噬菌体展示肽库说明说 中文版
应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使用手册
含tet选择性F因子的新大肠杆菌宿主菌：不再需要minimal平板
贮存于：-20℃
目录：
简介 (2)
培养基和溶液 (5)
常规M13方法 (6)
淘选程序（固定靶分子） (8)
结合克隆的特征 (12)
其他淘选方法（液相结合法） (15)
其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16)
附录：优化肽结合相互作用 (19)
文库的氨基酸分布 (21)
试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）：
?随机十二肽噬菌体展示文库100 μl, 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度~2.7×109个转化子。
? -28 gIII测序引物5’-HO GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/μl
? -96 gIII测序引物5’-HO CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/μl, 1 pmol/μl
? E.coli ER2738宿主菌F’ lacI q Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (Tet R)/fhuA2 supE thi Δ
(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (r k –m k–McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。
? 链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg
? 生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。该产品仅售为研究用，不得以任何形式进行商业再销售。用该类产品发现的序列的商业化可能需要来自Dyax公司的美国专利5,223,409、
5,403,484和/或5,571,698及其相关专利权的授权。有关授权信息请与Dyax Corp. 的企业发展部主管联系：Director of Corporate Development, Dyax Corp., Bldg. 600, Cambridge, MA 02139, fax 617-225-2501。
概述：
噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体（见图1）。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。
展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。
Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是
野生型pIII 蛋白。该文库含有~2.7×109个电转化序列，用10 μl 本品提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生~55个拷贝，对原始文库进行大量测序（见附录）表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。建议不要扩增原始文库来进行另外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象。
NEB 应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列（见图2）。大量实验证明，任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的DNA 序列。
培养基和溶液：
LB 培养基：
每升含：10 g Bacto-Tryptone ，5 g yeast extract, 5 g NaCl 。高压灭菌，室温贮存。
LB/IPTG/Xgal 平板：
LB 培养基 + 15 g/L 琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml IPTG/Xgal*，混匀倒平
板。平板4℃避光贮存。
顶层琼脂：
每升含：10 g Bacto-Tryptone ，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl 2·6H 2O, 7 g 琼脂粉。高压灭菌，分成50 ml 等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。
四环素贮液：以20 mg/ml 的浓度溶于乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。
LB-Tet 平板：LB 培养基 + 15 g/L 琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml 四环素贮
液，混匀倒平板。平板4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。
封阻缓冲液：0.1 M NaHCO 3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN 3。过滤除菌，4℃贮存。 TBS:
50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl 。高压灭菌，室温贮存。
PEG/NaCl:
20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl 。高压灭菌，室温贮存。
碘化物缓冲液：
10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaCl 。室温避光贮存。
链霉亲和素贮液：
将1.5 mg 链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于1 ml 10 mM 磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl 、
0.02% NaN3溶液中。4℃或-20℃贮存，避免反复冻融。
*IPTG/Xgal 配方：将 1.25 g IPTG (isopropyl β–D-thiogalactoside)和 1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于25 ml 二甲基甲酰胺中。溶液-20℃避光贮存
常规M13方法：
M13不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。
菌株保存
1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强F +
菌株，生长迅速，特别适合于M13噬菌体的增殖。尽管
ER2738是一个recA +菌株，但我们在使用M13或噬菌粒载体的过程中从未发现有体内重组现象发生。其他F +的商品菌株如：DH5αF’和XL1-Blue 或许可以代替ER2738应用,但未曾用本系统检验过。
2. 由于M13是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，建议用于M13增殖的所有菌液都是从F 因子
正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。ER2738的F 因子上含有一个小转座子，赋予该细胞四环素抗性，因此可以在含四环素的平板上铺板筛选含F 因子的细胞。
3. 从随产品提供的ER2738甘油菌划线接种LB-Tet 平板，倒置平板37℃培养过夜。用封口膜
封闭平板后4℃避光保存，最长可达一个月。
4. 用于感染噬菌体的ER2738菌液既可以在LB也可以在LB-Tet培养基中生长。只要不对培养
物进行连续稀释，在非选择性培养基中F因子的丢失并不严重。
避免噬菌体污染
M13噬菌体的衣壳蛋白pIII通过与受体菌的F性纤毛相结合而介导感染。与野生型噬菌体相比，外源蛋白或多肽融合在pIII蛋白的N端展示明显降低了文库噬菌体的感染力。因此，当有任何野生型噬菌体污染时，每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌体，如果同时没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免，即使痕量水平的污染也会在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。
1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境中噬菌体的可能性大大
降低。
2. 由于文库噬菌体源于常规克隆载体M13mp19，其含有lacZα基因，当铺在含IPTG和Xgal 的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色噬菌斑，同时这些噬菌斑还会比文库噬菌体的噬菌斑更大更模糊。因此所有的滴度检测步骤，建议一定要在LB/IPTG/Xgal培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色噬菌斑进行测序。
测定噬菌体滴度
只有当噬菌体的感染复度MOI (multiplicity of infection)值远低于1时（即细胞过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。
1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD
600
~0.5）。
2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。
保存于45℃备用。
3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108
-10
11
；未扩增的淘选洗脱物：10
1
-10
4
。每个
稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
6. 每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。
7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预
温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
8. 待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。
9. 检查平板，计数有~102
个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl
噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。第一天根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-或24-孔板、96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板（或一个孔）。下述方法中给出的量是60×15 mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，
其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：1.5×1011个病毒子。
1.准备100 μg/ml的靶分子溶液（溶于0.1 M pH 8.6的NaHCO3）。如果需要稳定靶分子，
也可使用其他相似离子强度的缓冲液（含金属离子等）。
2.每板（孔）加入1.5 ml（微孔板每孔150 μl）上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润（小
心不要使溶液溅出）。
3.在增湿容器（如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒）中4℃轻微震荡，孵育过夜。平板可在
此容器中4℃贮存备用。
第二天
4.挑ER2738单克隆（噬菌体滴度测定时铺的板）于10 ml LB液体培养基中。如果同一天扩
增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20 ml LB液体培养基，这时请用250 ml三角瓶（不要用50 ml锥形管）。37℃剧烈震荡培养。
5.倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板（或孔）加
满封阻液，4℃作用至少1 hr。
6.按5中所述方法除去封阻液。再用TBST (TBS+0.1% [v/v] Tween-20)缓冲液快速洗板6次。
每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液（或使用自动洗板机）。此操作要快以避免板干燥。
7.用1 ml（微孔板则用100 μl）的TBST缓冲液稀释4×1010的噬菌体（即10 μl的原始文库），
然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60 min。
8.倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。
9.按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。
10.根据所研究的分子间相互作用，用1 ml（微孔板则用100 μl）适当的洗脱缓冲液洗脱结
合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1 mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液（~100 μg/ml溶于TBS中）从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60 min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。
10a.另外，也可用非特异性缓冲液如0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA来分离已结合的分子：温和摇动>10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150 μl（微量孔则用15 μl）1M HCl（pH 9.1）中和上述洗脱液。
11.按上述常规M13方法中的程序测定少量（~1 μl）洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第
二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。（必要时可将剩余洗脱物4℃贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20 ml LB中（用250 ml三角瓶盛装），加入未扩增洗脱物。37℃剧烈摇动培养4.5 hr，继续第13步）。
12.剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20 ml ER2738培养物中（菌体应当处于对数前
期），37℃剧烈摇动培养4.5 hr。
13.将培养物转入一离心管中，然后，4℃ 10,000 rpm离心10 min。上清液转入另一离心管
中，再离心。
14.将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀至少60
min，最好过夜。
第三天
15. 4℃10,000 rpm离心PEG沉淀15 min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。
16. 沉淀物重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5 min使残余细胞沉淀。
17. 上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60 min。
4℃离心10 min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。
18. 沉淀物重悬于200 μl TBS, 0.02% NaN3中。离心1 min，沉淀任何残余的不溶物。上清转
入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。
19. 根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。
20. 再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，见第8页步骤1-3。
第四和第五天
21. 计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于1-2×1011 pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109 pfu的噬菌体加入量进行试验。
22. 进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中1-2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5% (v/v)。
23. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。
24. 再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，见第8页步骤1-3。
第六天
25. 进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5% (v/v)的Tween。
26. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，除非还要进行第四轮淘选（可选步骤，见附录）。滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4℃贮存。
27. 挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜（不要接种稀释后的铺板培养物）。
对照淘选试验
按照上述程序，以链霉亲和素作为靶分子，在封阻液中加入0.1 μg/ml的链霉亲和素以结合BSA 中混有的少量生物素。用0.1 mM的生物素（溶于TBS中）洗脱结合噬菌体，至少作用30 min。经三轮富集/扩增后，得到的链霉亲和素结合肽的共有序列应当含有如下基序：
His-Pro-Gln (HPQ) (8)。
结合克隆的特征鉴定
噬菌斑的扩增
1.将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1 ml到培养管中。每个要鉴定的克
隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。2.用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述1 ml培养管中。注意：要从总量不到100个噬
菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。
3.37℃摇床培养
4.5-5 hrs（不要过长）。
4.备选步骤。除测序单个克隆外，也可以对整个被选噬菌体集合进行测序。这样只通过一个
步骤就可以得到共有结合序列，但这种情况只是当公有序列元件出现在每个克隆的12残基“框架”内相同位置的时候。加10 μl未扩增的洗脱物到1 ml稀释的过夜培养物中，37℃摇床培养4.5-5 hrs。
5.培养物转入微量离心管中，离心30 sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80%
的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20℃贮存。
测序模板的快速纯化(22)
本方法非常快速，无需酚或层析，可以产生足够纯的模板进行手工或自动双脱氧测序。
1.按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500 μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。
2. 加200 μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10 min。
3.离心10 min，弃上清液。
4. 短暂离心，小心吸去残余上清。
5. 沉淀物彻底重悬于100 μl碘化物缓冲液中，加入250 μl乙醇。室温温育10 min。短时间的室
温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。
6.离心10 min，弃上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。
7.沉淀重悬于30 μl TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA]中。
8. 5 μl的上述模板溶液足够进行35S或33P标记的手工双脱氧测序, 或染料标记的自动循环双脱氧测序。根据测序方法的不同, 适当增减模板用量。
测序指南
1.建议用-28引物进行手工双脱氧测序，而-96引物应用于自动测序。
2.所读序列相应于模板的反义链。然后将互补链写出，与图3中的上链对照进行检查。检查随
机区域内每个密码子的第三位是否为G或T。根据图4所列的遗传密码表由此链翻译得到氨基酸序列。
3.本文库的宿主菌为ER2738 (supE), 在此菌株中，终止密码子TAG被谷氨酰胺(Gln)所抑制。
因此翻译时，应将TAG翻译为谷氨酰胺（见图4）。用ELISA检测所选多肽对靶分子的结合 1. 在扩增噬菌斑进行DNA测序（见12页）时，将所剩余的含噬菌斑上清4℃保存。2. 对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，接种一管ER2738于20 ml LB培养基中，37℃培养至稍微浑浊。
或者，也可以将过夜培养的ER2738按1:100的比例稀释于20 ml LB培养基中。3. 于每管ER2738培养液中加入5 μl噬菌体上清，37℃通气培养4.5hrs。
4.上述培养物转入离心管中，10,000 rpm离心10 min。上清移入新鲜离心管，再离心。
5.取80%上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀至少1 hr或过夜。
6.4℃10,000 rpm 15 min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。
7.沉淀重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管，4℃离心5 min除去沉淀中的残留细胞。
8.上清转入新鲜微量离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用15-60 min。4℃离心10
min，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。
9.沉淀重悬于50 μl TBS中，按6-7页常规M13方法中所述测定噬菌体滴度。4℃贮存。
10. 用100-200 μl 100 μg /ml的靶分子(溶于0.1 M pH 8.6 NaHCO3中)包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆一排包被孔。在密封的湿盒（如：排有湿纸巾的封口塑料盒）中4℃包被过夜。11. 甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液。每孔加满封阻液。另外，每个
待鉴定克隆的一排未包被孔也加入封阻液，以检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力。
在将噬菌体加入靶分子包被板前，还要再准备一个微量滴定板进行噬菌体的系列稀释，这个板也要封阻。单独在另外一个封阻板中进行稀释是为了避免稀释过程中有噬菌体吸附到靶分子上。最后，所有封阻板4℃封阻1-2 hrs。
12. 甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween
浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同。
13. 在单独的封阻板中每孔预先加入200 μl TBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒子开
始对噬菌体进行4倍系列稀释至第12孔2×105个病毒子。
14. 用多通道移液器将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中。室温震荡作用1-2 hrs。
15. 用1×TBS/Tween洗板6次（同步骤12）。
16. 在封阻液中以1:5,000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体（Pharmacia #27-9411-01）。
每孔加入200 μl稀释抗体，室温震荡作用1 hr。
17. 用1×TBS/Tween洗板6次（同步骤12）。
18. 按下述方法准备HRP底物溶液：
ABTS贮液可以提前准备：将22 mg ABTS（Sigma #A1888）溶于100 ml 50 mM的柠檬酸钠溶液（pH 4.0）中，过滤除菌，4℃贮存。对每个待检测板，于检测步骤前将36 μl 30%的H2O2加入21 ml ABTS贮液中。
19. 每孔加200 μl底物溶液，室温作用10-60 min。
20. 用读板仪记录405-415 nm处的吸光值。
其他淘选方法 (液相结合法)
除直接用靶分子包被平板外，也可以使靶分子和噬菌体在液相中反应，然后亲和捕获噬菌体/靶分子复合物。根据靶分子的不同，液相结合可能会产生比表面结合更好的结合动力学特征，还会避免塑料表面的靶分子有部分变性的问题。亲和捕获要求在靶分子上有某种亲和tag ，通常的做法是将靶分子生物素化，然后用固定化的链霉亲和素捕获靶分子/噬菌体复合物。 靶分子的生物素化
1. 将2 mg 靶蛋白溶于1 ml 50 mM 的NaHCO 3 (pH 8.5) 中，为了保持靶蛋白的稳定性，也可用
其他缓冲液，但不要用含游离氨基的缓冲液（如：Tris ）。
2. 用前，溶解1 mg Sulfo-NHS-LC-生物素(可从Pierce 购买，货号 #21335)于1 ml 水中，震荡
混匀。加74 μl 此溶液到靶蛋白溶液中，本试剂为生物素的水溶性活性酯，可以特异性地结合到溶液中（或表面）赖氨酸残基的ε-氨基上。剩余的未用溶液应抛弃，因为贮存期内此酯很容易就会水解掉。
3. 将管冰上放置2 hrs 。
4. 透析除去未反应的生物素，对1升TBS 缓冲液进行透析，至少更换两次透析液，也可用凝胶
过滤或Centricon TM
（Amicon ）等超滤装置。
5. 用Bradford 或Lowry 方法对生物素化蛋白进行定量。靶蛋白的生物素化可用商品抗生物素抗
体进行Western 检测或ELISA 得以证实。通过染料HABA [2-(4’-hydroxyazobenzene)benzoic acid] (可从Pierce 购得, 货号 #28010)颜色转换比色试验可以对靶蛋白的生物素化程度进行定量测定。根据NEB 的结果显示，上述反应条件可使每个蛋白分子平均标记两个生物素化赖氨酸。
淘选
基本与8-10页的程序相同，只是用链霉亲和素[100 μg/ml 链霉亲和素溶于0.1 M NaHCO 3 (pH 8.6)中]而不是用靶蛋白分子包被板。封阻液应含有0.1 μg/ml 的链霉亲和素以结合BSA 封阻液中含有的生物素。并用下述步骤代替淘选试验中的步骤7。
7a. 封阻板时（步骤5），预先将噬菌体与生物素化靶蛋白分子结合。即：在微量离心管中混合
0.1 μg 生物素化靶蛋白（对25 kDa 蛋白来说 ~10 nM 终浓度）和1.5×1011 pfu 的投入噬菌体（原始文库10 μl 的量）于400 μl TBS 中, 室温作用10-60 min 。为了保证靶蛋白的稳定性，也可使用相同离子强度的其他缓冲液（含金属离子等）。
7b. 将噬菌体-靶蛋白溶液加入到已清洗过的封阻板中，室温温育10 min 。
7c. 加入生物素至终浓度0.1 mM 继续温育5 min ，这一步骤将直接结合在链霉亲和素上的噬菌
体（即那些展示有HPQ 序列的噬菌体）从板上置换下来。而生物素化靶蛋白从链霉亲和素上解离的速度是非常慢的，所以该浓度的生物素不会将生物素化靶蛋白置换下来。继续第8页第8步。 其他测定抗原表位的方法 (用Protein A/G 捕获法进行液相结合)
除了在固定于表面的抗体上进行淘选试验外，还可以先让文库与抗体在液相中反应，然后用Protein A 和/或Protein G-琼脂糖珠对抗体-噬菌体复合物进行亲和捕获。这种液相淘选每个试验所需的抗体量远少于表面淘选试验，而且噬菌体展示肽更容易接近抗体上的抗原结合位点，也避免了抗体在塑料板表面的部分变性现象。用Protein A-琼脂糖和Protein G -琼脂糖交替淘选可以避免偶尔选择到特异性结合到Protein A 或Protein G 上的肽序列的可能性。不能与Protein A 很好结合的抗体（如：绵羊、山羊、鸡和大鼠多克隆抗体，以及人IgG 3和小鼠IgG 1单克隆抗体），可以在所有淘选实验中选用Protein G-琼脂糖。
本方法简便易行，只要有合适的捕获融合蛋白的亲和介质，就可以用任何与亲和tag 融合的靶蛋白对多肽文库进行淘选。
1. 接种ER2738 (可用滴度测定时铺板的菌)于10 ml LB 液体培养基中, 如果同一天还要扩增洗
脱下来的噬菌体，就同时接种ER2738于20 ml LB 液体培养基中（用250 ml 的三角瓶培养，
不要用50 ml 的培养管）。37℃剧烈震摇培养。
2. 吸取50 μl Protein A-琼脂糖介质（50%的水悬液）于微量离心管中，加1 ml TBS+0.1% Tween
(TBST)溶液。轻弹管壁或温和震荡重悬介质。对于山羊、鸡、绵羊和大鼠多克隆抗体，以及人IgG 3亚类单克隆抗体，每轮淘选中的这一步均用Protein-G 。如果结合及清洗缓冲液(TBS)的pH 可达8.6，小鼠IgG 1亚类单克隆抗体也可使用Protein A 。
3. 用台式微量离心机（Capsulefuge TM
或其他）低速离心30 sec 沉淀介质，小心吸去上清，注意
不要使介质悬起。
4. 介质重悬于1 ml 封阻缓冲液中，4℃作用60 min 。
5. 作用其间，用TBS 缓冲液将1.5×1011个噬菌体粒子（相当于10 μl 原始文库）和300 ng 抗
体稀释至终体积200 μl ，抗体终浓度为10 nM 。室温作用20 min 。
6. 封阻反应后，按步骤3沉淀介质，并用1 ml TBS 洗4次，每次均需沉淀介质。
7. 将噬菌体-抗体混合物加入洗过的介质中，温和混匀，室温作用15 min 并不时混匀。
8. 按步骤3沉淀介质，弃上清，用1 ml TBTS 洗10次。
9. 重悬沉淀介质于1 ml 0.2 M 的Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA 中, 洗脱结合的噬菌体，室
温作用10 min 。
10. 用台式微量离心机离心洗脱混合液1 min ，小心将上清转入一新鲜微量离心管中，注意不要
吸起沉淀的介质。
11. 立即用150 μl 1 M Tris-HCl, pH 9.1中和洗脱液。
12. 在LB/IPTG/Xgal 平板上测定一小量洗脱液的滴度。方法按常规M13方法中所述，6-7页。
13. 剩余洗脱液应被扩增：加洗脱液到20 ml ER2738培养物（此时应处于对数早期）中，37℃
剧烈摇动培养4.5 hrs 。（或者，洗脱物4℃贮存过夜，第二天扩增。这样的话，应做ER2738在LB-Tet 中的过夜培养，第二天，按1:100的比例稀释于20 ml LB 中，同时加入未扩增洗脱液，250 ml 三角瓶37℃剧烈震摇培养4.5 hrs 。）
14. 培养物转入离心管中，4℃ 10,000 rpm 离心10 min 。上清转入新鲜离心管再离心。
15. 80%的上清转入另一新鲜离心管，加1/6体积的20% PEG , 2.5 M NaCl 。使噬菌体4℃沉淀2 hrs
或过夜。
16. 4℃ 10,000 rpm 离心PEG 沉淀15 min 。弃上清，再短暂离心后吸去残余上清。
17. 沉淀重悬于1 ml TBS 中，悬液转入一微量离心管，4℃离心5 min 沉淀残留细胞成分。
18. 上清转入一新鲜微量离心管，再用1/6体积的PEG/NaCl 重新沉淀。冰上作用15-60 min 。
4℃微离心10 min 。弃上清，再短暂离心，用吸头除去残余上清。
19. 沉淀重悬于200 μl TBS, 0.02% NaN3中。离心1 min 沉淀任何不溶性物质。上清转入一新鲜
管中。此即为扩增的洗脱液。
20. 按常规M13方法（6-7页）中所述，在LB/IPTG/Xgal 平板上测定扩增洗脱液的滴度。4℃
贮存。
21. 第二天，计数板上蓝斑数目确定噬菌体滴度。并用这个值计算对应于1-2×1011 pfu 的输入
噬菌体体积。如果滴度太低，可以用低至109 pfu 的输入噬菌体量再进行几轮淘选。
22. 进行第二轮淘选试验：用第一轮扩增洗脱物中相应于1-2×1011 pfu 的量作为输入噬菌体量
重复步骤1-21。用Protien G-琼脂糖而不是Protein A-琼脂糖，并将结合和清洗缓冲液中Tween 的浓度提高至0.5%（v/v ）。
23. 进行第三轮淘选试验：用第二轮扩增洗脱物中相应于1-2×1011 pfu 的量作为输入噬菌体量
重复步骤1-21。如果第一轮用的是Protein A-琼脂糖，那么这一轮还用Protein A-琼脂糖，保持结合和清洗缓冲液中Tween 的浓度仍为0.5%（v/v ）。预算好滴度测定步骤地时间，使LB/IPTG/Xgal 板培养时间不超过18 hrs ，因为培养时间过长可能会产生缺失。
24. 挑选10个或更多的噬菌斑扩增噬菌体，并按12-13页所述方法制备DNA 测序模板。
25. 如果第三轮测序的克隆中没有明显的共有序列，则扩增第三轮的剩余洗脱物（步骤13-21），
用Protein G-琼脂糖进行第四轮淘选。
附录
优化肽结合相互作用
有几个变量会影响淘选过程中的选择严格程度。根据所研究的相互作用的不同，调整选择或洗脱的强度对获得结合肽共有序列是必需的。
1. 去污剂：在结合或清洗Buffer中添加去污剂（通常是Tween-20）能降低噬菌体与靶分子和/
或封阻试剂BSA之间的非特异性相互作用。最初几轮淘选中用较低浓度的Tween会增加洗脱物滴度，然后每轮逐渐增加Tween浓度（最大可到0.5%）来逐步提高选择的严格性。然而，在同步实验中，我们用0.5%恒定Tween浓度和逐步增加的Tween浓度（0.1, 0.3, 0.5%）分别进行三轮淘选，获得了相同的共有序列。当所研究的相互作用特异性比较强，以至于最初几轮淘选洗脱物的滴度（即：可结合序列的数目）可能会非常低时，建议初始几轮淘选使用较低的Tween浓度。
2. 温度：根据所研究的结合相互作用是焓驱动还是熵驱动，可以通过提高结合步骤的温度来分
别增加和降低选择的强度。建议试用的结合温度为：4℃、室温和37℃。温度可以高至55℃而不失活噬菌体。
3. 结合和洗脱时间：结合时间短，易于筛选到快速结合（kon）的小肽；相反，洗脱时间长，
容易筛选到解离速度（koff）慢的小肽。由于小肽结合到靶分子上的结合平衡常数ka等于kon /koff，那么，就可以通过缩短结合时间和延长洗脱时间的方式来提高筛选的严格度。在最后几轮淘选试验中，洗脱可以在两个阶段进行：在短时间内洗脱的噬菌体抛弃，长时间洗脱下来的噬菌体进行下一轮淘选或铺板。如果用pH 2.2的甘氨酸缓冲液洗脱，时间不要长于10 min，否则噬菌体的感染性会降低。
4. 靶分子的浓度：如果在液相中对靶分子进行淘选，可以通过降低靶分子的浓度来提高淘选的
严格程度(23)。建议用10 nM的初始靶分子浓度，在最后几轮筛选纳摩尔级亲和力配体时也可将浓度降低到1 nM。
5. 淘选轮数：每经一轮淘选扩增试验，就会使能与靶分子结合的肽序列在噬菌体库中得到富
集。保持每轮的噬菌体加入浓度相同，就会使展示特定结合序列的病毒子在库中的含量逐步增加，直到大多数或所有洗脱粒子都会展示一个共有序列。根据所研究的相互作用和所施加的筛选严格度的不同，通常会在2-3轮淘选后能达到这种情况。如果3轮淘选后也没有明显的共有序列发现，则第三轮的洗脱物应当继续扩增进行第四轮淘选试验。
6. 文库的选择：如果三或四轮淘选后，仍没有明显的配体共有序列发现（或者所有的噬菌斑都
呈白色），可能就是所用文库中不含有能与靶分子紧密结合的序列克隆。对这种现象的解释是：统计上理想配体序列太少或不存在（不具代表性）（见21-22页）；或者，肽分子不能以足够强的亲和力与靶分子结合而被筛选，这种情况下用Ph.D.-C7C文库会更好一些，此文库中，所有展示肽结构均被局限于一个7-残基二硫loop环内，其结合构象比以线性形式表达的肽文库更有效、结合更紧密（由于结合熵得到改善）；最后，如果配体仅要求在一个短的区域内有几个结合位点，那么Ph.D.-7肽文库可能是一个更好的选择。由于十二肽库提供了更大的随机区域，就会有利于选择到有多个弱结合位点的序列，而不是只有少数几个强结合位点的序列。这时，Ph.D.-7肽文库可能更有利于共有序列的出现。然而遗憾的是，在缺乏靶分子-配体相互作用的详细结构信息时，是不可能预测哪一种文库能产生最好的结合配体的。
请浏览我们的网站: https://www.wendangku.net/doc/c04353067.html,，查阅适时更新的常见问题与回答（FAQ）。
Ph.D.TM文库中的氨基酸分布
由原始文库中随机挑选104个克隆进行测序，有6个克隆（5.8%）不含展示肽插入序列。剩下的1176个测序密码子（98个克隆×12个随机密码子）中氨基酸分布如下：
*预期频率= 该氨基酸的密码子数÷32个密码子×100%。注意在文库构建过程中精简了遗传密码的使用：NNK（32个密码子）。
?展示肽序列中含有精氨酸或单个半胱氨酸会干扰pIII蛋白的分泌和噬菌体的感染力；因此十二肽序列中含有精氨酸或半胱氨酸的克隆很难选到（24）。
?在文库增殖菌株中终止密码子TAG被的抑制，可以接受Gln残基。
文库中特定肽基序出现概率的计算
十二肽噬菌体展示文库中含某一给定肽基序的可能性（概率）可用下述经验数据来计算：
1. 将特定肽基序中每个残基的观测频率即observed frequency（以小数形式表示，见上表）相乘，
即得到获得该序列的绝对概率p值。如果此肽基序的长度小于12氨基酸残基，则p应当再乘以此肽基序可在十二肽“框架”内出现的各种方式数（即：6肽乘以7，5肽乘以8等等）。
2. p乘文库复杂度n (2.7×109)得到文库内展示目的肽基序的克隆的预期数λ。
3. 文库中有k个克隆展示目的肽基序的可能性P (k)可用Poisson分布来计算，
P (k) = e-λλk/k!。当k=0（即：文库不含目的肽基序）时, P (0) = e-λ = e-np 。
4. 因此，文库中至少有一个克隆展示目的肽基序的可能性即为P (k>0) = 1- P (0) =1- e-np 。
示例：噬菌体展示文库中含六肽基序Gly-Ala-Arg-Cys-Ile-Ala的可能性为多少？
1. 由前表可知:
p (Gly-Ala-Arg-Cys-Ile-Ala) = (.026)(.060)(.047)(.005)(.034)(.060)×7 = 5.2×10-9。一定要乘以7，因为目的六肽基序可以从随机十二肽的第1-7位开始。
2. λ = np = (2.7×109) (5.2×10-9) = 14。我们可望文库中有大约14个克隆展示序列
Gly-Ala-Arg-Cys-Ile-Ala。
3. P (k>0) = 1- e-np= 1- e-14 = 0.9999。可见文库中至少含有一个拷贝目的肽基序的可能性几乎达
到100%。
噬菌体展示肽库技术的研究及应用进展
2010.01
2010.01 的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。 3噬菌体肽库的筛选技术 如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌 体是肽库技术的关键。经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有 Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。3.1 宿主菌直接洗脱 经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。 3.2双层膜筛选系统 获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特 异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选 效率。 3.3选择性感染噬菌体筛选系统 传统的筛选系统中基因重组的噬菌体仍有野 生型的gene Ⅲ蛋白的存在，因重组噬菌体具有感染能力，这导致在筛选后扩增时特异性和非特异性的噬菌体均可以进入宿主菌增殖。选择性感染噬菌体筛选系统把筛选和扩增合并为一步，只有特异性的噬菌体才能感染宿主菌扩增，而非特异性噬菌体却不能。此筛选系统是以噬菌体感染宿主菌的机理为基础，其基本原理是把其中之一用特定的多肽或蛋白替代，使噬菌体丧失感染力，再通过这些多肽与其配基的结合恢复感染能力。这样只有特异性的噬菌体可以通过配基配体结合才能恢复感染能力，进入宿主菌细胞内繁殖[9]。具体的做法有两种，其一是将噬菌体所有P Ⅲ外壳蛋白的N 端用所展示的多肽或蛋白取代，使其丧失感染能力，再把与所筛选的目的多肽或蛋白的特异配基同P Ⅲ蛋白的N 端相连作为筛选的探针，只有特异 性噬菌体才能与连接有P Ⅲ蛋白N 端的配基相结合，这种结合使噬菌体重新具有P Ⅲ蛋白的N 端，因而具有感染力；其二是将作为配基的多肽或蛋白融合在E.coli 的纤毛上，这样纤毛失去了介导的能力，只有特异性的噬菌体可与修饰了的纤毛结合，从而恢复纤毛的介导能力，使特异性的噬菌体进入细胞体内增殖，这一系统显示了较高的筛选效率。 4噬菌体肽库的应用4.1 抗原表位的研究 传统的抗原表位分析主要是通过分析抗原经 物理化学降解得到的片段或人工合成一系列来源于抗原的肽段与相关抗体的结合活性而得到，此方法成本高，必须首先确定蛋白质的氨基酸序列，才能合成相应的肽，而在实际研究中，许多蛋白质的序列并不清楚。噬菌体肽库技术将抗体作为受体暴露于肽库中，筛选到能与特异性抗体相结合的重组噬菌体肽的序列，弥补了合成肽筛选的不足。在抗原-抗体的识别研究中，不必源于天然抗原，可以从随机肽库中直接筛选出能和抗体结合的表位。尽管有时与天然表位在氨基酸顺序上可能不一致，但是
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用 1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd 作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白——D蛋白融合而被展示。2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质[6]。3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直
噬菌体展示总结技术
噬菌体展示总结技术 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：噬菌体展示技术 噬菌体展示技术 关键词：噬菌体展示组装融合蛋白2008-07-21 00:00 来源：互联网点击次数：3662 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。本文主要概述了噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体展示系统研究以及技术特点等，并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。 关键词：噬菌体展示；组装；融和
蛋白 1985年，Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。 另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。 一、噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳
蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。思想汇报专题被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集 [2]。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。 二、噬菌体展示系统 单链丝状噬菌体展示系统 （1）PⅢ展示系统。 丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝
噬菌体随机肽库_中文说明书_phage_display
目录 简介 (2) 培养基和溶液 (5) 常规M13方法 (6) 淘选程序（固定靶分子） (8) 结合克隆的特征 (12) 其他淘选方法（液相结合法） (15) 其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16) 附录：优化肽结合相互作用 (19) 文库的氨基酸分布 (21) 试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）： ?随机十二肽噬菌体展示文库100 μl, 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度~2.7×109个转化子。 ?-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/μl ?-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/μl, 1 pmol/μl ?E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。 ?链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg ?生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。 概述 噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因
噬菌体抗体库技术(1)
噬菌体抗体库技术 张爱华 余模松 【摘要】 噬菌体抗体库技术是20世纪90年代继噬菌体展示技术发展而来。这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。本文对与基因工程抗体相关的噬菌体展示技术以及噬菌体抗体库技术作一综述。 【关键词】 噬菌体展示技术;噬菌体抗体库技术;免疫抗体库 【中图分类号】R 392.11 【文献标识码】A 【文章编号】1673-4211(2006)01-0013-04 作者单位:430060武汉生物制品研究所免疫学研究室 20世纪80年代,随着DNA 重组技术的进展和抗体基因结构的阐明,产生了基因工程抗体技术。早期用于构建基因工程抗体的抗体基因主要来源于小鼠杂交瘤细胞。由于要获得杂交瘤细胞必须经过动物免疫、细胞融合及克隆筛选这样一个长期、复杂的过程;而且利用杂交瘤技术很难制备人源抗体和抗自身抗原或弱免疫原性抗原的抗体,所以限制了基因工程抗体技术的推广和应用。20世纪90年代,人们又将噬菌体展示技术应用到抗体的表达和克隆,将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因文库和抗体在大肠杆菌功能性表达与高效快速的筛选手段结合起来,产生了噬菌体抗体库技术,这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,由此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术[1]。 1 噬菌体展示技术 1985年Smith [2]首次阐述了噬菌体展示技术,该技术通过将外源蛋白或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该外源分子呈现于噬菌体表面。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内,即在噬菌体表面表达特定蛋白,而在噬菌体核心DNA 中含有该蛋白的结构基因,通过表型筛选就可以获得其编码基因,因此噬菌体展示技术是一种强有力的基因表达筛选技术。 蛋白质可以展示在更小的丝状噬菌体颗粒的表面,这就是噬粒展示系统[3] 。噬粒的基因组中包含丝状噬菌体的基因间隔区,包括病毒颗粒和互补链合成的复制起始点以及发夹包装信号,同时也含 有质粒的复制起始点和抗性基因。噬粒也可以像质粒一样操作,假如需要,可以直接在细菌中表达目的蛋白。采用丝状辅助噬菌体感染细菌可以激活噬菌体的复制起始点,从而导致单链噬粒DNA 被包装进由辅助噬菌体蛋白形成的丝状噬菌体样的颗粒中,由于辅助噬菌体缺乏包装信号,所以产生的大多数噬菌体为含有噬粒单链DNA 的颗粒[4],将这种噬粒和噬菌体混合物感染细菌,筛选具有抗性的克隆,这种带抗性的克隆只含有噬粒DNA,可再次通过辅助噬菌体的感染进行扩增。由于噬粒颗粒可以传播抗性基因,所以有时又把这种颗粒称为“转导颗粒”。 p Ⅲ蛋白是一种最常用于展示外源片段的噬菌体外壳蛋白。其缺点是每个噬菌体颗粒表面仅有5个p Ⅲ分子,但是它的优点是带大的插入片段的p Ⅲ分子可以被很好地包装进噬菌体颗粒中。在绝大多数情况下,外源蛋白插入在信号序列和p Ⅲ蛋白第一结构域(N 1)的起始位点之间,一方面外源蛋白不影响噬菌体的包装,另一方面,外源蛋白位于包装颗粒的最末端,所以当通过p Ⅳ蛋白孔时,其空间位阻较小。但问题是大片段的插入降低了噬菌体的感染能力,甚至使噬菌体无感染性,因此限制了某些特殊蛋白的选择。这一问题可以通过杂交噬菌体得到解决,即仅有一个p Ⅲ分子用于展示蛋白,具体方案是将外源蛋白构建到噬粒载体中,转化细菌后,再用辅助噬菌体超感染,这样细菌中的大多数p Ⅲ蛋白为来源于辅助噬菌体的野生型分子[5] 。噬菌体展示活性蛋白的能力主要依赖于以下几个方面的因素,比如融合蛋白能否被正确地转移到细菌内膜,能否正确地折叠,能否在外周质中逃避降解以及能否被包装进噬菌体颗粒中。外源蛋白也可以插入到p Ⅲ蛋白的N1和N2以及N 2和CT 结 ? 13?国际生物制品学杂志2006年2月第29卷第1期 Int J Biolog icals,February 2006,Vol 29,No.1
噬菌体展示技术解析
噬菌体展示技术解析 噬菌体展示技术经过近20年的发展和完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体展示系统模拟了自然免疫系统，使我们有可能模拟体内抗体生成过程，构建高亲和力抗体库。由于噬菌体展示技术实现了基因型和表型的有效转换，使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段。另外，噬菌体展示技术已成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途径，为获取对人类和动物疾病有诊断和治疗价值的单克隆抗体提供了重要手段。 应用面这么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘的面纱！ 一、噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术（phage display）是将多肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。展示到噬菌体表面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构和生物活性，可以与靶分子结合和识别。噬菌体展示的肽库或蛋白库与固相抗原结合，洗去未结合的噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。下图粗略展示了技术筛选的过程： 二、噬菌体展示系统的分类 1.M13噬菌体展示系统 M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4kb，编码10种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ和次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ和PⅨ。其中，pⅢ和PⅧ是噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了pⅢ和PⅧ展示系统。pⅢ蛋白分子量为42 kDa，
噬菌体展示技术操作步骤
筛选多肽 试剂及配制 （1）LB培养基： 胰蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 5g 溶于去离子水，至1L，高压灭菌，4℃保存。 （2）IPTG/Xgal： 称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。（3）LB/IPTG/Xgal平板： 1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。 （4）顶层琼脂糖凝胶： 胰蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 5g MgCl2.6H2O 1g 琼脂糖7g 溶于适量去离子水中，至总体积为1L。高压灭菌，分装为50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。 （5）2×M9盐： Na2HPO412g KH2PO46g NaCl 1g NH4Cl 2g 溶于适量去离子水中，至终体积为1L。 （6）小型平板： 500ml 2×M9盐 500ml 3%琼脂粉 20ml 20%葡萄糖 2ml 1M MgSO4 0.1ml 1M CaCl2 1ml 硫胺素（10mg/ml） 在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。平板储存于4℃。 （7）封闭缓冲液： 0.1M NaHCO3(PH 8.6) 5mg/ml BSA 0.02% NaN3 过滤除菌，储存于4℃。 （8）TBS： 50mM Tris-HCl (PH 7.5) 150mM NaCl
高压灭菌，室温储存。 （9）PEG/NaCl： 20%（w/v）聚乙二醇-8000 2.5M NaCl 高压灭菌，室温储存。 （10）碘化物缓冲液： 10mM Tris-HCl (PH 8.0) 1mM EDTA 4M NaI 室温避光保存。 操作步骤： 1．第一天 （1）以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制备 100μg/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。 （2）在每孔内加入1.5ml 靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。 （3）在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。 2．第二天 （4）将ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至10ml LB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中（比例为1：100）。37℃剧烈振摇。 （5）将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1h。 （6）去除包被液。用TBST（TBS+0.1%Tween-20）快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。按照步骤5的方法去除洗涤液（也可利用自动洗板机洗涤）。洗涤要迅速，避免平皿干燥。（注意每次更换纸巾，以避免交叉污染）。 （7）用1ml TBST稀释4×1010噬菌体（10μl原库），加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。 （8）以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。 （9）以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。 （10）用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体（0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白（100μg/ml）的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10-60min。将洗脱液转入微量离心管中。 （10a）或使用通用缓冲液，0.2M甘氨酸-盐酸（PH2.2），1mg/ml BSA。轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μl 1M Tris-HCl(PH 9.1)中和。 （11）取小量洗脱液（1μl）测定滴度，如果有必要，可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序（见后续操作）。（未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1：100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5h，进入步骤13）。 （12）将剩余的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入20ml ER2537培养物中（对数早期），37℃剧烈振摇孵育4.5h。 （13）将培养物转入微量离心管中，4℃，10000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。 （14）将80%的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/ NaCl。4℃沉淀噬菌体至
噬菌体展示肽库说明书
ProteIn tooLS Ph.D.? Phage Display Libraries Instruction Manual neB #e8100S, #e8101S, #e8102L, #e8110S, #e8111L, #e8120S, #e8121L Store at –20°C
table of Contents: Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Media and Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 General M13 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7 Construction of pIII-Display Libraries using M13KE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 Panning Protocols Protocol 1: Surface Panning Procedure (Direct Target Coating) . . . . . . . . .14 Protocol 2: Solution-phase Panning with a Biotinylated Target and Streptavidin Plate Capture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18 Protocol 3: Solution-phase Panning with Affinity Bead Capture . . . . . . . . .19 Post Panning Protocols Plaque Amplification for ELISA or Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 Sequencing of Phage DNA Rapid Purification of Sequencing Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 Phage ELISA Binding Assay with Direct Target Coating . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Use of Synthetic Peptides in Specificity Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 Expression of Selected Sequences as Monovalent MBP Fusions . . . . . . . . . . . . . . . .27 Appendix: Optimizing Peptide Binding Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29 Choice of Library . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Selection of Cell-Specific Peptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38 Ordering Information . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 1
噬菌体展示肽库说明说 中文版
应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使用手册 含tet选择性F因子的新大肠杆菌宿主菌：不再需要minimal平板 贮存于：-20℃ 目录： 简介 (2) 培养基和溶液 (5) 常规M13方法 (6) 淘选程序（固定靶分子） (8) 结合克隆的特征 (12) 其他淘选方法（液相结合法） (15) 其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16) 附录：优化肽结合相互作用 (19) 文库的氨基酸分布 (21) 试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）： ?随机十二肽噬菌体展示文库100 μl, 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度~2.7×109个转化子。 ? -28 gIII测序引物5’-HO GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/μl ? -96 gIII测序引物5’-HO CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/μl, 1 pmol/μl ? E.coli ER2738宿主菌F’ lacI q Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (Tet R)/fhuA2 supE thi Δ (lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (r k –m k–McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。 ? 链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg ? 生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。该产品仅售为研究用，不得以任何形式进行商业再销售。用该类产品发现的序列的商业化可能需要来自Dyax公司的美国专利5,223,409、 5,403,484和/或5,571,698及其相关专利权的授权。有关授权信息请与Dyax Corp. 的企业发展部主管联系：Director of Corporate Development, Dyax Corp., Bldg. 600, Cambridge, MA 02139, fax 617-225-2501。 概述： 噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体（见图1）。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是
病原微生物第4章 噬菌体习题与答案
第 4 章噬菌体 一、填空题 1.噬菌体的主要化学组成是____________和____________。 2.整合在细菌基因组中的噬菌体基因组称为___________，带有噬菌体基因组的细菌称为______________。 3.根据噬菌体与宿主菌的相互关系，可将噬菌体分为__________和_________。 4.毒性噬菌体的复制周期包括____________、_________、_________、________。 二、判断改错题 1.噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 2.噬菌体感染宿主菌具有高度特异性，是一种专性细胞内寄生的真核细胞型微生物。 3.严格寄生在敏感宿主菌细胞内只有裂解期，而无溶原期的噬菌体称为溶原性噬菌体。 三、选择题 【A型题】 1.溶原性细菌是指 A.带有毒性噬菌体的细菌 B.带有前噬菌体基因组的细菌 C.带有 R 因子的细菌 D.带有 F 因子的细菌 E.带有 Coi 因子的细菌 2.前噬菌体是指 A.整合在宿主菌染色体上的噬菌体基因组 B.尚未装配好的噬菌体 C.毒性噬菌体 D.未感染宿主菌的噬菌体 E.未整合到宿主菌染色体上的噬菌体 3.下列致病菌中，产生毒素与噬菌体有关的是 A.霍乱弧菌 B.大肠杆菌 C.肺炎杆菌 D.白喉杆菌 E.破伤风梭菌 4.关于噬菌体的叙述，哪一项是错误的？ A.侵袭细菌、真菌、螺旋体等微生物的病毒 B.主要由核酸和蛋白质组成 C.由严格的宿主特异性 D.对理化因素的抵抗力比一般细菌强 E.每个噬菌体都含有 RNA和 DNA 【X 型题】 1.噬菌体的特性有 A.能通过滤菌器 B.没有完整的细胞结构 C.只含有一种核酸 D.专性活细胞寄生 E.以复制方式生长繁殖 3.毒性噬菌体溶菌周期的步骤有 A.吸附 B.穿入 C.生物合成 D.组装成熟 E.释放 四、名词解释 1.噬菌体（phage） 2.毒性噬菌体（virulent phage） 3.溶原性噬菌体活温和性噬菌体（lysogenic phage or temperate phage） 4.溶原性细菌（lysogenic bacterium）
基因工程 考试 重点 噬菌体载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作 练习题 噬菌体载体(练习题) 一、填空题 1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。 3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。它有一个复制起点，进行向复制。λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做位点。4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。 5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。 6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来 自，最大的克隆片段达到kb。 7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为个，取代型为个。 8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1) (2) (3) 。 12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。 13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为 kb，后者为kb。 14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。 二、判断题 1. 取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在),DNA 中具有两个切 点，外源DNA 通过取代这两个切点间的片段被克隆。 2. 现在最常用的pUC 载体是pUCl8,它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制。另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA。 3. 噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9 载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，既能合成单链DNA,又能合成双链DNA。 4. λ噬菌体DNA 和M13 单链噬菌体DNA 在成熟前的DNA 复制都是用滚环模型。 5. M13 噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100 个子代噬菌体。 6. 以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量
!噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用
第13卷第1期 2005年1月 中国兽医寄生虫病 Chinese Journal of Veterinary Parasit ol ogy Vol .13No .1 Jan .2005 收稿日期:2004208209 噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用 王欣之 傅志强 (中国农科院上海家畜寄生虫病研究所,上海200232) 摘 要:本文主要介绍了噬菌体展示系统的原理,并就噬菌体表面展示系统的不同表达载体类别,分别做了描述,同时讨论该展示系统在抗原表位研究上的应用。关键词:噬菌体展示;随机肽库;抗原表位 中图分类号:Q939.48 文献标识码:A 文章编号:100520868(2005)0120042204 PHAGE D I SPLAY RAN DOM L I BRAR Y AND I TS APPLY I N EP I TO PE RESEARCH WANG W in 2zhi,F U Zhi 2qiang (Shanghai Institute of D o m estic A ni m al Parastitology,Shanghai 200232,China ) Abstract: This paper maj ors in intr oducing the p rinci p le of phage dis p lay syste m ,and describing the s orts of this syste m individually as different exp ress vect or .Furher more,we discusse the app licati on of this syste m es pecial 2ly in ep it ope research . Key words: phage dis p lay;random library;ep it ope 抗原表位(ep it ope )或抗原决定簇(antigen de 2ter m inant )一般有两种类型:一种是连续抗原表位,其氨基酸序列在一级结构上是连续的;另一种是不连续的,由一级结构上不连续的氨基酸残基经过肽链的空间折叠而聚集在一起形成的。研究抗原表位的方法很多,对于连续的抗原表位一般采用合成一系列部分重叠的小肽来确定表位的位置以及每个氨 基酸残基的作用[1] ,对于不连续的抗原表位,则可以采用表面模拟合成(surface si m ulati on synthesis )技术等。这些方法都有很大的局限性:需要预先知道该表位的一级结构的序列或结构信息。 随机肽库(Random pep tides library,RP L )是包括了20种氨基酸所有可能排列的多肽的组合体。按表达载体的不同,随机肽库又分噬菌体、质粒、细菌、核糖体等表面展示随机肽库和化学合成的随机肽库等,其中表面展示的随机肽库及其筛选技术最成熟,应用也最广泛。 1 噬菌体展示的基本原理 S m ith (1985)最先将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ,使目的基因编码的多肽能以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,从而创建了噬菌体展示 技术[2] 。 噬菌体展示技术是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术。这项技术的主要原理是将蛋白质或多肽的DNA 序列插入到噬菌体颗粒外壳蛋白的一个结构基因的适当位置,外源基因随外壳蛋白的表达而表达,由于被修饰了的外壳蛋白仍然保持与噬菌体颗粒的兼容性,外源基因产物随病毒颗粒的 重新组装而展示到病毒外壳蛋白的表面[3] 。被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立空间结构和生物活性。通过反复的亲和选择和扩增,可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些地区生物活性并分离出带有目的基因的噬菌体。 2 噬菌体表面展示系统 按表达外源蛋白的噬菌体类别的不同,可将噬 菌体展示系统分为丝状噬菌体展示系统、 λ噬菌体