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分子生物学复习资料

分子生物学复习资料
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1.分子生物学就是要解释生物分子结构与功能间的关系,以及这种关系是如何操纵和调控

各种生化过程的,其主要目标在于DNA、RNA和蛋白质等大分子和大分子复合体,以及复制、转录和翻译的过程。操作这些分子的先进的实验技术是现代分子生物学的核心。

2.类核体(Nucleoid):过氧化物酶体是由一层单位膜围绕而成的圆形或卵圆形小体,直径

约为0.6~0.7μm。电镜下,内含极细的颗粒状物质,中央常含有电子密度较高呈规则的结晶状结构,称类核体。类核体为尿酸氧化酶的结晶,人类和鸟类的过氧化物酶体中不含尿酸氧化酶,所以其过氧化物酶体中没有类核体。

3.核酸的基本结构:先由4种碱基与戊糖分子的1’位共价结合形成核苷(RNA中的戊糖为

核糖,而DNA中的戊糖为2’脱氧核糖),再由一个或多个磷酸基团共价结合到核苷的3’、5’位,或2’位(在核糖核苷中)而形成核苷酸,RNA 和DNA分别由相应的5’-三磷酸核苷,即5’-三磷酸核糖核苷(NTP)和5’-三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)构成。核酸链中,核糖或脱氧核糖的5’位之间由磷酸键连接,即形成3’,5’-磷酸二酯键。因此核酸由具有方向性的糖磷酸骨架,以及结合于每一糖分子1’位的碱基构成。其重复单位是核苷酸。

由于磷酸分子带有负电,致使核酸成为具有强负电性的多聚大分子。

4.B型双螺旋结构特点:主链由两条反向平行的多核甘酸链组成,形成右手螺旋(A为右,

Z为左)。主链在螺旋外侧,碱基在内侧。碱基对配对,A和T,C和G,满足Chargaff 的当量的规律。DNA双螺旋结构的螺距为3.4nm(A为2.8,Z为4.5),包含10个核苷酸(低温有到的A型为11,主要存在于RNA及RNA与DNA的杂合体,Z为12),双螺旋的平均直径为2nm(A为2.6,Z为1.8).此外,DNA双螺旋中存在大沟和小沟。

5.维持DNA稳定的作用力:氢键,碱基堆积力,反离子作用,不稳定因素:磷酸基团间

的静电斥力和碱基内能增加(温度), 使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱。

6. DNA变性的因素:1高温2有机溶剂3高PH值4降低盐浓度,复性的条件:1温度低于

Tm25℃2高浓度3复性的时间长短4DNA复杂度5DNA的长度6离子强度的高低。7. 增色效应(hyperchromic effect):由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是

变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。

8. 减色效应(hypochromic effect):若变性DNA复性形成双螺旋结构后,其260nm紫外

吸收会降低,这种现象叫减色效应。

9. DNA 变性(DNA denaturation):加热或用碱处理双链DNA,使氢链断裂,结果DNA

变成为单链,此称为DNA的变性。

10. DNA复性(DNA annealing):DNA的复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部

或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。

11. DNA杂交(DNA hybridization):在双链DNA经热变性成为单链状态以后,放在适当

的盐类浓度和温度的条件下由于碱基间重新形成氢键,二条单链的DNA又会恢复成原来的Watson- Crick型的双链结构。

12. Tm值:DNA熔解温度,指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA,

Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。

13. C值悖论(C-value paradox):C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象称为C值

悖论。

14. 纯dsDNA的A260/A280为1.8,纯RNA的A260/A280为2.0,蛋白质的A260/A280

小于1。

15. 常染色质是染色质的主要成分,染色较浅,着色均匀。当细胞不处于分裂期间,常染色

质呈高度分散状态,占据细胞核内的大部分空间。同细胞分裂期间的染色体结构相比,常染色质的折叠、包装和凝缩程度是很疏松的。当细胞进入分裂时期,在分裂周期的不同阶段,常染色质的凝缩程度也随之发生变化。常染色质的凝缩状态同基因的活性相关联,其凝缩程度很可能支配着基因的活性。活性表达状态的基因一定处在常染色质中;

但常染色质中的基因并非全处于活性表达状态,通常只有一小部分基因在进行转录。因此,位于常染色质内是基因表达的必要条件,但不是充分条件。

16. 异染色质折叠非常致密,在染色体上染色较深,而且在细胞分裂周期中致密程度很少发

生变化。异染色质多半位于染色体的着丝粒(cen—tromere)。在间期细胞核内,染色很深的致密的异染色质呈簇状分布在核仁和核膜的四周。折叠致密的染色质内没有表达活性的基因,所以处于有丝分裂中的染色体是没有转录活性的;换言之,细胞在分裂过程中基因转录是停止的。同样,位于异染色质中的基因也是没有转录活性的。在间期细胞中含有两种异染色质,每种异染色质各有不同的DNA序列,但这些DNA序列都不进行转录。

17. 基因组中串联重复数百次的某些基因或基因簇区域构成中度重复DNA区段,如RNA基

因和组蛋白基因簇。DNA复性分为三个不同阶段:1单一序列DNA2中度重复DNA(串联基因簇和分散重复)3高度重复DNA(卫星DNA)。

18. 半保留复制(semiconservative replication):DNA在复制过程中,在DNA聚合酶的催

化下,一个DNA分子就复制成两条结构完全相同的DNA分子,由于复制后的DNA分子是由一个新链与一个旧链构成的,故称为半保留复制。

19. 复制子(replicon):能够作为一个独立单位进行复制的一段DNA序列。

20. 复制泡(replication bubbles):两个靠得很近的复制叉之间形成的空间称为复制泡。

21. 复制叉(replication fork):DNA复制时在DNA链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结

合等过程形成的Y字型结构称为复制叉。在复制叉处作为模板的双链DNA解旋,同时合成新的DNA链。

22. 复制起点(origin of replication):复制子上起始复制的DNA序列。

23. 复制终点(Terminus of replication):复制子上终止复制的DNA序列。

24. 复制体(Replisome):DNA延伸过程中DNA聚合酶Ⅲ的全酶二聚体、引发体和DNA

解旋转酶以物理方式合成一个大的复合体成为复制体,该复制体以每妙90bp的速率合成DNA。

25. 半不连续复制(semi-discontinuocos replication):DNA分子复制是沿着分子的全长中

从若干起点向其两侧进行复制,然后经DNA连接酶将复制成的片段连接起来成一完整的分子,这样可使复制速度大大加快,加速生长发育的过程。这种作用称为半不连续复制。

26. 端粒酶(Telomerase):含一个短的RNA分子, 能部分与端粒DNA的重复序列配对;

此外还含有反转录酶。

27. 前导链(leading strand):与复制叉移动的方向一致,通过连续的5ˊ-3ˊ聚合合成的

新的DNA链。

28. 后随链(lagging strand):与复制叉移动的方向相反,通过不连续的5ˊ-3ˊ聚合合成

的新的DNA链。

29. RNA引物(Priming):是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,存在于自

然中生物的DNA复制。

30. 冈崎片段(Okazaki fragment):相对比较短的DNA链(大约1000核苷酸残基),是在

DNA的滞后链的不连续合成期间生成的片段。

31. 用RNA引导DNA复制的原因很可能是出于保证DNA复制的高忠实性。

32. 简述原核DNA复制过程中复制叉处的蛋白因子及其主要功能。1拓扑异构酶(DNA旋

转酶)—引入负超螺旋。2解旋酶—分开DNA双链。3单链DNA结合蛋白(SSB)—防止分开的单链重新退火,防止核酸酶降解。4引物酶—合成RNA引物。5DNA连接酶—在缺刻处形成磷酸二酯键。6DNA聚合酶Ⅲ—催化DNA合成。7DNA聚合酶Ⅰ—降解引物,填补空缺并纠错。

33. 半不连续复制机制不能完成线性染色体末端的复制,因为没有DNA可用来取代后随链

的5’端切掉的RNA引物来延伸相应的DNA。为了克服这一缺点,真核生物染色体的末端采取了由数百个简单重复的序列构成的结构,这些序列不含遗传信息,并且3’端突出于另一条链的5’端。端粒酶含有一个约150核苷酸长的RNA分子,其部分序列与上述重复序列互补。该RNA分子作为模板,通过反复延伸(聚合作用)与易位,反复地将重复片段加到突出的3’端上,而互补链则像一般的后随链那样复制,最终留下3’突出端。

34. 复制忠实性的分子机理:1DNA聚合酶: 保证Watson-Crick碱基配对23’ 5’ 校正活性

3RNA 引发: 使滞后链5’端得到校正4错配修复。

35. 简述DNA损伤的类型:1自发的DNA损伤,包括转氨作用,脱嘌呤作用,脱嘧啶作用

2氧化损伤:活性氧自由基(ROS)导致的DNA损伤如超氧化物和氢氧根3烷基化作用:亲电子的烷化剂对核苷酸的修饰作用如甲基甲烷脯磺酸盐MMS和乙基亚硝酸脲ENU4加合物:DNA损伤扭曲了双螺旋导致变性如嘧啶二聚体。

36. DNA修复方式及机理:1光复活又称光逆转。这是在可见光(波长3000~6000埃)照

射下由光复活酶识别并作用于二聚体,利用光所提供的能量使环丁酰环打开而完成的修复过程(图2)。光复活酶已在细菌、酵母菌、原生动物、藻类、蛙、鸟类、哺乳动物中的有袋类和高等哺乳类及人类的淋巴细胞和皮肤成纤维细胞中发现。这种修复功能虽然普遍存在,但主要是低等生物的一种修复方式,随着生物的进化,它所起的作用也随之削弱。2切除修复又称切补修复。最初在大肠杆菌中发现,包括一系列复杂的酶促DNA 修补复制过程,主要有以下几个阶段:核酸内切酶识别DNA损伤部位,并在5’端作一切口,再在外切酶的作用下从5’端到3’端方向切除损伤;然后在DNA多聚酶的作用下以损伤处相对应的互补链为模板合成新的DNA单链片断以填补切除后留下的空隙;最后再在连接酶的作用下将新合成的单链片断与原有的单链以磷酸二酯链相接而完成修复过程。3重组修复从DNA分子的半保留复制开始,在嘧啶二聚体相对应的位置上因复制不能正常进行而出现空缺,在大肠杆菌中已经证实这一DNA损伤诱导产生了重组蛋白,

在重组蛋白的作用下母链和子链发生重组,重组后原来母链中的缺口可以通过DNA多聚酶的作用,以对侧子链为模板合成单链DNA片断来填补,最后也同样地在连接酶的作用下以磷酸二脂键连接新旧链而完成修复过程。重组修复也是啮齿动物主要的修复方式。

重组修复与切除修复的最大区别在于前者不须立即从亲代的DNA分子中去除受损伤的部分,却能保证DNA复制继续进行。原母链中遗留的损伤部分,可以在下一个细胞周期中再以切除修复方式去完成修复。4SOS修复是SOS反应的一种功能。SOS反应是DNA 受到损伤或脱氧核糖核酸的复制受阻时的一种诱导反应。在大肠杆菌中,这种反应由recA-lexA系统调控。正常情况下处于不活动状态。当有诱导信号如DNA损伤或复制受阻形成暴露的单链时,recA蛋白的蛋白酶活力就会被激活,分解阻遏物lexA蛋白,使SOS反应有关的基因去阻遏而先后开放,产生一系列细胞效应。引起SOS反应的信号消除后,recA蛋白的蛋白酶活力丧失,lexA蛋白又重新发挥阻遏作用。5 暗修复是指照射过紫外线的细胞的DNA,不需要可见光的反应而修复,使细胞的增殖能力恢复的过程。6错配修复在含有错配碱基的DNA分子中,使正常核苷酸序列恢复的修复方式。修复的过程是:识别出正确的链,切除掉不正确的部分,然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用,合成正确配对的双链DNA。

37. 光复活修复(Photoreactivation Repair):是指照射过紫外线的细胞的DNA,需要可见光

的反应而修复,使细胞的增殖能力恢复的过程。

38.

39. 载体的基本特征:1具有复制原点(ori / ARS)2含有选择标记基因3含有多克隆位点

multiple cloning site (MCS)4容易从宿主细胞中分离5分子量小,拷贝数高

40. 载体的类型:1克隆载体(以繁殖DNA片段为目的的载体)2表达载体(允许外源基因

插入并表达的载体。该载体必须带有启动子和终止子,以便基因的转录)3整合载体(允许外源DNA插入,在转化后使之整合到宿主染色体DNA中的载体。整合是通过同源重组实现的)。

41. 怎样实现真核基因在大肠杆菌中高水平的表达:1要有表达载体2载体要有强启动子和

终止子3还要有完整的ORF和合适的核糖体结合位点(RBS)和组氨酸标签。

42. 基因组文库(Genomic Library):用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA,可以得

到大量的基因组DNA片段,然后将这些DNA片段与载体连接,再转化到细菌中去,让宿主菌长成克隆。这样,一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA 片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。

43. cDNA文库:以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载

体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

44. PCR基本原理:PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩

增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获

得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

45. 有义链(sense strand):DNA双链在转录过程中于转录形成的RNA序列相同(T对应

U)的那条链叫做有义链。

46. 反义链(antisense strand):转录时作为mRNA合成模板的那条单链叫做模板链或反义

链。

47. 大肠杆菌RNA 聚合酶亚基有哪些作用:1a 亚基(a核心酶中有两个相同的a 亚基b

由rpoA基因编码c为核心酶组装所必须d可能在启动子识别过程中起一定作用)2b 亚基(a由rpoB基因编码b是RNA 聚合酶的催化活性中心cb 亚基可能含有负责转录起始与延伸的两个结构域)3β’亚基(a由rpoC基因编码b结合有两个Zn 2+离子,可能参与催化过程c b’可能负责结合DNA)4σ因子(a许多原核细胞含有多个σ因子,用于识别不同的启动子。E. coli中最常用的是σ70。bσ与核心酶结合形成RNA聚合酶全酶cσ因子在启动子识别中异常重要。它可以降低核心酶与非特异序列的亲和系数(104) ,提高核心酶与相应启动子的亲和力dRNA 链起始合成出8-9个nt时,s 从全酶上脱离下来e细胞中σ 因子要比RNA聚合酶中其它亚基地数量要少)。

48. 大肠杆菌σ70启动子的特点:1启动子一致序列(启动子含有短的保守序列,是RNA

聚合酶结合并起始转录所必须的。): -10 区和-35 区2转录起始点(碱基多为嘌呤,G比A更常见)3启动子效率P184-186

49. 启动子清除(promoter clearance):当RNA合成起始成功后,s 因子从核心酶上释放

下来,结果形成polymerase-DNA-新生RNA三聚体,导致RNA聚合酶沿DNA模板移动,使得新一轮的转录从启动子处起始。

50. 启动子(promoter):位于基因转录起点上游、负责启动基因转录的DNA序列。

51. 增强子(enhancer):能提高与其连锁的结构基因转录水平的DNA序列,它是通过启动

子来增加转录的。

52. 操纵子(operon): 存在于原核生物当中,由启动子、操纵基因和一系列的结构基因紧

密结合而成,是多数原核生物基因调控的实现方式。

53. 转座子(Transposons): 是基因组中一段可移动的DNA序列,可以通过切割、重新整合

等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。两端各有一段IS序列,IS 序列之间夹着一段与转座无关的序列。

54. 插入序列(IS): 简单的转座子,两端都有转座酶识别所需的反向重复序列,除转座所需基

因外不携带任何宿主基因。

55. 不依赖ρ因子的终止子(Rho-independent terminators):DNA上能够引起大肠杆菌聚合

酶在没有ρ因子的情况下外终止转录的序列。

56. 尽管RNA聚合酶可在紧跟一串U残基的发夹结构处自行终止转录,但有的终止位点并

不形成强的发夹结构,须用一种辅助因子即ρ蛋白来帮助转录终止。

57. 真核生物RNA的转录与原核生物RNA的转录过程不同:⒈真核生物RNA的转录是在

细胞核内进行的,而蛋白质的合成则是在细胞质内进行的。所以,RNA转录后首先必须从核内运输到细胞质内,才能指导蛋白质的合成。⒉真核生物一个mRNA分子一般只含有一个基因,原核生物的一个mRNA分子通常含有多个基因,而除少数较低等真核生物外,一个mRNA分子一般只含有一个基因,编码一条多肽链。⒊真核生物RNA聚合酶较多在原核生物中只有一种RNA聚合酶,催化所有RNA的合成,而在真核生物中则有RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ三种不同酶,分别催化不同种类型RNA的合成。三种RNA聚合酶都是由10个以上亚基组成的复合酶。RNA聚合酶Ⅰ存在于细胞核内,催化合成除5SrRNA以外的所有rRNA的合成;RNA聚合酶Ⅱ催化合成mRNA前体,即不均一核RNA(hnRNA)的合成;RNA聚合酶Ⅲ催化tRNA和小核RNA 的合成。⒋真核生物RNA聚合酶不能独立转录RNA 。原核生物中RNA聚合酶可以直接起始转录合成RNA ,真核生物则不能。在真核生物中,三种RNA聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进行RNA的转录。另外,RNA聚合酶对转录启动子的识别,也比原核生物更加复杂,如对RNA聚合酶Ⅱ来说,至少有三个DNA的保守序列与其转录的起始有关,第一个称为TATA框(TATA box),具有共有序列TATAAAA,其位置在转录起始点的上游约为25个核苷酸处,它的作用可能与原核生物中的-10共有序列相似,与转录起始位置的确定有关。第二个共有序列称为CCAAT框(CCAAT box),具有共有序列GGAACCTCT,位于转录起始位置上游约为50-500个核苷酸处。如果该序列缺失会极大地降低生物的活体转录水平。第三个区域一般称为增强子(enhancer),其位置可以在转录起始位置的上游,也可以在下游或者在基因之内。它虽不直接与转录复合体结合,但可以显著提高转录效率。

58. 解释为何真核染色体末端不能完整复制。这会造成什么样的后果?真核生物如何解决这

个问题:由于DNA聚合酶绝对需要RNA引物,并从5`-3`方向延伸,当聚合结束时,冈崎片断的RNA引物水解,随后由DNA连接酶完成,在新合成链的5`端RNA引物去除后,因为没有DNA可用来取代从后随链的5`端切掉的RNA引物作为模板来延伸相应的DNA,从而使染色体末端不能完整复制。这样每经过一次复制,染色体5`末端就会缩短,即意味着每一轮DNA复制都将出现子代DNA分子被截短的情况。真核生物体的末端采取了由数百个简单重复序列构成的结构来克服这一缺点,即端粒结构,例如在人类中是TTAGGG。这些序列不含遗传信息,并且3`端突出于另一条链的5`端。复制会使端粒5`端缩短,而端粒酶可外加重复单位到5`末端上,结果维持端粒一定长度。

59. 一个真核mRNA可以编码多种蛋白吗?可以。基因转录产生的mRNA分子中,由于核

苷酸的缺失、插入或置换,基因转录物的序列不与基因编码序列互补,使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成,不同于基因序列中的编码信息,这种现象称为RNA编辑。通过mRNA 的编辑,一个真核mRNA即可产生多种蛋白质。

60. 乳糖操纵子(lac operon):(1)负调控是指调节基因产物repressor的调控,repressor

有活性时阻遏了lac Z Y A的表达。当环境中无乳糖时:I基因产生的蛋白质即阻遏物同操纵基因O结合,阻止了RNA多聚酶的向前推进,不能合成mRNA,也就无几个酶的合成。(2)正调控是指CRP-cAMP复合物的调控,当环境中有乳糖时,cAMP ↑,cAMP 激活CAP,CAP-cAMP复合物与CAP结合,促进转录。P193

61. 色氨酸操纵子(trp operon):色氨酸的操纵区和第一个结构基因E之间存在一段前导肽

序列(The leader sequence ),其中包含一个弱化子位点(an attenuator site),色氨酸的浓度决定转录是否在该位点上终止.前导肽基因含有4个GC富含区域,其中1区含有两个相邻的色氨酸密码子.这4个区域可形成两种选择的发夹结构: 1×2;3×4 或2×3 .当培养基中色氨酸的浓度很低时,负载有色氨酸的tRNATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体才进行到1区(或停留在两个相邻的Trp密码子处),这时的前导区结构是2—3配对,不形成3—4配对的终止结构,所以转录可继续进行,直到将Trp操纵子中的结构基因全部转录.而当培养基中色氨酸浓度高时,核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2-3不能配对,3—4区可以自由配对形成茎—环状终止子结构, Trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸。P197

62. 乳糖操纵子: 1个调节基因, 3个结构基因(lacZ编码β-半乳糖苷酶,可水解乳糖lacY 编

码半乳糖苷渗透酶,转运乳糖lacA编码硫代半乳糖苷转乙酶,参与代谢乳糖), 1个启动子(从单一的启动子Plac开始,3个结构基因被转录成一条mRNA),1个操纵基因(操纵基因Olac(operator) 位于-5至+21,上游紧临启动子Plac是阻遏物(阻遏蛋白) lac repressor的结合位点)和1个调控元件(调节基因LacI)。

63. 低浓度葡萄糖+ 高浓度乳糖: cAMP 水平高, CRP结合cAMP后被活化,结合到CRP

位点;异乳糖与阻遏蛋白结合,使后者不能结合操纵基因; RNA pol结合到启动子上,发生高水平转录。高浓度葡萄糖+ 高浓度乳糖: cAMP 水平低, CRP 无活性,不能结合到CRP位点;异乳糖与阻遏蛋白结合,使后者不能结合操纵基因; RNA pol结合到启动子上,发生低水平转录。高浓度葡萄糖+ 低浓度乳糖: cAMP 水平低, CRP 无活性,不能结合到CRP位点;异乳糖与操纵基因结合; RNA pol结合到启动子上,转录水平极低。

低浓度葡萄糖+ 低浓度乳糖: cAMP 水平高, CRP结合cAMP后被活化,结合到CRP 位点;阻遏蛋白结合操纵基因; RNA pol结合到启动子上,转录水平极低。

64. 热休克:大肠杆菌热休克蛋白编码基因的启动子被一个含有变异的σ因子(σ32)的RNA

聚合酶全酶所识别,含σ32全酶主要作用于热休克蛋白的启动子但不识别大部分其他基因的共有序列启动子,相应地,热休克启动子含有一些与结合到σ70上的其他一般启动子的不同序列。

65.

66. RNA pol II 的CTD(羧基末端结构域)的功能:1部分磷酸化可以使键转录和翻译,2,

3 CTD 在转录起始时不被磷酸化,一旦进入延伸阶段就被磷酸化,

4 RNA Pol II 转录所

有的编码蛋白的基因, CTD是转录延伸特异激活的重要靶标,5提供剪接体和加尾酶等的附着位点。

67. 结合在TATA附近核苷酸序列上的因子称为通用转录因子(TBF)。结合在上游特异核苷

酸序列上的蛋白质因子称为转录调控因子。

68. 增强子的特点(Enhancer能够远距离激活基因表达的控制元件):1能强烈激活邻近基

因的转录,2没有方向性,3可在远于1 kb以外的距离起作用,4具有邻近性。

69. 转录因子上的结构域有1 DNA结合结构域DNA-binding domains. (activity),2二聚体

结构域dimerization domains. (regulation),3激活结构域activation domains. (activity),4配体结合结构域ligand-binding domains. (regulation)。

70. DNA结合结构域有:1螺旋-转角-螺旋结构域,2锌指结构域,3碱性结构域。

71. 二聚体结构域有:1亮氨酸拉链,2螺旋-环-螺旋结构域。

72. 转录结构域有:1酸性激活结构域,2富含谷氨酸结构域,3富含脯氨酸结构域。

73. 核酶(ribozyme):一种可以催化特定生化反应的RNA分子。

74. RNA编辑(RNA editing):基因转录产生的mRNA分子中,由于核苷酸的缺失、插入

或置换,基因转录物的序列不与基因编码序列互补,使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成,不同于基因序列中的编码信息,这种现象称为RNA编辑。

75. 剪接体(Spliceosome):在剪接过程中形成的剪接复合物称为剪接体,剪接体的主要组

成是小分子的核RNA(snRNA)和与这些RNA结合的核蛋白,负责所有编码蛋白的mRNA的剪接。

76. 核酶的具体作用主要有:1.催化形成磷酸二酯键,即连接酶作用。2.水解反应,即核

酸内切酶作用。3.磷酸基团转移反应,即磷酸转移酶作用。4.脱磷酸作用,即酸性磷酸酶作用。5.RNA限制性内切酶作用。6.催化形成肽键。

77. 5′“帽子”的功能a防止mRNA遭降解b提高翻译的效率c有利于往胞质转运d 参与剪

接第一个外显子。

78. poly(A)“尾巴”的功能a提高mRNA的稳定性b提高翻译效率c参与剪接最后一个内含

子。

79. 剪接(Splicing):从前体mRNA中移除内含子,连接外显子的过程。

80. 参与RNA加工核酶类型:1参与MRNA拼接的U2和U6,2参与前体tRNA加工的RNA

酶p,3自我剪接的Ⅰ和Ⅱ内含子。

81. 真核生物hnRNA加工包括:5’端加帽,3’端剪切和聚酰苷化,剪接以及甲基化。

82. 核内不均一核糖核蛋白体(hnRNP) hnRNA 与蛋白质结合就形成了hnRNP,核内小核糖

核蛋白体颗粒(snRNP particles)。除了U6外,其他snRNP包含于hnRNP。

83. 5'加“帽”怎样加上,什么时候加上:当新生mRNA 合成出20 -30 nt 时;7-甲基鸟

苷酸(7-methylguanosine) 被共价连接到前体mRNA的5' 端;通过5′ 5′三磷酸二酯键相连,该键由鸟苷酸转移酶催化。

84. 加尾信号:RNA pol II转录没有精确的终止位点,mRNA前体在多聚腺苷酸化位点

(polyadenylation site,5’-YA-3’, Y=嘧啶) 切开。该位点上游~20nt处为多聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal,5’-AAUAAA-3’),下游有富含GU的序列几乎所有的mRNA 都有poly(A) “尾巴”(除histone的前体mRNA之外) 。

85. 外显子(Exon):真核生物基因的编码序列是不连贯的,即在两个编码序列之间有一段

不编码蛋白质的非编码序列。编码序列称为外显子,出现在mRNA分子中的基因序列。

86. 内含子(Intron):真核生物基因的编码序列是不连贯的,即在两个编码序列之间有一段

不编码蛋白质的非编码序列。非编码序列称为内含子,不出现在mRNA中的基因序列。

87. 剪接体(Spliceosome):主要由snRNAs (U1,U2, U5, U4/U6) 与蛋白结合成的snRNPs

在前体mRNA上组装而成的复合物。负责内含子的移除和外显子的连接。

88. 可变mRNA加工:指一种前体mRNA经过加工得到多种成熟mRNA的现象。其途径a

利用不同的启动子d利用不同的poly(A)位点c保留内含子d保留或移除外显子。89. 遗传密码的特点:1遗传密码是三联体密码,2三联体密码是连续的、不重叠的,3遗

传密码具有简并性,通用性,偏好性,摇摆性。

90. 可读框(open reading frame):DNA上一段从起始密码子(ATG)起到终止密码子(TGA

\TAA\TAG)止的连续的密码子区域,但没有已知的蛋白质产物,该区域被称为可读框。

91. 移码突变(frameshift mutation):在正常的DNA分子中,碱基缺失或增加非3的倍数,

造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变,这种现象称移码突变。

92. 氨酰-tRNA(Aminoacyl-tRNA)的合成:1. 由氨酰-tRNA合成酶催化,来自ATP的AMP

连接到特定aa的-COOH上; 2. 相应的tRNA取代aa-AMP上的AMP。

93. 氨酰-tRNA合成酶a氨基酸:serine,b对应tRNA:tRNA ser,c对应氨酰-tRNA合成酶:

丝氨酰-tRNA合成酶,d氨酰-tRNA:丝氨酰-tRNA ser。

94. SD序列(SD sequence):在细菌mRNA 起始密码子AUG上游10个碱基左右处,有一

段富含嘌呤的碱基序列,能与细菌16SrRNA3’端识别(并互补),帮助从AUG处的翻译起始。

95. 真核与原核蛋白质合成的异同

96. 原核生物的蛋白质生物合成:氨基酸在核糖体上缩合成多肽链是通过核糖体循环而实

现的。此循环可分为肽链合成的起始(intiation),肽链的延伸(elongation)和肽链合成的终止(termination)三个主要过程。原核细胞的蛋白质合成过程以E.coli细胞为例。肽链合成的起始1.三元复合物(trimer complex)的形成核糖体30S小亚基附着于mRNA的起始信号部位,该结合反应是由起始因子3(IF3)介导的,另外有Mg2+的参与。故形成IF3-30S亚基-mRNA三元复合物。2.30S前起始复合物(30S pre-initiation complex)的形成在起始因子2(IF2)的作用下,甲酰蛋氨酸-起始型tRNA(fMet-tRNA Met)与mRNA 分子中的起始密码子(AUG或GUG)相结合,即密码子与反密码子相互反应。同时IF3从三元复合物脱落,形成30S前起始复合物,即IF2-30S亚基-mRNA-fMet-tRNAMef 复合物。此步亦需要fGTP和Mg2+参与。 3.70S起始复合物(70S initiation complex)形成。50S亚基与上述的30S前起始复合物结合,同时IF2脱落,形成70S起始复合物,即30S亚基-mRNA-50S亚基-fMer-tRNA Met复合物。此时fMet-tRNA Met占据着50S亚基的肽酰位(peptidyl site,简称为P位或给位),而50S的氨基酰位(aminoacyl site,简称为A位或受位)暂为空位。

97. 肽键形成:肽酰转移酶Peptidyl tranferase (50S 亚基)催化两个相邻的氨基酸连接形成

肽键,不需能力输入。

98. 真核40s亚基与起始氨酰-tRNA复合物结合到mRNA的5’cap区,并沿mRNA扫描寻

找起始密码AUG。这个过程称为扫描。

99. 原核生物有三种rRNA,它们是5S rRNA;16 S rRNA; 23 S rRNA,真核生物有四种rRNA,

它们是5 S rRNA; 5.8 S rRNA , 18 S rRNA ,28 S rRNA。乳糖操纵子的正调控因子是cAMP-CAP复合物,在细菌中,有三中起始因子,即IF1、IF2 、IF3,在乳糖操纵子中,lacZ基因编码β-半乳糖苷酶。在DNA复制中,两条新链合成的方向是5’-3’方向。100. 说明衰减子的作用机理:大肠杆菌中,衰减作用依赖于转录和翻译的紧密偶联。RNA聚合酶刚转录出前导肽的部分密码子,核糖体就开始翻译。当细胞中有色氨酸时,核糖体能够顺利地翻译出整个前导肽而在终止密码子UGA(+70)处停下来。这时核糖体占据了序列1和部分序列2,使序列2和序列3不能配对,因而序列3和4配对产生终止子的发夹结构,实现转录的终止。当出现色氨酸饥饿时,核糖体停顿两个trp密码子上,这时,核糖体占据了序列1,而留下完整的序列2以便于和转录出或即将转录出的序列3形成二级结构,这样当序列4转录出来后仍是单链状态,即终止子不能形成,于是转录继续下去。

101. 已知DNA浓度为50μg/ml时,测得双链DNA 的A260=1.00 。现有一种DNA,测得的A260=0.50, 若为双链DNA, 则其浓度为多少?若为单链DNA,则其浓度为多少?

双链:50/X=1/0.5 X=25单链:50/X=1.37/0.5 x=50*0.5/1.37=18.2

祝大家考试顺利!

《分子生物学检验技术》教学大纲

《分子生物学检验技术》教学大纲 第二版 《分子生物学检验技术》教学大纲是依据梵绮诗主编的《分子生物学检验技术》第一版的内容,结合临床实验室的具体应用和我校教学的具体条件制定的。重点突出与临床分子诊断应用密切相关的分子生物学技术和知识点的介绍和讲解。本学科教学总时数为32学时,其中包括26学时理论,6学时实验课和国庆放假4学时。 第一章 临床分子诊断绪论 [目的要求] 了解 课程设置;分子诊断在临床中的应用 [教学时数] 讲授4学时。 [讲授内容] 分子诊断在临床中的应用和发展 第二章 生物大分子的分离纯化 [目的要求] 掌握 基因组DNA分离的常用方法,如酚抽提法;RNA分离纯化方法,如酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法;质粒DNA分离纯化方法,如加热法和碱裂解法;固相支持物吸附法 了解 核酸的一般理化性质;核酸进一步纯化的方法 [教学时数] 讲授4学时。 [讲授内容] 核酸的理化性质;核酸分离纯化的原则;核酸分离纯化的设计;基因组(高分子量) DNA的分离纯化;质粒DNA的分离纯化;RNA的分离纯化;磁性硅胶吸附技术 [自学内容] 蛋白质分离纯化的一般方法

第三章 聚合酶链反应技术 [目的要求] 掌握 PCR的概念和基本原理;PCR反应体系的组成;实时荧光定量PCR 的概念、原理和荧光示踪方法;外标定量法的原理 了解 PCR及有关技术的发展演变历史;PCR产物的检测方法;PCR技术的发展变化和PCR相关的扩增技术;临床PCR 实验室的标准化和质量控制 [教学时数] 讲授6学时 [讲授内容] PCR及有关技术的发展历史;PCR的概念和基本原理;PCR反应体系的组成和各组分介绍;PCR扩增产物的检测;实时荧光定量PCR概念和各种荧光示踪方法的介绍;实时荧光定量PCR定量理论和基本知识;外标定量法的原理及其优缺点;PCR 技术的变化和发展及PCR相关的扩增技术;PCR实验室的标准化和实验室的质量控制 [自学内容] PCR 反应条件的优化;PCR 产物的克隆 第四章 核酸分子杂交技术 [目的要求] 掌握 分子杂交的基本原理;核酸探针的设计;固相杂交方法的适用范围;Southen/Northen印迹杂交。 了解 探针的检测核酸探针的标记;探针的纯化;其他杂交技术;限制性内切酶多态;SNP;chips [教学时数] 讲授4学时 [讲授内容] 核酸变性定义,Tm值定义,影响因素;核酸复性; 分子杂交的概念,同源性;核酸探针定义;核酸探针的种类,制备,优缺点;核酸探针的标记,缺口平移,

医学分子生物学

医学分子生物学 疾病和基因关系始终是医学领域关注的重大问题。在孟德尔遗传规律被重新认识的初期,就发现许多疾病受到遗传因素的控制,遵守孟德尔遗传因子的传递规律。遗传连锁定律的提出,现代经典遗传学理论体系的完善,极大地促进了对遗传性疾病的认识。上世纪40年代,L Pauling提出了”分子病”的概念,1956年,V Ingram发现血红蛋白β链第六位氨基酸从谷氨酸突变为缬氨酸是导致镰刀状贫血的原因。几乎同时,J.Lejeune发现Down综合症是由于21号染色体三陪体异常所致,系列染色体疾病病因。1976年,H Vanmus 和M Bishop在对肿瘤病毒学的研究中,发现了病毒癌基因,继而又无确定细胞癌基因的存在,此后抑癌基因也相继被发现,建立了肿瘤发生的基因理论,肿瘤被认为是体细胞的遗传病得到了普遍的认可。1983年,将亨廷顿病基因定位于第四号染色体上,1986年,克隆了慢性肉芽肿病的致病基因,同年杜氏肌营养不良和视网膜母细胞瘤的基因,也被定位克隆成功,掀起了单基因遗传病致病基因鉴定和克隆的热潮。世纪之交,人类基因组计划的完成,新的DNA标记的发现,为研究常见病的遗传因素成为了可能,2005年,首次用全基因组关联分析(GWAS),解析了视网膜黄斑变性病的相关基因,揭开了复杂性疾病易感基因确定的序幕,此后,一系列的常见多发疾病基因的GWAS研究,极大地丰富了人们对疾病发病机制的认识,加深了对疾病发生发展机制的认知。今天,疾病和基因关系仍是很长一段时间的重点工作,解析疾病基因,不但可以确定疾病的遗传易感性,有目的的开展预防、诊治,更

重要的是了解疾病新的致病机制,为分子诊断、分子靶向干预提供分子靶点。另一方面,药物作用靶点分子基因在人群的多态性,对药物作用的疗效影响;参与药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性(admet)的基因多态性,也会影响药物的疗效,即药物基因组方面的研究,必将成为后基因组时代的重要研究内容。以疾病基因组学和药物基因组学为代表的组学研究进展,将为个体化医疗、精准医学提供理论和实践基础。

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现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学:以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象,从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学:偏重于核酸(基因)的分子生物学,主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程,也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列(核苷酸、氨基酸)的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术(基因工程) ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学) ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间:19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一:肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二:噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括: ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑,标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些? ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5~10位获诺贝尔奖的科学家,简要说明其贡献。

分子生物学检验技术

1、分子生物学检验技术:是以核酸或蛋白质为分析材料,通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变,为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科。 2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用。(1)感染性微生物的检测。如:用PCR技术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解脲脲原体的检测等。(2)基因突变的检测。如:用PCR一限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测地中海贫血基因突变。 (3)法医学检测。如:用PCR微卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别。 (4)基因异常表达的检测。如:用cDNA表达的芯片技术进行基因异常表达的检测。 (5)基因定位。如:用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位。 3、基因组:是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。 4、基因:是基因组中一个功能单位,是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 5、原核生物:是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称,是最简单的细胞生物体。

6、操纵子结构:是原核生物基因组的功能单位。 7、质粒:是指细菌细胞染色体外,能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。 8、转座因子:又称为转座元件,是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。 9、原核生物基因组的结构特征: (1)原核生物基因组通常仅由一个DNA分子构成,基因组中只有一个复制起点,具有类核结构。 (2)具有操纵子结构,模板mRNA为多顺反子mRNA。编码区远远大于真核生物基因组,但又远远小于病毒基因组。在基因组中存在多功能的识别区域,如复制起始区、转录启动区和终止区等,这些区域常常含有反向重复序列。 (3)结构基因通常为单拷贝基因,编码顺序一般不重叠。(4)具有编码同工酶的基因。 (5)含有可移动的DNA序列。 10、病毒基因组的结构特点: (1)与细菌和真核生物基因组相比,病毒基因组结构简单,基因数少,所含信息量也少。 (2)病毒基因组的核酸类型较多,有双链DNA、单链DNA、双链RNA和单链RNA;有环状分子,也有线性分子。但无论是哪种核酸类型,一种病毒颗粒中核酸成分只能为一种,或

中南大学_医学分子生物学试题库答案.pdf

医学分子生物学习题集 (参考答案) 第二章基因与基因组 一、名词解释 1.基因(gene):是核酸中储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息 所必需的全部核苷酸序列。 2.断裂基因(split gene):真核生物基因在编码区内含有非编码的插入序列,结构基因 不连续,称为断裂基因。 3.结构基因(structural gene):基因中用于编码RNA或蛋白质的DNA序列为结构基因。 4.非结构基因(non-structural gene):结构基因两侧一段不编码的DNA片段,含有基 因调控序列。 5.内含子(intron):真核生物结构基因内非编码的插入序列。 6.外显子(exon):真核生物基因内的编码序列。 7. 基因间DNA (intergenic DNA):基因之间不具有编码功能及调控作用的序列。 8. GT-AG 法则 (GT-AG law):真核生物基因的内含子5′端大多数是以GT开始,3′ 端大多数是以 AG 结束,构成 RNA 剪接的识别信号。 9.启动子(promoter):RNA聚合酶特异识别结合和启动转录的DNA序列。 10.上游启动子元件(upstream promoter element ):TATA合上游的一些特定的DNA序 列,反式作用因子,可与这些元件结合,调控基因转录的效率。 11.反应元件(response element):与被激活的信息分子受体结合,并能调控基因表达的 特异DNA序列。 12.poly(A)加尾信号 (poly(A) signal) :结构基因末端保守的 AATAAA 顺序及下游 GT 或T富含区,被多聚腺苷酸化特异因子识别,在mRNA 3′端加约200个A。 13.基因组(genome):细胞或生物体一套完整单倍体的遗传物质的总称。 14.操纵子(operon):多个功能相关的结构基因成簇串联排列,与上游共同的调控区和下 游转录终止信号组成的基因表达单位。 15.单顺反子(monocistron):一个结构基因转录生成一个mRNA分子。 16.多顺反子(polycistron):原核生物的一个mRNA分子带有几个结构基因的遗传信息,

分子生物学笔

(gene) RNA DNA --(exon) --(intron) 5'-3'-(UTR) () (split-gene) (genome) () DNA 3X1 09(30bp)10 DNA C(C-value Paradox) human genome project, HGP genomics,structural genomics functional genomics proteome proteomics DNA (2--3) DNA• ()(>lO5) DNA(Satellite DNA) () 1 DNA () 2 (long interspersed repeated segments) LINES (Short interspersed repeated segments) SINES SINES<500bp>105Alu LINEs>1000bp(7Kb),104-105LINEl ()(Unique Sequence)

(gene family) (ancestral gene)(duplication) (gene cluster)(tandemly repeated genes)rRNA tRNA (Pseudogene) a1a1 (processed pseudogene) 1tRNA 1300tRNA tRNA 2rRNA >l00copy rRNA(28S18S 5.8s-rRNA) 3 30-40copy7q32-q36 (H1H2A H2B H3H4) intron Poly(A)- RNA 4 16p13(24Kb)5'------1--2--1--3' 11p15(60Kb)5'----Gr--Ar--------3' (Supergene family Superfamily) 1A1u 50-1003-6Kb Alu A1u300bp 2X130bp +31bp() 7-21bp(direct repeats)? Alu90%Alu Alu 2• • Variable number tamdem repeat VNTR DNA(minisatellite DNA) (6-40bp)(6-100) VNTR----DNA fingerprint. DNA H-Ras 3short tandem repeat,STR DNA microstallite DNA 2-6(10-60), l0kb

医学分子生物学讲义复习重点

分子生物学 1.ORF 答:ORF是open reading frame的缩写,即开放阅读框架。在DNA链上,由蛋白质合成的起始密码开始,到终止密码为止的一个连续编码列,叫做一个开放阅读框架。 2.结构基因 答:结构基因(structural genes)可被转录形成mRNA,并翻译成多肽链,构成各种结构蛋白质或催化各种生化反应的酶和激素等。 3.断裂基因 答:基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位,一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列,还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。真核生物的结构基因,由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成,去除非编码区再连接后,可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质,这些基因称为断裂基因(split gene)。 4.选择性剪接 答:选择性剪接(也叫可变剪接)是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程,而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性,或者,在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。 5.C值 答:基因组的大小通常以其DNA的含量来表示,我们把一种生物体单倍体基因组DNA的总量成为C值(C value)。 6.生物大分子 答:生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。 7.酚抽提法 答:酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出,通过改良,以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞,经蛋白酶K处理后,用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA,重复抽提至一定纯度后,根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 8.凝胶过滤层析 答:凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析,利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离,是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 9.多重PCR 答:多重PCR技术是在一个反应体系中加入多对引物,同时扩增出多个核酸片段,由于每对引物扩增的片段长度不同,可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。 10.荧光域值 答:荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,一般荧光阈值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。 11.退火 答:温度突然降至37-58℃时,变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢

医学检验本科班分子生物学检验技术试卷

医学检验本班《分子生物学检验技术》试卷 一. 选择题(在备选答案中选择一个最佳答案,每题2分,共20分): 1. 在核酸提取时,常需要使用氯化钠,醋酸钠等盐溶液,真正的目的是() A. 中和核酸的负离子,使其易于沉淀 B. 调节PH值 C. 保持核算的完整性 D. 提高核酸的浓度 E. 无特定目的 2. 在一个DNA分子中,如G所占摩尔比为17.2%,则A所占摩尔比为() A. 82.8% B. 32.8% C. 17.2% D. 65.6% E. 无法计算 3.下列那项不是扩增反应所必需的?() A. 引物和模板 B. dNTP C. Mg++ D .DNase E. 缓冲液 4. 下列那项是分子生物学技术形成的理论基础?() A. 基因结构与功能的关系 B. 基因结构变异与疾病的关系 C. 病原微生物的基因结构特征 D. 基因的表达.调控与疾病的关系 E. 以上皆是 5. 分子生物学检验技术主要包括那些技术?() A. 核酸分子杂交技术 B. DNA测序技术 C. PCR技术 D. DNA重组技术 E. 以上全是 6. 下列哪项检测需应用分子生物学检验技术?() A. 肝功能检测 B.乙肝两对半检测 C. 乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测 D. 肿瘤细胞培养 E. 病原微生物培养 7. 在核酸的分离纯化过程中,为保证其一级结构的完整性,应采取() A. 尽量简化分离步骤,缩短提取时间 B. 适当延长提取时间 C. 在37摄氏度条件下进行 D. 加入Mg++,Ca++等二价金属离子 E. 以上全是 8. 有一核酸样品,测得A260/A280=2.0,请问该样品属于哪类核酸样品?() A. DNA B. RNA C. 是DNA,但有蛋白质污染 D. 是RNA,但有蛋白质污染 E. DNA和RNA 9. 在RNA提取和纯化过程中,为避免Rnase污染而导致RNA的降解,应采取()

分子生物学复习资料 绝对重点

分子生物学复习资料 (第一版) 一名词解释 1 Southern blot / Northern blot—DNA斑迹法 / RNA转移吸印技术。是为了检测待检基因或其表达产物的性质和数量(基因拷贝数)常用的核酸分子杂交技术。二者均属于印迹转移杂交术,所不同的是前者用于检测DNA样品;后者用于检测RNA样品。 2 cis-acting element / trans-acting factor—顺式作用元件 / 反式作用因子。均为真核生物基因中的转录调控序列。顺式作用元件是与结构基因表达调控相关、能被基因调控蛋白特异性识别和结合的特定DNA序列,包括启动子和上游启动子元件、增强子、反应元件和poly (A)加尾信号。反式作用因子是能与顺式作用元件特异性结合、对基因表达的转录起始过程有调控作用的蛋白质因子,如RNA聚合酶、转录因子、转录激活因子、抑制因子。 3VNTR / STR—可变数目串联重复序列 / 短串联重复。均为非编码区的串联重复序列。 前者也叫高度可变的小卫星DNA,重复单位约9~24bp,重复次数变化大,变化高度多态性;后者也叫微卫星DNA,重复单位约2~6 bp,重复次数约10~60次,总长度通常小于150bp 。(参考第7题) 4 viral oncogene / cellular oncogene—病毒癌基因 / 细胞癌基因。病毒癌基因指存在于逆转录病毒中、体外能使细胞转化、体内能导致肿瘤发生的基因;细胞癌基因也叫原癌基因,指存在于细胞内,与病毒癌基因同源的基因序列。正常情况下不激活,与细胞增殖相关,是维持机体正常生命活动所必须的,在进化上高等保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异,基因产物增多或活性增强时,使细胞过度增殖,从而形成肿瘤。 5 ORF / UTR—开放阅读框 / 非翻译区。均指在mRNA中的核苷酸序列。前者是特定蛋白质多肽链的序列信息,从起始密码子开始到终止密码子结束,决定蛋白质分子的一级功能;后者是位于前者的5'端上游和3'端下游的、没有编码功能的序列,主要参与翻译起始调控,为前者的多肽链序列信息转变为多肽链所必需。 6 enhancer / silencer—增强子 / 沉默子。均为顺式作用元件。前者是一段含多个作用元件的短DNA序列,可特异性与转录因子结合,增强基因的转录活性,可以位于基因任何位置,通常在转录起始点上游-100到-300个碱基对处;后者是前者内含的负调控序列,结合特异蛋白因子时,对基因转录起阻遏作用。 7 micro-satellite / minisatellite—微卫星DNA / 小卫星DNA 。卫星DNA是出现在非编码区的串联重复序列,特点是有固定重复单位且重复单位首尾相连形成重复序列片段,串联重复单位长短不等,重复次数大小不一。微卫星DNA即STR;小卫星DNA分为高度可变的小卫星DNA(即VNTR)和端粒DNA。(参考第3题) 8 SNP / RFLP—单核苷酸多态性 / 限制性片段长度多态性。前者是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,它是人类遗传变异中最常见的一种,占所

分子生物学检验技术

分子生物学检验技术 _______期日______ _名___签__任__主__室__研_教名课姓任_ _ ____________名__签__员_教号题学出_ ________________员__教_课次任班学__教_ _ _ _ _ _ ______________次__班_核别考队______数人核考湖北医药学院2011-2012学年第二学期《分子生物学检验技术》期末考试试卷湖北医药学院 A、内含子 B、外显子 C、DNA D、质粒 E、重叠基因 … ………《分子生物学检验技术》期末考试试卷(C卷)8、对染色体端粒进行的显带称为 A、C显带 B、D显带 C、G显带 D、Q显带 E、T显带 ……… 9、染色质和染色体是 ……题目一二三四五总分核分人复查人A、同一物质在细胞中的不同时期的两种不同的存在形式B、不同物质在细胞中的不同时期 ……得分的两种不同的存在形式C、同一物质在细胞的同一时期的不同表现D、不同物质在细胞的… 同一时期的不同表现E、染色质是染色体的前体物质 ……… 10、物理图是以什么作为图距 线…评卷人得分 A、摩尔 B、摩尔根 C、纳米 D、重组频率 E、kb …… 一、A型题(40小题,每小题1分,共40分) …11、下列哪一项不属于真核生物基因组的特点 … ……1、A、重复序列B、断裂基因C、单拷贝序列D、DNA多态性E、多顺反子结构

HTLV基因组中tax基因编码的蛋白是 …12、据调查,糖尿病的单卵双生同病率为84%,双卵双生同病率为37%,根据遗传病研究的 ……A、对病毒的结构蛋白的表达有调节作用B、对病毒的调节蛋白的表达有调控作用C、一种…反式激活因子D、激活细胞的IL-6基因E、激活细胞的IL-2基因双生子法,可以计算出糖尿病的遗传率为 …封…2、A、100%B、75%C、60%D、50%E、25% 腺病毒基因组不正确的是 …13、两条非同源染色体同时发生断裂,断片交换位置后重接,结果造成 …A、腺病毒基因组是环状双链DNA B、两条链分别称为轻链和重链C、每条链的5’端都…与蛋白质结合D、腺病毒DNA采用半保留复制方式E、腺病毒可引起人类许多急性感染 A、缺失 B、倒位 C、重复 D、插入 E、易位 ………3、基因图是指 14、线粒体基因组DNA的结构一般认为类似于 ……A、EST B、STS C、STR D、YAC E、STR A、原核生物 B、大肠埃希菌 C、质粒 D、病毒 E、真核生物 ………4、α -卫星DNA可由哪种限制性内切酶消化获得 15、发生基因点突变的结、直肠癌中约80%的突变位于 密…A、Alu B、HindⅢC、HinfI D、KpnI E、EcoRI A、K-ras12位密码子突变 B、K-ras13位密码子突变 C、K-ras61位密码子突变 D、H-ras12…位密码子突变 E、N-ras61位密码子突变 ……5、下列哪项不属于Alu家族的特点 …16、与遗传性高发乳腺癌相关的基因是 …A、属于短分散重复片段B、有AGCT序列C、能被AluI切割D、无种属差异E、有调…控作用 A、APC B、BRCA C、DCC D、FHIT E、Rb

(珍贵)浙江大学05-12年博士医学分子生物学真题

2012浙江大学医学分子生物学(乙)回忆版: 一.名词解释(3分*5) 1.The Central Dogma 2.Telomere 3.nuclear localization signal, NLS 4.Protein Motif 5.Splicesome 二.简答题:(5分*9) 1.一个基因有哪些结构组成? 2.基因、染色体、基因组的关系? 3.表观遗传机制改变染色质结果的机制? 4.内含子的生物学意义? 5.什么是蛋白质泛素化?其生物学意义是什么? 6.蛋白质纯化的方法? 7.MicroRNA是什么?它如何发挥作用? 8.什么是全基因组关联研究(Genome Wide Association Studies,GWAS)?其研究目的是什么? 9.分子生物学研究为什么需要模式生物? 三.问答题:(10分*4) 1.人体不同部位的细胞其基因组相同,为什么表达蛋白质的种类和数量不同? 2.用分子生物学知识,谈谈疾病发生机制? 3.有一块肿瘤组织及癌旁组织,设计一个实验证明细胞内蛋白质在肿瘤发生发展中的作用? 4.目前,基因靶点研究已成为新药开发的用药部分,结合目前药物靶点在新药开发中的应用,谈谈你的建议和观点?

2011浙江大学博士入学考试医学分子生物学试题回忆 一、英文名解 1、冈崎片段: 2、反式作用因子: 3、多克隆位点: 4、micro RNA: 5、分子伴侣: 二、简答 1、蛋白质四级结构。 2、真核转录调控点。 3、表观遗传学调控染色质。 4、真核RNA聚合酶类型及作用。 5、基因突变。 6、组学概念及举例。 7、简述兔源多克隆抗体的制备。

分子生物学笔记完全版

分子生物学笔记第一章基因的结构 第一节基因和基因组 一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列. 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控 序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene) ,外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和,基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp),共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值,与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划( human genome project, HGP ) 基因组学( genomics ),结构基因组学( structural genomics )和功能基因组学( functional genomics )。 蛋白质组( proteome )和蛋白质组学( proteomics ) 第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点:, ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中. ②真核基因组中,编码序列只占整个基因组的很小部分(2 —>% ), 三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因. 可能由某一共同祖先基因(ancestral gene) 经重复(duplication) 和突变产生。 基因家族的特点: ①基因家族的成员可以串联排列在一起,形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes),如 rRNA、tRNA和组蛋白的基因;②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上,如珠蛋白基因;③有些成员不产生 有功能的基因产物,这种基因称为假基因(Pseudogene) . ¥ a1表示与a1相似的假基因. 四、超基因家族(Supergene family ,Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族,结构上有程度不等的同源性,但功能不同. 第四节细菌和病毒基因组 一、细菌基因组的特点。 1 .功能相关的几个结构基因往往串联在—起,受它们上游的共同调控区控制,形成操纵子结构,2.结构基因中没有内含子,也无重叠现象。 3 .细菌DNA大部分为编码序列。 二、病毒基因组的特点 1 .每种病毒只有一种核酸,或者DNA,或者RNA ; 2 .病毒核酸大小差别很大,3X10 3 一3X106bp ; 3.除逆病毒外,所有病毒基因都是单拷贝的。 4 .大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA),仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成. 5. 真核病毒基因有内含子,而噬菌体(感染细菌的病毒)基因中无内含子. 6. 有重叠基因. 第五节染色质和染色体 (二)组蛋白(histone): 一类小的带有丰富正电荷<富含Lys,Arg)的核蛋白,与DNA有高亲和力. (二).端粒(telomere) :真核生物线状染色体分子末端的DNA 区域端粒DNA的特点: 1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb). 人的端粒DNA重复序列:TTAGGC。

医学分子生物学

第一章总论 一、名词解释: 1.单体、有效部位2.一次代谢产物、二次代谢产物3.有效成分、无效成分 4.正相色谱、反相色谱5.水/醇法、醇/水法 二、填空题: 1.溶剂提取法中选择溶剂的依据__________。 2.色谱法按其基本原理分为________、________、________、________。 3.硅胶为________性吸附剂,适于分离________成分,化合物的极性越大,与吸附剂吸附得越____,越_____被洗脱下来。 4.凝胶色谱法分离天然产物中大分子时,主要依据化合物____________差异。 5.葡聚糖凝胶的商品型号是按其交链度大小分类,并以________表示。英文字母G代表________,后面的阿拉伯数字表示凝胶的吸水量再乘以________的值,如G-25的吸水量为________。 6.分配层析是利用各成分在的两相溶剂中不同而进行分离的层析方法。 7.聚酰胺吸附属于________吸附,是一种用途十分广泛的分离方法,特别适于分离________、________、________类化合物。 8.硅胶活化温度________,时间________,超过________丧失吸附力,硅胶含水量达________不能作吸附剂使用,只能作分配色谱。 9.中药液体制剂常采用“水提醇沉”法,水可以提取如糖类、_________、________、_______ 等成分,醇沉可以沉淀________、__________等物质。 10.使用混合溶剂重结晶时,一般是将样品先溶于__________的溶剂中,在加热的情况下滴加__________溶剂直至__________,再稍滴加__________溶剂使__________后让其渐渐析晶。 11.纸色谱的原理属__________,特别适合于________成分的分离鉴定,如_________、_________、__________等。 12.聚酰胺在含水溶剂中的吸附能力大致有三个规律①__________②__________③__________。 13.硅胶、氧化铝吸附剂的用量一般为试样量的__________倍,试样极性较小、难以分离者, 吸附剂用量可适当提高至试样量的__________倍。 14.TLC展开时,使组分R f值达到__________的溶剂系统可选用为柱色谱分离该相应组分的 最佳溶剂系统。 15.活性炭是__________吸附剂,对__________物质具有较强的吸附力,在水溶液中吸附力 __________,在有机溶剂中吸附力__________。 16.常见的极性有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇等,欲从水提取也重萃取极性成分,

分子生物学检验完整版

1病原生物基因组在医学上有何应用?详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因,原癌基因有什么特性,原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些? 原癌基因是指人类或其他动物细胞(以及致癌病毒)固有的一类基因,能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的 基因总称。 特性:进化上高度保守,负责调控正常细胞生命活动,可以转化为癌基因。 功能分类:生长因子,生长因子受体,信号转导蛋白,核调节蛋白,细胞周期调节蛋白,抑制凋亡蛋白 激活机制:插入激活,基因重排,基因点突变,基因扩增,基因转录改变 3试述Down综合征(21三体综合征)的主要临床特征及核型。 临床特征:生长发育障碍,智力低。呆滞面容,又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力低,50%患者有贯通手,男患者无生育能力,女患者少数有生育能力,遗传风险高。 核型:92.5%患者游离型:核型为47,XX(XY),+21 2.5%患者为嵌合型:46, XX(XY)/47 ,XX(XY),+21 5%患者为易位型:46,XX(XY),-14 ,+t(14q21q) 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点,对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检:敏感度和特异性差,不能用于确诊。 2分离培养法:诊断NG感染的金标准,但是其对标本和培养及营养要求高,培养周期长,出报告慢,难以满足临床要求。 3免疫学法:分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制,推广受限。 分子生物学的优点:敏感,特异,可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌,适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中,点突变检测常用方法有哪些? 1异源双链分析法(HA)2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法 6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸(DNA RNA)的检测、基因分型和耐药基因分析 等。 1PCR技术:选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术:正向杂交和反向杂交,后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术:RFLPRAPD电泳核型分析 AP —PCR技术:定义方法简便,快速,特别适合临床应用 DNA序列分析:可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术:适用于病原体的耐药研究 7、 F VIII基因倒位导致血友病A,DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良,珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 (第11章,P197,P203,P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了) 答:F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因(占50%)其它基因突变,如点突变,缺失,插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良(杜氏肌营养不良)发生的主要原因(60%-70%)。 珠蛋白合成障碍性贫血有六种,主要的两种是a珠蛋白生成障碍性贫血和B珠蛋白生成障碍性贫血,基因突变是主要发病原因。&基因多态性有哪些的临床应用?(P4)

医学分子生物学试题答案

名词解释: 基因是核酸中贮存遗传信息的遗传单位,是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 基因组(gencme):细胞或生物中,一套完整单倍体遗传物质的总和(包括一种生物所需的全套基因及间隔序列)称为基因组。基因组的功能是贮存和表达遗传信息。 SD序列(Shine-Dalgarno sequence,SD sequence) 是mRNA能在细菌核糖体上产生有效结合和转译所需要的序列。SD序列与16S rRNA的3’末端碱基(AUUCCUCCAC-UAG-5’)互补,以控制转译的起始 分子克隆:克隆(clone):是指单细胞纯系无性繁殖,现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构,引入适当的宿主细胞中去,在合适的生理环境中进行无性繁殖,从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构,并进行表达。由于整个操作在分子水平上进行,所以称为分子克隆(molecular cloning)。 动物克隆(Animal cloning)就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法. 基因诊断:就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法,直接检测基因结构 (DNA水平)及其表达水平(RNA水平)是否正常,从而对疾病做出诊断的方法。 基因治疗就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治疗方法,是指有功能的目的基因导入靶细胞后有的可与宿主细胞内的基因发生整合,成为宿主细胞遗传物质的一部分,目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。 转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中,并在细胞基因组中稳定整合,再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来,采用借腹怀孕法寄养在雌性动物(foster mother)的子宫内,使之发育成具有表达目的基因的胚胎动物,并能传给下一代。这样,生育的动物为转基因动物。 探针:在核酸杂交分析过程中,常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。 限制性核酸内切酶:限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一类专门切割DNA 的酶,它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列并切割dsDNA。 载体:要把一个有用的基因(目的基因-研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。 限制性片段长度多肽性分析(RFLP):DNA片段长度多态性分析(restriction fragment length polymer-phism,RFLP)基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制酶对不同个体基因组进行消化时,其电泳条带的数目和大小就会产生改变,根据这些改变可以判断出突变是否存在。 简答题: 1.蛋白质的生物合成过程中的成分参与,参与因子,作用? mRNA是合成蛋白质的“蓝图(或模板)” tRNA是原料氨基酸的“搬运工” rRNA与多种蛋白质结合成核糖体作为合成多肽链的装配机(操作台) tRNA mRNA是合成蛋白质的蓝图,核糖体是合成蛋白质的工厂,但是,合成蛋白质的原料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此,需要转运RNA把氨基酸搬运到核糖体中的mRNA上 rRNA 核糖体RNA(rRNA)和蛋白质共同组成的复合体就是核糖体,核糖体是蛋白质合成的场所。

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医学分子生物学复习资料

蛋白质、糖蛋白与蛋白聚糖、脂蛋白、细胞信号传导 名词解释: 1、构型:指一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列不经过 共价键的断裂和重新形成是不会改变的。不同构型之间相互转化会涉及化学键 的断裂,构型的改变往往使分子的光学活性发生变化。 2、构象:构成分子的原子和基团因为化学键的旋转而形成在三维空间的不同的 排布、走向。不同的构象之间可以相互转化而不涉及化学键的破裂。构象改变 不会改变分子的光学活性。 3、肽平面:肽键具有部分双键性质而不能自由旋转,这样C、N 原子同它们连接的 O、H和两个 Cα共六个原子就被约束在一个刚性平面上,这个平面被称为肽平面。 4、基序或模体:相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体称为超二级 结构,是特殊的序列或结构的基本组成单元,又称为基序或模体。 5、结构域:蛋白质的超二级结构进一步组合折叠成半独立紧密的球状结构域。 6、糖蛋白:在分子组成中以蛋白质为主,其一定部位以共价键与若干糖链(约4%)相连所构成的分子。 7、蛋白聚糖:蛋白聚糖是一类由蛋白质和糖胺聚糖通过共价键相连而成的化合物,其分子中的含糖量通常为50%~90%。 8、血脂:血浆所含的脂类统称为血脂,它包括甘油三酯、磷脂、胆固醇及游离 脂酸。 9、血浆脂蛋白:在血浆中血脂与蛋白质结合,形成血浆脂蛋白。 10、载脂蛋白:血浆脂蛋白中蛋白质部分称为载脂蛋白。 11、脂蛋白受体:脂蛋白受体是一类位于细胞膜上的糖蛋白,它们能以高亲和 性的方式与其相应的脂蛋白配体相互作用,介导细胞对脂蛋白的摄取和代谢, 从而进一步调节血浆脂蛋白和血脂的水平。 12、细胞通讯( cell communication):指一个细胞发出的信息通过介质传递 到另一个细胞产生相应反应的过程。

分子生物学检测技术简介

分子生物学检测技术简介 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶,是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来,分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展,先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术(Polymerase Chain Reaction, PCR),以及90年代发展起来的DNA芯片技术(DNA Chip),又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。 一、核酸分子杂交 (一)概述:具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。到目前为止,分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位,它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种,前者应用较广,有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交(三明治杂交)、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面:待测的DNA 或RNA,以及用于检测的DNA或RNA探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。 1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱,可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。 2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同,不同的是它检测mRNA而不是DNA,因此可分析和了解基因的表达状态。由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解,所以整个操作过程须特别小心。 3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上(无需限制酶酶解),与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合,具有简捷快速的特点,一次可做大批量样品的筛查,适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列,同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上,通过预杂交以除去非特异位点,然后以标记探针进行杂交。标记物有多种,以同位素标记的探针杂交后,可通过放射自显影分析结果,而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后,需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体),再经过显色反应后,利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠,但灵敏度偏低,而且操作复杂,因此大大限制了该技术的普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术近几年,bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和

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