何区别呢？ 1、仪器检测原理的区别三分类的仪器大都采用电阻抗检测技术，由信号发生器、放大器、甄别器、阀值调节器、检测计数系统和自动补偿装置组成；五分类的产品大都采用光散射检测技术，主要由激光源（多采用氩离子激光器，以提供单色光）、检测区（主要由鞘流形式的装置构成，以保证细胞混悬液在检测液流中形成单个排列的细胞流）、检测器（散射光检测器系光电二极管，用以收集激光照射细胞后产生的散射光信号；荧光检测器系光电倍增管，用以接受激光照射荧光染色后细胞产生的荧光信号）。 2、白细胞分类方法的区别三分类产品是将白细胞分为淋巴细胞，单核细胞，粒细胞；五分类的仪器则是将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞（中性细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞）。 3、适用客户的区别三分类血液细胞分析仪主要适用于三甲以下的医院、妇幼保健院、诊所以及社区服务中心等，价格相对要便宜很多；而五分类的产品主要用于三甲以上的医院，价格以及试剂方面要贵很多。随着当前临床检测的需要，各种血液细胞分析仪不断涌现，小编个人认为产品没有好坏之分，主要是选择合适自己的，客户可根据临床检测样本量的多少以及检测标准来选择

血液细胞分析仪各项分析参数的临床意义 (生物学)

血液细胞分析仪各项分析参数的临床意义血液细胞分析仪各项分析参数的临床意义--血常规--血细胞分析 (一)红细胞分析参数的临床意义 1.定义及参考值范围 (1)红细胞数量(red blood cells，RBC) (2)血红蛋白浓度(hemoglobin，HGB，Hb) (3)红细胞比积(hematocrit，HCT) (4)平均红细胞体积(mean corpuscular volume，MCV) (5)平均红细胞血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH) (6)平均红细跑血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration.MCHC) 以上各参数的定义参看红细胞一般检查。 (7)红细胞体积分布宽度(RBC volume distribution width，RDW)是定量反映红细胞体积异质性的参数，以所测红细跑体积大小的变异系数表示。 2.临床意义 (1)RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC各项的I陆床意义见红细胞一般检查。 (2)RDW ①用于缺铁性贫血的诊断和疗效观察，缺铁性贫血时RDW值增大，当给以铁剂治疗有效时RDW值一过性进一步增大，随后逐渐降到正常。 ②对小细胞低色索性贫血的鉴别诊断.缺铁性贫血时RDW值增大而轻型海洋性贫血时RDW值正常。 ③用于对贫血的分类(Bassman MCV/RDW分类法)，根据MCV、RDW值变化共分为六种类型贫血。 A.小细胞均一性贫血：WCV减小，RDW正常，如轻型海洋性贫血。 B.小细胞不均一性贫血：WCV减小，RDW增大，如缺铁性贫血。 C.正细胞均一性贫血：WCV、RDW均正常，如慢性病所致贫血。 D.正细胞不均一性贫血：WCV正常，RDW增大，如早期缺铁性、营养性贫血。 E.大细胞均一性贫血：MCV增大，RDW正常，如再生障碍性贫血。 F.大细胞不均一性贫血WCV、RDW均增大，如巨幼细胞性贫血。 (二)白细胞分析参数的临床意义 1.定义及参考值范围 (1)白细胞数量(white blood cells，WBC) (2)白细胞分类计数.根据溶血剂处理后皱缩白细胞体积的大小分为三类细胞，coulter JT3型血液细胞分析仪将35～90fl大小的定义为淋巴细胞(lymphocytes，Lym)，91～160fl大小的定义为中间细胞(middle cells，Mid.)，161～450fl大小的定义为粒细胞(granulocytes，Gran.)，不同仪器对细胞大小

三分类血液细胞分析仪与五分类区别

全自动五分类血细胞分析仪技术参数及规格要求

全自动五分类血细胞分析仪技术参数及规格要求 1、测试参数：不少于31项，可提供23项基本参数WBC、LYMPH%、LYMPH#、NEUT%、NEUT#、 MONO%、MONO#、EO%、EO#、BASO%、BASO#、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW-CV、RDW-SD、PLT、PDW、MPV、PCT及四项研究参数ALY%、ALY#、LIC%、LIC%(异淋和巨大未成熟细胞检测)和WBC/BASO散点图、4DIFF散点图、RBC直方图、PLT直方图。 △2、测量原理：WBC五分类双通道检测，采用半导体激光散射、细胞化学染色检测；无氰溶血剂测HGB。 △3、操作软件：全中文操作，无需外配电脑主机即可实现中文输入。 △4、样本模式：静脉全血、预稀释末梢血；样本量：静脉全血≤200ul，预稀释末梢血≤40ul 。△5、测试速度：不少于80样本/小时；配自动进样器，每次可装载40份标本以上。 △6、工作模式：全自动进样和手动进样兼备，并配有内置稀释器，末梢血预稀释模式无需手工加入稀释液，可用预稀释末梢血模式实现WBC五分类，并有急诊样本优先检测功能。 △7、分析模式：全血CBC模式，全血CBC+5DIFF模式；预稀释末梢血CBC，预稀释末梢血CBC+5DIFF模式。 △8、显示屏：彩色大屏幕TFT全中文触摸屏。 △9、资料储存：不外接电脑，主机可储存不少于40000份的样本完整结果，包括所有中文信息和全部散点图及直方图。 10、定量系统才有陶瓷分血阀装置，并且具备分血阀自动维护程序。 11、试剂：可提供原厂配套试剂，具备试剂预加温功能。 12、数据输出：具备USB接口和网络接口，可支持USB接口打印机、支持101标准键盘、支持外接条码扫描仪，具备联网功能，可支持激光、喷墨、针式等多种打印机。 13、报告单格式：测量结果必须中文打印，多种报告格式可选。 △14、售后服务：本省有仪器厂家设立的售后服务中心和零配件中心，并有多名专业维修工程师提供服务，实现365天24小时全天候售后服务。 15、运行环境：电压：宽电源设计（100-240V），湿度：10%-90%，温度：10℃-40℃。注：带“△”为重要技术参数。

血常规的分析及临床意义

血常规锁定血常规是指通过观察血细胞的数量变化及形态分布从而判断血液状况及疾病的检查，随着检验现代化、自动化的发展，现在的血常规检验是由机器检测完成的。血常规检查包括有红细胞计数（RBC）、血红蛋白（Hb）、白细胞（WBC）、白细胞分类计数及血小板（PLT）等，通常可分为三大系统，即红细胞系统、白细胞系统和血小板系统。血常规中的许多项具体指标都是一些常用的敏感指标，对机体内许多病理改变都有敏感反映，其中又以白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和血小板最具有诊断参考价值，许多患者在病因不明时可以做血常规检查对其进行辅助诊断。此外，血常规检查还是观察治疗效果、用药或停药、继续治疗或停止治疗、疾病复发或痊愈的常用指标。常用指标及临床意义 1.红细胞计数（RBC）是指单位体积血液中所含的红细胞数目。【正常参考范围】新生儿：（6.0～7.0）×1012/L 婴儿：（5.2～7.0）×1012/L 儿童：（4.2～5.2）×1012/L 成人男：（4.0～5.5）×1012/L 成人女：（3.5～5.0）×1012/L 【临床意义】（1）生理性变化①增多见于精神因素（冲动、兴奋、恐惧、冷水浴刺激，均可使肾上腺素分泌增多导致）、红细胞代偿性增生（气压低，缺氧刺激；长期多次献血）。②减少见于妊娠、6个月～2岁婴幼儿生长发育迅速，造血原料相对不足、某些老年人造血功能减退。（2）病理性增多见于频繁呕吐、出汗过多、大面积烧伤、血液浓缩，慢性肺心病、肺气肿、高原病、肿瘤以及真性红细胞增多症等。（3）病理性减少①红细胞生成减少，见于白血病等病；②破坏增多，见于急性大出血、严重的组织损伤及血细胞的破坏等；③合成障碍，见于缺铁、维生素B12的缺乏等。 2.血红蛋白（Hb）是红细胞的主要组成部分，承担着机体向器官、组织运输氧气和运出二氧化碳的功能。其增减的临床意义基本上与红细胞增减的意义相同，但血红蛋白能更好地反映贫血的程度。【正常参考范围】男性120～160g/L 女性110～150g/L 新生儿170～200g/L

BD分析TH17细胞

流式细胞术分析TH17细胞 1.肝素钠真空抗凝采血管取人外周血全血1-2ml，血液室温放置，8小时内进行检测，否则需弃用。 2.取5个流式管，分别标记空白管、CD4抗体单染管、IL-17A抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管，每个流式管分别加入100μl全血，用RPMI1640(不含FBS)1:1等体积稀释。 3.刺激细胞活化：向稀释后的全血样本管加入2μl BD Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug，货号550583(刺激剂和蛋白转运抑制剂)，混匀。37o C，5%CO2培养箱或37o C水浴孵育4-6小时(不超过6个小时)。 4.细胞表面标记染色：向CD4抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管这三管分别加入1Test体积的CD4抗体，室温避光孵育15-30分钟。 5.制备红细胞裂解液：制备1X.红细胞裂解液(BD Lysing Buffer10X，货号555899)，取10X红细胞裂解液，按照体积.1(10X红细胞裂解液)：9(dH2O)，稀释。 6.每100μl全血加入2ml1X红细胞裂解液，室温裂解15-30min，至细胞悬液呈澄清透明状。 7.裂红后，500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。 8.加入1ml FBS（货号554656），500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。 9.破膜固定液制备(货号554714)，554714包括Fixation/Permeabilization solution和BD Perm/Wash?Buffer(10X)。Perm/Wash?Buffer(10X)需要稀释：1体积BD Perm/Wash?Buffer(10X)，9体积distilled H20，1：9混合，配制成1XPerm/Wash?Buffer 10.细胞固定：涡旋细胞3秒钟，每管加入250μL Fixation/Permeabilization solution，涡旋混匀，4°C孵育20分钟。 11.破膜：每管直接加入1ml1X Perm/Wash Working Solution到固定的细胞中，4°C，500g离心10分钟，弃上清。 12.每管加入1ml1X Perm/Wash Working Solution，4°C500g离心10分钟，弃上清。

血细胞分析仪发展史

血细胞分析仪50年的发展历史和展望中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院检验科张时民 1590 年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最原始的显微镜（图1），1610 年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大，后来被列文霍克改进成为原始的显微镜。1658 年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞，他是第一个见到红细胞的人，开始进行红细胞计数则是200 年后的事情了。而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100 年。自从发明了显微镜以后，人们从微观世界中了解和观察到了血液的组成，并根据他们的特点分别将它们称为红细胞和白细胞和血小板。在以后的研究中，人们发现许多疾病的发生和发展与血液中的细胞数量之间存在一定的关系。依据对疾病诊断的需求，人们开始寻求对血液中细胞的数量进行计数。1852 年就有人开始设计对红细胞的计数办法，1855 年发明了用于计数血细胞的计数板，目前仍然使用的改良Neubauer 计数板就是应用最为广泛和持续时间最为长久的经典一种，虽然各种类型的血细胞计数仪已在广泛使用，但血细胞计数板法仍然是最为可靠和最为经典的计数技术，它不仅适用于血细胞计数，还可用于其他细胞、动物血细胞、微小粒子及需要在显微镜下计数的各种样品，因此计数板仍然是检验工作者应该掌握的基本技能，是不应该忘记和放弃的手段。随着对血细胞计数和分析需求的不断增加，对血细胞计数的方法进行改进，实现自动化、高速度、准确性、标准化和智能化的要求也越来越高，现代的血液细胞分析技术与50 年前的发明虽然有着本质上的相同或相似，但已经有了显著的飞跃。作者力图通过有限的资料对细胞计数和分析技术的发展进程进行回顾，并对最新的进展进行介绍和展望，期望对关注这一领域和从事血细胞分析工作的同行有所帮助。一、血细胞计数仪的发展历史谈到血细胞计数仪的发展史，在这个领域首开先河的人是1912 年出生在美国阿肯色州一个小城的人Wallance H. Coulter （图2a，b），他年青时对电子学

快速体外分离、长期培养人Th17细胞

快速体外分离、长期培养人Th17细胞方法 1.Subject 全血 2.CD4+T细胞浓缩采用RosetteSep（StemCell Technologies，Canada）进行阴性选择得到浓缩CD4+T细胞。建立标准密度梯度离心，分离出淋巴细胞 3.CD4+T细胞刺激将浓缩的CD4+T细胞悬浮在RPMI1640培养基中（Sigma），包含青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺，HEPES缓冲液和10%小牛血清（R10），浓度为1×106个细胞/ ml.含 3×106个细胞的3mlR10，在15ml Falcon管中，用每毫升含4μL（1mg/ml）PMA和2μL（1mg/ml）伊沃诺霉素（AG Scientific，San Diego，CA）的细胞溶液刺激。继而加入总量3μL的包含CD49d （1mg/ml）和CD28（0.5mg/ml）的共刺激抗体（BD Biosciences）。随后细胞在37℃、5%CO2条件下孵化3个半小时。阴性对照采用相似方法，但用R10替换PMA和伊沃诺霉素。为了用细胞内细胞因子标记法测量IL-17产量，浓缩的CD4+T细胞用10μL Brefeldin A（1mg/ml）刺激。 4.IL-17捕捉复合物的准备 IL-17捕捉复合物由2个生物素标记的抗体组成，2个抗体通过一个抗生物素蛋白分子连接。直接连在T细胞表面CD45分子的抗体与IL-17抗体配对。2μL生物素标记的CD45抗体（clone H130）（Caltag，Invirtrogen，CA）和20μL生物素标记的IL-17抗体（0.5mg/ml）（clone：eBio64DEC17）（ebiosciences，CA）混合加入eppendorf管，并彻底漩涡。然后，加入2μL未作标记的5mg/ml的生物素（Invitrogen，CA），并立即充分混匀。复合物在室温下孵化10分钟，使用前再次漩涡。 5.IL-17体外捕获分析被刺激过的细胞用含有2%小牛血清（2%FCS/PBS）的冰冻PBS（Cellgro ，Mediatech，V A）,冲洗，以500×克离心10分钟成小球，上清液被完全吸出。然后细胞被悬浮在100μL2%的FCS/PBS，将20μL捕获的IL-17复合体加入。冰上孵化15分钟后，加入9mlR10。将试管放入转动器，在37℃和5%CO2条件下额外孵化1个半小时。 6.IL-17+细胞分选被捕获的IL-17细胞可以用2种技术分选：一种是FACS Aria细胞分选器（BD），另一种是磁珠技术（Miltenyi，Germany）。FACS Aria细胞分选器，细胞被一种太平洋蓝活性胺标记来区分活的和死的细胞。然后用FACS/PBS冲洗细胞，细胞表面用10μL的CD3-FITC，5μL的CD4-Alexa700（BD BIOsciences）和20μL（0.25μg）IL-17A-PE（clone：eBio64CAP17）抗体标记。细胞在暗室诗文条件下孵化15分钟，分析前用2%FCS/PBS冲洗一次。磁珠法捕获的细胞用IL-17A-PE标记15分钟。用2%FCS/PBS冲洗一次将多余的抗体移除，然后参看说明将细胞在4℃条件下加抗-PE磁珠孵化。简而言之，再次冲洗细胞并使之悬浮在500μL缓冲液中。悬浮液用洗液管加入MS柱（Miltenyi，German）并放到磁体上，用500μL的PBS洗3次。将虑柱从磁体上拿下，被选择的细胞收集在一个15mL的Falcon管。被选择的细胞再次通过磁性分离进一步浓缩。 Aria分选或磁珠净化得到的Th17细胞，培养在包含50单位的人IL-2（NIH/Roche，switzerland）(R10-50)的R10培养基,. 2天后，细胞被250.000照射feeders（3000 rad）和抗-CD3/抗-CD8双特异性单克隆抗体（1μg）刺激。每3周细胞被照射feeders（3000 rad）

流式细胞仪检测技术与质量控制

全自动五分类血液细胞分析仪技术参数要求

全自动五分类血液细胞分析仪技术参数要求： 1.检测原理：多角度激光散射结合细胞化学染色技术，独立嗜碱性粒细胞检测通道； 2.*检测项目≥35项； 3.分析模式：CBC,CBC+DIFF； 4.测量模式：全血、预稀释全血、末梢全血； 5.*标本用量：全血模式：CBC≤12ul，CBC+DIFF≤15ul；预稀释全血≤20ul； 6.检测速度：≥60样本/小时； 7.*检测线性范围： WBC：0.00×109/L～400.00×109/L RBC：0.00×1012/L～8.00×1012/L HGB：0 g/L～250g/L PLT：0×109/L～5000×109/L 8.*重复性： WBC≤2.0％ RBC≤1.5% HGB≤1.5% MCV≤1.0% PLT≤4.0% 9.*质控品、校准品：有仪器厂家原厂生产并通过省级SFDA注册的校准品、质控物，保证仪器检测结果准确性，并提供注册证复印件； 10.*溯源性：投标时需提供五分类血细胞原厂生产校准品的国际溯源性检测报告复印件； 11.*配套试剂：有仪器厂家原厂生产并通过SFDA注册/备案的配套试剂，并提供注册证或备案凭证复印件； 12.*试剂种类：仅需两种溶血剂和一种稀释液和一种清洗液，降低使用成本； 13.显示类型：10寸以上彩色液晶显示屏，同屏显示全部参数，便于基层操作人员使用； 14.数据管理：4个USB接口，支持连接U盘、打印机、鼠标、键盘等；

15.质控方式：L-J质控和X-B浮动均值法质控； 16.工作环境：温度：10-30℃，湿度：20%-85%，气压：70kPa-106kPa； 17.中文软件与细胞分析仪同一品牌（或同一厂家），并提供证明材料。 18.*生产厂家具有血液分析标准化实验室（非检测中心），并且获得CNAS（中国合格评定国家认可委员会）颁发的标准化实验室认可证书，确保血液分析系统的溯源有效性和检测质量； 19*质评报告：投标设备系列产品参加安徽省临床检验中心室间调查，PT评价合格，并提供医院安徽省临床检验中心室间调查报告复印件； 20.售后：生产厂家在安徽省境内设有常驻办事处和维修点，并提供证明材料； 21.*售后服务人员：提供5名以上厂家售后服务工程师的本地社保证明（包括：社保卡正反面复印件及在合肥社保局查询截图），真实有效； 22.投标系列产品通过FDA认证。参数说明： *项为关键项参数，每一*项不符合将导致废标；非*号项参数每三项（含三项）以上将导致废标；

新型的CD_4_T细胞_Th17细胞

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K ey word s:CD4+T cel;l Th17cel;l In t erleuk i n217 天然CD4+T细胞是一种具有很多亚群的前体,具有抗原识别特异性,是主要组织相容性复合物ò类分子限制性T细胞。根据产生淋巴因子的种类和生物学功能的不同,CD4+T细胞主要分为辅助性T细胞1型(T help ce ll1, Th1)、2型(T help ce ll2,Th2)和调节性T细胞(regulatory T cells,T reg)[1]。Th1型细胞主要产生干扰素C(interferon2C, I FN2C)、白细胞介素2(i n terleu2 k i n22,I L22)和肿瘤坏死因子B (tumor necr osis f actor B,T NF2B),参与细胞免疫和迟发型超敏反应,协助B细胞产生Ig G2,在抗细胞内微生物感染和细胞免疫所引起的炎性反应中发挥作用。Th2型细胞主要产生I L24、I L25、I L210和

血细胞分析仪五分类检测技术及原理

血细胞分析仪五分类检测技术及原理血细胞分析仪是医院临床检验应用非常广泛的仪器之一，随着科学技术日新月异的发展，血细胞分析的技术也从几年前的三分类转向现在的五分类，从二维空间进而转向三维空间，同时现代血细胞分析仪的五分类技术许多采用了先进的技术，如鞘流技术、激光技术等。下面就五分类血细胞分析仪器的检测方法及其应用加以说明。 1 采用阻抗、激光散射和荧光染色技术检测法直流电阻抗法（DC）用于测量细胞体积大小。激光散射产生的前向散射光、侧向散射光和侧向荧光可用于探测白细胞体积大小、细胞内含物的情况（细胞核以及颗粒情况），侧向荧光则可以反映细胞内脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的含量，特有的嗜酸性粒细胞检测溶血剂Str-matolyzer-EO可将除了嗜酸细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整嗜酸细胞的液体通过小孔可以按照电阻法计数技术进行计数。在嗜碱细胞通道中，使用特殊溶血剂Strmatolyzer-BA可将除了嗜碱细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整嗜碱细胞的液体通过小孔可以按照电阻法计数技术进行计数。幼稚细胞检查通道（IMI）可以根据幼稚细胞膜比成熟细胞膜表面含有脂质较少的现象，在细胞稀释悬液中加入硫化氨基酸，由于占位不同，结合在幼稚细胞表面的氨基酸较多，对溶血剂有抵抗作用，当加入溶血剂后成熟细胞易被溶解，而幼稚细胞不易被破坏，可通过电阻法检测出来。综合各个测量方法，得到白细胞五分类的图形和数据。这种技术主要应用在Sysmex研制和开发的SE-9000、SE-9500、XE-2100、XT-1800等系列血液分析仪中。 2 电阻抗和射频电导联合检测法这种方法是分别采用四个检测系统来检测不同类型的细胞:（1）淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞检测系统:在细胞悬浮液中加入溶血剂使红细胞溶解，而使白细胞保持完整，细胞浆及核形态近似于生理状态，当这些细胞通过检测系统时，对白细胞进行电阻抗法（测量细胞体积）和射频电导法（检测细胞核和颗粒密度）的联合检测，结果将细胞分成淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个群体。（2）嗜酸性细胞和嗜碱性细胞两种检测系统:在细胞悬浮液中加入特殊的溶血剂，除嗜酸性细胞和嗜碱性细胞外，其他细胞均被溶解或萎缩，再对保持完整的嗜酸性细胞或嗜碱性细胞进行计数。（3）幼稚细胞检测系统:在细胞悬浮液中加入硫化氨基酸，由于占位不同，结合在幼稚细胞的氨基酸比成熟细胞多，且对溶血剂有抵抗作用，当加入溶血剂时，成熟细胞被溶解，只保留着可能存在的幼稚细胞用来计数。目前日本东亚公司的NE1500、SYSNEX公司的SE9000血细胞分析仪就是采用这种方法进行五分类的。 3 多角度激光偏振光散射检测法

种血气分析指标及其临床意义

18 种血气分析指标及其临床意义 1．pH（酸碱度） pH为氢离子浓度的负对数，表示体液的酸碱度，在细胞外液的正常值为：7.35～7.45,平均7.40。静脉血比动脉血低0.03～0.05。 pH＞7.45：为碱血症（Alkalemia）；pH＜7.35为酸血症（Acidemia）。血浆pH值的变化取决于血浆中碳酸氢根（HCO3-）与碳酸（H2CO3）的比值，正常情况下，HCO3-/H2CO3=20/1。 ?当血浆H2CO3原发性上升，致pH下降，pH＜7.35时为失代偿性呼吸性酸中毒； ?当HCO3-原发性降低，致pH＜7.35时为失代偿性代谢性酸中毒； ?当血浆H2CO3原发性降低，致pH上升，pH＞7.45时为失代偿性呼吸性碱中毒； ?当HCO3-原发性增高，pH＞7.45时为失偿性代谢中毒。 HCO3- 和H2CO3的原发性改变是区分代谢性或呼吸性酸碱失衡的重要标准。但在pH正常时也不能排除体内是否存在着酸碱失衡，这是因为在酸碱失衡时，虽然体内缓冲对HCO3-与H2CO3的绝对值已发生改变，但通过机体的调节作用，仍可维持其20:1的比例，使pH值保持在正常范围，这种情况称为代偿性酸或碱中毒。另外，在某些混合型酸碱失衡时pH值也可在正常范围。 pH 7.30～7.35及pH 7.45～7.50为治疗满意范围。 pH 7.10～7.30及pH 7.50～7.64为机体内酶系统活动受损的范围。人可生存的最高酸度为pH 6.9，人可生存的最高碱度为pH 7.7。 pH值超出正常范围不大的情况下（既治疗满意范围），不影响正常酶系统的活动，不一定急需治疗。纠正酸碱中毒时亦不一定必须达到正常范围之内，只要达到治疗满意的范围即可。 2．pHNR（标准pH） pHNR是PCO2标定在40mmHg时血液的pH值，即排除了呼吸影响，只反映代谢性酸碱状态。故可用pHNR 与pH的差异来反映酸碱平衡受呼吸影响的程度。