抗病毒药物病毒学研究申报资料要求的指导原则

抗病毒药物病毒学研究申报资料要求的指导原则

一、概述

病毒感染是危及人类健康和生命的疾病之一，目前已有很多抗病毒药物上市应用，但仍不能完全满足临床治疗的需求。近年来国

内外相关制药企业不断投入大量资金研发抗病毒药物，抗病毒药物

的注册申请也逐渐受到各方面的关注。

根据试验数据撰写的非临床和临床病毒学研究报告是审评抗病毒药物的临床试验申请和上市申请的重要资料。本指导原则旨在帮

助研发抗病毒药物或生物制品（例如：治疗性蛋白和单克隆抗体）的申请人初步了解哪些非临床和临床病毒学研究数据对于抗病毒药物或生物制品申报临床试验或申请上市是最关键的。

本指导原则主要关注非临床和临床病毒学研究报告，同时对需要收集和提交的耐药性研究数据提出了建议。讨论的主要问题包括：

●明确作用机制

●确定所研究药物特定的抗病毒活性

●评价所研究药物与其他可能合用的抗病毒药之间发生相互作用的可能性

●提供病毒对所研究药物产生耐药性的研究数据

●提供所研究药物与已上市的其他相同作用靶点抗病毒药物的交叉耐药性的研究数据

二、背景

近年来，国内外在抗HIV-1药物的研究方面积累了大量的经验，

也取得了很多进展。因此，本指导原则以抗HIV-1药物为范例，介绍抗病毒药物病毒学研究的一般原则。尽管不同病毒的检测方法和模型系统有较大的差异，但本指导原则的许多抗HIV药物研发的原则适用于治疗其他病毒感染（如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、流感病毒、鼻病毒、巨细胞病毒及人乳头瘤病毒等国内常见病毒）的抗病毒药物的研发。病毒学领域研究发展日新月异，所以，当积累了新的资料或出现相关需求时，我们将对本指导原则进行修订。

三、非临床病毒学研究

非临床病毒学研究有助于在进行人体试验前评价药物的有效性和安全性。建议申请人进行药物的作用机制、药物在模型系统中的特定抗病毒活性的研究，并提供对药物产生耐药的病毒学数据。此外，临床上常将一种药物与其他已上市的治疗相同适应症的药物联合使用，因此，最好通过体外试验研究两种或两种以上药物联合用药的抗病毒活性，以便发现所研究药物与其他抗病毒药物之间可能存在的相互作用（如拮抗、协同、增强、叠加等），尤其应关注负面的相互作用。

由于已上市的抗病毒药物很多，交叉耐药（病毒对一种药物耐药后，对同类的其他药物也产生了耐药性）可能会成为临床应用中的一个主要问题。因此，在抗病毒药物的研发过程中，下列信息显得非常重要：

测定所研究药物对相同作用靶点的其他已上市药物的耐药病毒株的抗病毒活性。

测定已上市药物对由相同作用靶点的所研究药物诱导的耐药病毒株的抗病毒活性。

申请人在开始I期临床试验前应先进行非临床研究（如作用机制研究、体外抗病毒活性研究、耐药性研究，以及血清蛋白结合率对抗病毒活性影响的研究等）。

如果病毒有合适的体外感染模型系统，在开始旨在考察所研究药物与其他抗病毒药物合用疗效的临床试验前，申请人应完成所研究药物与其他已上市的针对此病毒药物合用的体外活性研究，如针对相同靶点有多种已上市的药物和研究药物，应从每一类药物中至少选一种有代表性的药物进行研究。

在对感染某一种病毒的患者进行临床试验前，应先通过体外试验诱导对所研究药物耐药的病毒株，并鉴定耐药病毒株的表型和基因型及交叉耐药性。

（一）作用机制研究

在I期临床试验前应进行作用机制研究。充分掌握药物的作用机制对于临床试验的设计非常重要，可使研究者了解病毒基因组中发生导致耐药性突变的可能区域，这些区域不仅限于所研究药物作用的靶位（病毒编码的靶点），也可能包括酶的底物或靶蛋白复合物中存在的另外的病毒或宿主编码蛋白。耐药性突变的鉴定结果也可以为机制研究和临床研究提供依据。

病毒生命周期中的许多阶段都可以成为潜在的抗病毒药物的作用靶点。药物可以通过作用于病毒特异性的编码功能而发挥直接的抗病毒作用（如酶抑制剂），或者通过其他途径而发挥间接的抗病毒作用（如干扰素

诱导的宿主细胞应答）。建议进行如下作用机制研究：

●证明药物具有特异性地抑制病毒复制或抑制病毒特定功能的能力。

●确定药物作用的靶点（如病毒复制酶、蛋白酶等）或作用于病毒复

制的哪个阶段（如病毒进入、入核等）。

申请人可提供支持其药物作用机制的生物化学、结构学、细胞学、遗传学等方面的数据。证明药物作用机制的数据包括但不仅限于受体结合、抑制酶活性、确定抑制剂与受体复合物结合的X-光晶体结构、编码靶蛋白基因的耐药性突变位点的鉴定等。

应比较所研究药物对病毒靶点及细胞或宿主蛋白作用的选择性，当宿主细胞中存在或可能存在与病毒酶类似的酶时，此点尤其重要。例如，如果药物的作用靶点是病毒聚合酶，建议申请人证明该药物对病毒聚合酶的抑制活性，同时比较其对宿主细胞的DNA聚合酶（如DNA聚合酶α、β及γ）的抑制活性。

研发免疫调节剂还应注意更多问题。此类药物会对机体的免疫系统产生作用，因而可能会对病毒的复制起不到抑制作用，或者对机体产生其他不良影响。对于通过刺激全身免疫反应而发挥作用的免疫调节剂，建议申请人证实其抗病毒活性，并鉴定出参与作用的免疫分子或免疫细胞。

（二）抗病毒活性

1.体外抗病毒活性

许多感染人体的病毒可以在细胞培养系统或动物宿主体内完成完整的生命周期。在这样的情况下，建议申请人在开始I期临床试验前先通过体外试验证明所研究药物和/或其代谢产物的特异的、可定量的抗病毒活性。这些数据应能清楚地证明在体内、在可接受的风险/收益比的情况

下达到的药物浓度具有抗病毒作用，从而为人体试验提供支持，这一点非常重要。此外，使用相关的细胞和病毒临床分离株进行的体外抗病毒活性和细胞毒性评价[见第三部分（三）细胞毒性和治疗指数]可以指导早期临床试验选择合适的剂量范围。

鼓励申请人使用人靶细胞的原代培养细胞进行抗病毒活性研究。由于病毒的基因容易发生变异，所以应使用多种临床分离株考察所研究药物的抗病毒活性，临床分离株应能代表临床试验中的病毒群。建议进行的抗病毒活性研究包括：

●评价所研究药物对一系列病毒实验室适应株和临床分离株（包括

不同的亚群（clades）、亚型(subtypes)或基因型(genotypes)）的特

异性抗病毒活性。

●评价所研究药物对相同作用靶位或复合物药物耐药的病毒株、对

其他已上市具有相同适应症的药物耐药的代表性耐药病毒株的抗

病毒活性。

应使用定量的检测方法，在不同浓度药物的条件下测定病毒的复制，并与不添加药物的测定结果进行比较，确定药物的剂量依赖的特异性抗病毒活性。

药物的有效浓度是指使病毒复制的水平降低50%的浓度（细胞培养试验中用EC50表示，生物化学或亚细胞试验中用IC50表示）。评价药物的抗病毒活性和细胞毒性的方法包括但不局限于病毒灭活试验、空斑减数试验、细胞病变效应抑制试验、病毒抗原或核酸检测、感染性病毒颗粒检测、含报告基因的病毒或细胞检测等。可能影响这些试验的因素包括病毒感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）和给药时间（如病毒

感染前给药或感染后不同时间给药）。建议申请人使用传代次数较少的宿主细胞进行研究。

药物的有效浓度与作用机制研究的数据应一致，如果药物抑制病毒复制所需的浓度低于根据假定的作用机制计算出的生化数据，则提示可能还存在其他的作用位点或机制。当抗病毒活性数据与生化数据不一致时，可以通过耐药性分析证明药物在体内的作用机制。对于核苷或核苷酸类似物，建议在细胞的稳定期及分裂期测定药物活性分子的三磷酸盐的半衰期（t1/2）。

某些影响人类健康的病毒（如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等）目前尚无合适的细胞培养系统或动物模型。对于此类病毒，可以通过对亲缘关系很近的病毒关键功能和活性的抑制揭示药物的潜在抗病毒活性。如果目标病毒目前尚无合适的细胞培养系统或动物模型，而且药物的作用部位被认为位于细胞内、细胞内的药物浓度与生化研究中的结果一致时，确定抗病毒药物的活性部分能否进入细胞内尤为重要。目前用于研究乙型肝炎病毒（HBV）的细胞系和基于细胞的检测方法还非常有限。研究丙型肝炎病毒（HCV）进入、复制和感染的基于细胞的试验取得了一定进展，但还存在很多不足。

目前用于检测HBV复制的方法包括但不限于：

●通过生物化学试验测定HBV DNA聚合酶的活性。

●使用杆状病毒介导的转入或转染HBV基因组到人肝细胞株进行

细胞培养试验，然后用HBV DNA探针经Southern Blot定量分析检

测HBV cccDNA及RI-DNA等的形成。

●用含有HBV基因组（复制可调控或不可调控）的稳定转染细胞株

进行细胞培养试验。

●采用定量PCR法测量细胞外的HBV DNA。

对于HCV,目前有用于研究病毒进入（或受体）的假病毒系统（HCVpp）、研究病毒复制的复制子系统（Replicon）以及研究完整病毒复制周期的病毒感染系统（HCVcc），这些系统均可用于评价药物对HCV的抗病毒活性。遗憾的是HCVcc系统目前仅在2a亚型中取得成功。目前用于评价药物抗HCV活性的方法包括但不局限于：

●体外检测药物对病毒靶标蛋白（HCV RNA聚合酶、HCV丝氨酸

蛋白酶）的抑制活性。

●采用不同亚型复制子系统评价药物对不同亚型HCV复制的抑制

作用。通过报告基因检测病毒抗原的表达水平，或通过RT-PCR

检测HCV复制子细胞中HCV RNA的水平。

●在HCVcc系统中，通过检测病毒中报告基因编码产物（如荧光素

酶或绿色荧光蛋白等）的活性反映药物对病毒的抑制作用。也可

以通过RT-PCR检测HCV复制子细胞中HCV RNA的拷贝数，或定

量检测病毒抗原水平。

2.血清蛋白存在条件下的体外抗病毒活性

血清蛋白能与许多药物结合或螯合，从而影响药物的抗病毒活性。建议申请人详细考察药物是否能与血清蛋白显著结合。测定药物血清蛋白结合率的常用方法包括平衡透析法、超滤法以及基于荧光技术的高通量人血清白蛋白和α-酸性糖蛋白结合试验。如果药物的蛋白结合率较高，则建议申请人在加入系列人血清稀释液（如5%、10%、20%、40%）条件下测定药物的体外抗病毒活性。通过这些数据可以推算出药物在100%

人血清中的EC50，同时应报告血清校正后的EC50值。此外，建议申请人在含有生理浓度的α-酸性糖蛋白和人血清白蛋白的条件下测定药物的EC50值。

3.抑制指数

血浆药物浓度和细胞内药物浓度对于评价抗病毒治疗的量效关系和

发生耐药的可能性非常重要，计算抑制指数（Inhibitory Quotient，IQ）

时也需要用到这些数据。抑制指数（IQ）等于C min除以血清校正后的EC50值。测定EC50值的更多信息可参阅第三部分（二）第1节-体外抗病毒活性。IQ值是一个综合药物的体内浓度和抗病毒活性的有用工具，也是描述药物的暴露程度与病毒对药物敏感性之间相互关系的一个指标。如果一种药物的IQ较高，则表明患者体内的药物能达到有效抑制病毒的浓度，可使耐药发生的概率降到最低。由于同一种剂量可能并不适用于所有的患者，所以IQ值也可以用于指导III期和IV期临床试验剂量的选择。

4.体内抗病毒活性

在体外抗病毒活性研究的基础上，可进一步通过动物感染模型来评价药物的抗病毒活性。动物模型的分析指标包括病毒感染后（需要有证据证明）动物发病率和死亡率、组织学检查、各时间点的病毒载量、在发生病毒反弹的动物体内耐药株的分离和鉴定、病毒抗原和抗体的定量检测、药代动力学数据以及症状（如神经系统症状、体重减少等）。

（三）细胞毒性及治疗指数

申请人应在临床试验前开展药物细胞毒性和治疗指数的研究。需要证明药物在体内可达到的浓度下具有抗病毒活性，同时该浓度的药物不会对细胞产生毒性作用。应排除测定的药物抗病毒活性是由于宿主细胞死亡所造

成的可能。这一点非常重要。

在细胞毒性试验中，应设臵抗病毒药物的浓度梯度，测定导致50%的宿主细胞死亡的浓度[参见第三部分（二）第1节-体外抗病毒活性]，即所研究药物的半数细胞毒性浓度，通常用CC50或CCIC50来表示。治疗指数或选择性指数（即CC50/EC50）则是药物的细胞毒性效应与抑制病毒复制效应的比值。理想的药物应具有最大的抗病毒活性，同时具有最小的细胞毒性（即具有较大的治疗指数）。

建议申请人对处于稳定期和分裂期的各种类型的、相关的人细胞和组织细胞进行CC50值的测定，确定药物对不同细胞周期、不同细胞类型或不同组织的潜在毒性。

由于某些抗病毒药物对骨髓有抑制作用，建议申请人采用细胞集落形成法评价某些药物（如核苷类似物）对人骨髓祖细胞生长的潜在影响。此外，某些药物也对负责正常细胞核DNA和线粒体DNA合成及修复的细胞DNA聚合酶具有潜在的抑制作用。申请人应测定抗病毒药物对细胞聚合酶的IC50，同时应证明药物对病毒靶点作用的特异性（与对细胞聚合酶的作用相比）。人体的DNA聚合酶γ负责线粒体DNA合成，人DNA聚合酶γ被抑制与线粒体功能缺损之间具有相关性，并会导致人体不良反应的发生。因此，考察某些药物（如核苷类似物）对人聚合酶γ活性的影响以及对线粒体的毒性作用（如乳酸的生成量，线粒体DNA含量、线粒体形态学，葡萄糖利用率）就显得非常重要。

（四）体外联合用药的活性分析

感染病毒的患者体内可能存在不同的病毒变异株，其中某些类型的病毒株可能对一种或多种抗病毒药物具有耐药性。因此，对于某些病毒

而言，同时给予多种抗病毒药物（如抗HIV-1的联合药物疗法）可能会比使用单一的药物产生并维持更好的抗病毒作用。但是不同药物之间的相互作用比较复杂，联合用药后可能导致药物的抗病毒活性出现相互拮抗、相加或者协同等作用。因此，申请人应在体外试验中评价药物与其他已上市的、治疗相同疾病药物之间联合用药的抗病毒活性。具体来说，应评价所研究药物与所有已上市的针对相同靶点的药物之间联合用药的抗病毒活性，对于已上市的治疗相同适应症的不同靶点的药物，应选择两种或两种以上进行此类研究。

建议申请人在开始评价联合用药疗效的临床试验前，先完成体外联合用药的活性研究。有时患者会混合感染两种或两种以上的病毒（如：HIV 与HBV或HCV共感染），因此，体外联合用药活性试验还应考察治疗同时感染不同种类病毒的药物与所研究药物合用的体外抗病毒活性。

（五）耐药性

1.体外耐药病毒株的选择

本指导原则主要关注病毒基因突变导致的病毒对特定的抗病毒药物的表型敏感性降低的耐药性。这里所说的耐药性并不是绝对耐药，而是一个相对的概念。建议在开始以感染特定病毒的患者为对象的临床试验前，先通过体外试验选择对药物耐药的病毒株，鉴定耐药株的表型和基因型，并进行交叉耐药性分析。尽管通过体外试验获得的耐药性数据可能并不能准确预测临床耐药性，但仍建议申请人通过体外耐药株选择试验评价目标病毒对药物产生耐药性的屏障，从而有助于临床试验的设计。

通过在细胞培养中选择对药物耐药的病毒株，可以了解耐药性产生遗传阈值的高低。遗传阈值低的药物可以选择仅含1或2个突变位点的

耐药株。而遗传阈值较高的药物则可能在病毒株中发生多处突变才产生耐药性。药物和目标病毒的许多因素可对耐药性产生影响，如药物浓度。突变株的出现速率取决于病毒复制速率、产生的病毒基因组的数量、复制机制的保真度以及宿主因素。对这些因素的了解有助于设计检测耐药株的体外试验。例如，如果需要发生多个突变方可对药物产生耐药性，则许多细胞培养系统提供的病毒滴度可能不足以用于选择耐药病毒。遇到这种情况时，可以在逐渐增加药物浓度的条件下使病毒在细胞培养中连续传代，这样可能会选择出耐药株。在评价耐药性的体外试验中，药物的浓度范围应覆盖其在人体内的预期浓度。选择对药物耐药的突变毒株的试验应在下列条件下重复进行：使用不同的野生株、使用不同的耐药株、高选择压力及低选择压力等，并确定不同的试验中产生的耐药性突变的类型是否相同，以评价药物浓度与耐药性遗传屏障之间的关系。

当采用细胞培养系统复制目标病毒时，可以采用下列两种基本方法选择对药物敏感性降低的病毒株：

●病毒以较高的MOI接种宿主细胞，在多种固定的药物浓度下分别

连续传代，诱导耐药株的产生。

●病毒以较低的MOI接种宿主细胞，病毒传代期间逐渐增加药物浓

度，起始药物浓度接近药物对亲代病毒的EC50。

采用合适的方法对病毒的复制进行监测，通过对选择期间分离株的基因型和表型的鉴定，检测耐药毒株的产生。

HCV对药物的耐药性可以通过HCV复制子系统进行考察。使用HCV复制子细胞筛选HCV耐药性的方法包括下列几种：

●在含新霉素的培养基中，多种固定的药物浓度下，以较低的密度

培养HCV复制子细胞。含有耐药性复制子的细胞将会形成集落，

应对其进行基因型和表型鉴定。

在不含新霉素的培养基中，多种固定的药物浓度下，进行HCV 复制子细胞传代。收集并保存每一代HCV复制子细胞，用于表

型和基因型鉴定。

2.基因型分析

针对体外试验中筛选出的耐药株进行基因型分析，确定可能导致病毒对药物敏感性降低的基因突变。针对病毒基因组中的相关部分进行DNA序列分析，鉴定耐药相关突变，这有利于预测临床疗效，并且可以为阐述药物的作用机制提供证据。应测定编码目标蛋白的完整基因序列，对于导致病毒对所研究药物耐药的突变类型和导致病毒对其他同类药物耐药的突变类型进行比较。对于较大的病毒（如疱疹病毒、痘病毒），应对其基因组中与所研究药物作用靶点相关的部分进行测序，并分析其中所含的与耐药性产生相关的突变。建议在几种遗传背景（如毒株、亚型、基因型）中鉴定耐药性产生的通路；通过选择程序获得的毒株如果同时出现了多种突变，则应该鉴定各种突变出现的先后顺序。

进行基因型分析时，鼓励申请人注明测序引物的序列，并说明这些引物可扩增出目标基因的碱基数。还应说明用于检测少数病毒亚群的基因型检测方法的灵敏度。阐明该突变在基因型分析中的比例和种类是十分重要的。

3.表型分析

表型分析用于确定变异株对药物的敏感性是否降低。通过基因型分析鉴定出与耐药性产生可能相关的突变后，如有可能，则应在重组病毒

系统（即：使用定点突变技术，PCR扩增突变片段并导入实验室标准株或使用其他适合的系统）中评价每一种突变导致表型耐药的能力。通过体外试验测定重组病毒对药物的敏感性，并确定EC50值。计算突变株与对照株（生物学特性明确的野生型实验室株）的EC50值之比（EC50值增加的倍数）。

任何标准的病毒学试验方法都可用于计算病毒的表型耐药的变化（如病毒相关蛋白检测、PCR检测病毒DNA或RNA、细胞病变检测、MTT法检测细胞毒性、报告基因表达检测等）。通过测定突变株的EC50值，并与在相同条件下同时测得的对照株的EC50值进行比较，计算突变株敏感性的变化（耐药性倍数的变化）。由于试验中测得的EC50值比EC90或EC95值更精确，应优先使用EC50值。表型检测方法的选择取决于其灵敏度，即检测耐药株较对照株的敏感性变化（耐药性的倍数）的能力。计算耐药性的倍数（耐药株的EC50值/参比株的EC50值）时，要求表型检测方法之间具有可比性。

4.交叉耐药性

使用针对相同靶点的抗病毒药物治疗时，对某一种药物敏感性降低的变异，同时也可能会对相同靶点的其他药物的敏感性降低或丧失，这种现象称为交叉耐药。交叉耐药并不一定是可以类推的，因此评价所有可能性非常重要。例如，如果病毒X对A药和B药耐药，而病毒Y也对A药耐药，但病毒Y可能仍对B药敏感。建议通过表型分析评价所研究药物对同类的已上市药物的耐药毒株的有效性，同时评价同类已上市药物对所研究药物的耐药毒株的有效性。此外，如果药物的作用靶点相同，但结构类型不同[例如，核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非核

苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs），其作用的靶点都是HIV的逆转录酶]，则建议对不同类型的药物进行交叉耐药性分析。建议检测多种耐药株和临床分离病毒株对所研究药物的表型敏感性（范围应能代表已知可导致病毒对同类型药物的敏感性降低的不同突变和突变的组合）。如果表型检测是在病毒感染细胞系中进行的，则应该使用临床分离病毒株对EC50值进行校验。

四、针对耐药性产生的监测

应帮助医生及患者了解抗病毒药物的耐药性信息，以协助其做出最佳的治疗决策。除此之外，临床试验方案设计和药物研发计划通常与药物的耐药性和交叉耐药性情况密切相关。因此，强烈建议申请人根据药物预期在临床上应用的实际情况，在药物研发的各期临床试验中进行全面的耐药性监测。

对于某些病毒，病毒载量的变化可作为判定抗病毒药物临床疗效的终点指标。在这种情况下，可以用测定病毒载量的方法进行耐药性监测。基因型和表型检测是考察耐药病毒株是否出现的基础，还有可能表明病毒的耐药性与临床病毒学失败之间的关系。此外，表型和基因型检测结果还可用于指导治疗方法的选择，或预测药物在某一患者个体的疗效。对治疗失败或发生了病毒反弹的患者中分离到的病毒株进行基因型检测可以发现导致病毒对所研究药物敏感性降低的基因突变。此外，进行基线基因型和表型分析，可以根据基线病毒株的突变和多态性及表型敏感性判断治疗结果。如果病毒载量未被作为主要终点指标，则建立检测病毒载量的方法以及监测病毒耐药性的出现对于分析病毒学指标与临床结果之间的关系将非常重要，而且有助于完善拟进行的临床试验的设计。

建议申请人在开始以病毒感染的患者为对象的临床试验前，首先制订耐药性监测计划，并作为临床试验方案的一部分。耐药性监测计划应至少包含下列内容：

●描述检测病毒载量的试验方法

●病毒载量检测方法及操作特点

●拟采用的基因型和表型耐药性检测方法、步骤和操作特点

●样本采集和保存的方法

●样本的处理和运输方法（冷冻或常温)

●拟进行的其他耐药性分析

●采集用于检测病毒载量、基因型和表型以及其他耐药性分析样本

的时间点（如基线、第24周、第48周、治疗失败或中止试验后）建议申请人在药物研发的早期阶段即制订基因型和表型耐药的基线研究以及有关耐药性子课题的计划。申请人应及时完成有关基线耐药和治疗后分离病毒株的基因型和表型分析，以便明确所研究药物的耐药性特征以及与其他药物的交叉耐药情况。对于HBV和HCV等病毒，监测基线和治疗后病毒的基因型耐药对评估耐药突变的发生至关重要。通过比较分析治疗失败患者的样本和基线样本基因型，可以发现与耐药性相关的突变。试验方案中应明确说明病毒学失败和中止研究的定义。

对于以经治患者为对象的临床试验，强烈建议申请人收集全部患者研究初始的基线分离病毒株的表型和基因型数据，同时收集所有病毒学失败和退出研究（病毒复制未得到抑制）等终点时的表型和基因型数据。并注意应在患者仍在服用所研究药物时完成样本采集。

在以初治患者为对象的临床试验中，应设法获得来自于所有病毒学

失败和中止研究（病毒复制尚未得到抑制）的患者的基线分离病毒株和终点分离病毒株的表型和基因型数据。在以未接受过治疗的患者为对象的研究中，应收集并保存所有患者的基线时的生物样本，以备在病毒学失败时进行表型和基因型分析。

根据临床试验方案或研究人群的具体情况，有时可能需要进行额外的基因型和表型评价或亚组分析，因此在临床试验的各个阶段（基线及治疗阶段）采集并保存样本是非常必要的。申请人有时会提出当体外数据提示病毒在单一突变后导致高度表型耐药时，在基线和病毒学失败时收集初治患者亚组的样本。对这样的研究方案事先应进行讨论。

申请人可以选择自己进行病毒载量的检测和表型及基因型耐药性分析，也可以将生物样本委托给其他有资质的实验室进行检测。实验室样品的处理应按照合适的操作程序进行。如果某项试验未按照生产厂家的技术规范操作，则该试验的结果可能不会被接受。鼓励申请人使用经过鉴定和验证的试验方法。如果使用的检测方法属于研究性的，则建议申请人提供该检测方法的操作特性参数（如准确性、精密度、检测限及定量限、特异性、线性、检测范围、耐受性、稳定性），同时应描述病毒来源（如血液、血浆）、保存条件及稳定性、细胞培养程序。与用于鉴定药物的抗病毒活性及耐药性的探索性检测方法相比，临床实践中使用的检测方法需要经过更加全面的验证。研究者使用的常规商业检测方法应该经过鉴定，但可能不需要提供方法学参数。申请人应就某一检测方法需要校验的次数和性质以及相关的方法学参数[如数据主控文档（DMF）]与审评人员进行讨论。建议申请人在III期临床试验中进行特定的分析或测量时使用一致的检测方法，对特定患者的分析检测方法应在试验期间

保持不变。如果在药物研发期间使用了任何新的检测方法，应提供支持这种新检测方法的相关数据。

五、病毒学研究报告

完整的病毒学研究报告内容比较广泛，应包含原始数据和相关衍生数据、获得数据的程序和评价数据所需的信息。病毒学研究报告中应包含药物的非临床研究及临床抗病毒活性信息、接受过治疗的患者的耐药信息、与同类药物的交叉耐药的信息、基线基因型和表型病毒学应答分析。

病毒学研究报告的格式通常应包含下列部分：概要、引言、材料与方法、结果及讨论。在方法部分应描述使用的全部试验方法，同时应对使用的统计分析方法进行描述。

六、总结

本指导原则介绍了抗病毒药物研发和申请审评相关的病毒学研究项目，目的在于使对抗病毒药物的分析更加全面。这种分析有助于提供支持药物应用于人体的数据，同时还有助于确定量效关系、设计临床试验、选择合适的患者人群。因此，这些研究数据会对药物的治疗成功率产生影响。

体外非临床病毒学研究能为体内试验的设计提供有用的信息，而且有助于预测体内试验中耐药株的产生，所以在开始I期临床试验前须先进行非临床研究。开展以感染某种病毒的患者为研究对象的临床试验前，应详细分析体外试验中选择到的耐药病毒株。本指导原则还就如何及何时进行病毒学研究提出了建议。这些信息可以写入产品说明书中，以便临床医生正确开具抗病毒药物处方，同时使治疗成功率达到最大。

由于临床治疗的需求，抗病毒药的研发已成为新药开发的关注点。同时，病毒学研究的经验逐渐积累，研究水平亦在不断提高。建议申请人在开展抗病毒药物的病毒学研究时关注本指导原则中提及的要素，同时鼓励申请人就新药临床前和临床病毒学研究的相关问题与审评机构进行讨论和沟通。

参考文献

FDA. Guidance for industry: Antiviral Product Development — Conducting and Submitting Virology Studies to the Agency. 2006.6

病毒学复习题

一、填空题（共10题，每题1分） 1，病毒核衣壳主要由核酸芯髓及蛋白质外壳两部份构成。 2，构成病毒体的主要化学成分是__核酸__和_蛋白质_。 3，可将自身基因整合在宿主细胞基因上的病毒主要有_逆转录病毒、乙型肝炎病毒、疱疹病毒。 4，鉴别病毒是否具有包膜，通常可采用_脂溶剂。 5，病毒的繁殖方式为__复制_，病毒在细胞内的增殖导致细胞的病理变化称为_致细胞病变效应（CPE）_。 6，病毒的穿入方式主要有_包膜和细胞膜融和病毒胞饮两种。 7，无包膜病毒体多数通过_细胞裂解_释放，有包膜病毒体主要通过_出芽_方式 释放。 8，病毒合成的蛋白质主要包括_结构蛋白和功能蛋白_两类 9，干扰素的主要功能有_抗病毒、抗肿瘤、免疫调节。 10，正链RNA病毒的RNA可直接作为_ mRNA _，在细胞的_核糖体上转译病毒 蛋白质。 二、正误判断题（共10题，每题1分） 1．多联苗是由不同血清型的同种病原微生物混合制成的。（错） 2，λ噬菌体和PI噬菌体都是温和噬菌体。（对） 3，DNA病毒以双联为多，而RNA病毒以单链为多。（对） 4，逆转录病毒RNA可以反转录为DNA。（对） 5，腺病毒是典型的20面体对称的病毒，其病毒粒子具有12个五邻体和240个六邻体。（对） 6，负链RNA病毒是指其病毒粒子中所携带核酸序列与mRNA序列一致的病毒。 （否） 7，温和噬菌体侵入寄主细胞后，始终不裂解寄主细胞。（否） 8，病毒都能通过细菌滤器。（是） 9，所有病毒在侵入寄主细胞后，在进行转录、复制前，其病毒核酸都以游离状 态存在于细胞中。（否） 10，逆转录病毒的+RNA分子具有侵染性。（否） 三、单项选择题（共10题，每题1分） 1，牛病毒性腹泻病毒与 A具有抗原交叉反应性。 A猪瘟病毒、B犬细小病毒、C麻疹病毒、D马立克氏病病毒 2，目前已知病毒5种核酸类型是A A. DNA、+DNA、 RNA、+RNA、－RNA； B. DNA、+DNA、－DNA、 RNA、＋RNA； C. DNA、+DNA、－DNA、 RNA、－RNA；

病毒学复习题

填空题 1. 冠状病毒是_有包膜___的RNA病毒，呈皇冠状，其__单股正链__RNA约由30000多个碱基组成，为已知最大的RNA病毒。 2. __严重急性呼吸道综合症__（ Severe acute respiratory syndrome, SARS）在我国又被称为传染性非典型肺炎。 3. SARS冠状病毒包膜主要包括三种糖蛋白，分别为__S蛋白__、__M蛋白__ 和 E 蛋白。N 4. 病毒的大小以__nm___为单位量度刺突蛋白、膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白 5. 病毒含有的核酸通常是_DNA或RNA__ 6. 最先提纯的结晶病毒是__烟草花叶病毒__ 7. 病毒囊膜的组成成分是_脂类_ 8. RNA病毒突变率远高于DNA病毒，主要原因是_DNA是双链闭合环状结构较RNA单链线状比较稳定__ 9. 跨膜蛋白通过特定的_折叠__和_弯曲__方式，实现分子的跨生物膜的运输。 10._____受体___决定病毒的宿主谱以及其感染某种动物的能力。 11. ___允许细胞__指对病毒的增殖复制具有支持作用的细胞。 12. 大部分RNA病毒的基因组为__单一组分___ 13. RNA病毒启始RNA合成的两种机制为__de novo __启始和引物依赖启始。 11

14. 反转录酶具有四种不同的催化活性：RNA指导的或DNA指导的DNA多聚酶活性、DNA解旋活性和__ RNase H __活性。 15. 真核细胞基因的转录是由三种RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)来分别完成的，只有RNA聚合酶__Ⅱ__能转录生成mRNA。 16. mRNA输出的底物是由RNA与__蛋白质__共同组成的核蛋白。组蛋白、精蛋白等碱性蛋白 17.大多数有包膜病毒通过__出芽__方式释放病毒粒子。 18. 绝大多数病毒只能感染某些特定类型的细胞、组织和器官，这种特性称为病毒的_组织亲嗜___性。 19.受体介导的凋亡途径主要激活Caspase-8，线粒体介导的凋亡途径主要激活__ Caspase-9__，二者都激活__ Caspase-3__ 。 20. HIV的__env __ 基因所编码病毒包膜蛋白gag，核心蛋白；pol，酶 21. HIV感染靶细胞的第一步就是位于表面的__gp120__与靶细胞受体相结合。 22. 流感病毒结构自外而内可分为包膜、_核衣壳__以及核心三部分。 23. 流感病毒的包膜中除了磷脂分子之外，还有两种非常重要的糖蛋白：___基质蛋白___和___糖蛋白突起___。 24. “H1N1”是病毒名称的缩写，其“H”指的是__血凝素___、而“N”指的是__神经氨酸酶___。 25._机体细胞免疫应答__是HBV肝损伤的主要病理机制。HBV免疫介导肝损伤机制主要有固有免疫、T细胞免疫、与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 26. IFN通过两种机制发挥抗病毒作用：直接抗病毒作用和__抑制病毒的复制__。 22

病毒学的几个概念：PFUMOITCID50

*** *** 病毒学的几个概念：PFU MOI TCID50 PFU:plaque forming unit ，空斑形成单位。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml 。由于测定pfu 往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50 方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50 法。 MOI :multiplicity of infection ，感染复数。传统的MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。 其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu 。一般认为MOI 是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell 。后来MOI 被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量 的比值。 然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI 产生了不同的含义。能产生细 胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu 表示病毒数量，因此其MOI 的含义与传统的概念相同。 传统意义上的MOI 的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson 分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI ）。其公式为： P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP （0）。 其中： P 为被感染细胞的百分率 P(0) 为未被感染细胞的百分率 m 为MOI 值 例如，如果要感染培养皿中99% 的培养细胞，则： P(0) = 1% = 0.01 m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell 。 TCID50 Protocol ： 1：制备96 孔板单层细胞 2：将病毒做系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复 3 孔 3：每日观察细胞病变，记录高于50 和低于50％病变孔的病毒稀释度， 4：计算比距，获得TCID50 计算比距： （高于50％的病变率－50％）/（高于50％病变率－小于50％病变率）＝比距； 比距与接近50% 病变率的病毒的稀释度的指数相加，就获得了指数。 比如：比色计算或者显微镜观察病毒的TCID50 在10 的负7 和8 次方之间，那么，指数－8 与比距相加，获得的新的指数，就是TCID50 的指数，TCID50=10 的-7.几次方 TCID50 与PFU 换算: PFUs＝0.7 ×TCID50 的滴度

病毒学试题(回忆版)

一、名词解释： 1. spike 2. DI(defective interfering) 3. Replication intermediate (RI) 4. Plague（噬斑） 5. PFU（噬斑形成单位）、CPE（细胞病变）、隐蔽期 6、信息体（informosome） 7、温度敏感性变异株连 8、抗原漂移与抗原转变 9 准种10、互补11、细胞原癌基因12、干扰素 13、Ribozyme 14、DNA疫苗15单克隆抗体 16法氏囊，网状内皮组织增殖症等（传染病英文翻译成中文） 二、简答题： 1、慢病毒感染的概念及原因（两个方面即病毒方面与机体方面） 2、病毒载体活疫苗的概念并举例说明病毒载体构建的技术路线 3、亚病毒的分类及其定义 4、病毒的特性及其疫苗的研究进展（病毒学） 5、病毒的吸附和侵入过程（分两步）（病毒学） 6、请设计试验方案，如何证明某一种病毒的核酸具有感染性（病毒学） 7、简述病毒对细胞的损害作用方式（病毒学） 8、叙述新病毒出现的机制（病毒学） 9、叙述反转录病毒的复制步骤（病毒学） 10、有几个是写出病毒的英文名称让写出分别属哪科、哪属（不常见的几个） 11、如果一牛场发生布氏杆菌，请制定免疫计划（传染病）？ 12、假如发生烈性传染病如何做？（传染病） 三、论述题

1、详细叙述禽流感病毒的基因组结构，并写出每段基因组所编码的蛋白及其每 种蛋白的功能（病毒学） 2、详细叙述SARS病毒与禽流感病毒在分子水平上的异同（传染病）。 2003年农科院考博题 动物病毒学 一、名词解释 1 DI 2 Antigentic drift 3 感染性cDNA 4 核酸疫苗 5 PFU 6 Ribozyme 7 LTR 8 温度敏感突变株 9 envelope 10 准种 二、简答题 1 类病毒与朊病毒的区别。 2 鉴定新城疫病毒毒力的依据。 3 病毒血凝、血凝抑制作用及血吸附机理。 4 写出下列各科病毒的一种病毒 Herpesviridae, Adenoviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae 5 黄病毒科有几个属，各写出一个病毒。 6 OIE高致病力禽流感病毒的特征。 7 J亚群白血病病毒的致病特点。 三、问答题 1 动物病毒的分离与鉴定过程。 2 以某动物病毒为例，论述研究病毒的分子致病机理的技术路线。 传染病试题可能与中国农大相同 2003年中国农业大学考博试题 微生物试题 1 名词解释： prion 感染性核酸回复突变CTL MAC 合胞体溶原化重组抗体cytokine 2 简答： 缺损病毒微RNA病毒属共有几个科，各种的代表病毒 动脉炎病毒属蛋白特性内源性抗原 胞内菌相关的细胞内免疫抗体产生的动力学 3 论述 阻断ELISA的原理，技术路线，操作，判定 分子生物学诊断技术 外源性抗原的加工过程 2003传染病试题 1 进口动物时应如何做 2 鸡呼吸道疾病的区别 3 子猪肠道疾病的病变 4 非典型猪瘟的控制 5 猪伪狂犬病的种猪场净化 6 从传染病流行的三因素，论述防治措施

抗病毒治疗应答相关名词解释

附2、抗病毒治疗应答相关名词解释：术语和定义 1.病毒学应答(virological response)指血清HBV DNA检测不到(PCR 法)或低于检测下限（完全病毒学应答，complete virologic response)，或较基线下降≥2 log IU/mL（部分病毒学应答，partial virologic response)。 2.血清学应答(serological response)指血清HBeAg转阴或HBeAg血清学转换，或HBsAg 转阴或HBsAg 血清学转换。 3.生化学应答(biochemical response)指血清ALT 和AST 恢复正常。 4.组织学应答(histological response)指肝脏组织学炎症坏死或纤维化程度改善达到某一规定值。 5.原发性治疗失败(primary treatment failure)在依从性良好的情况下，用核苷（酸）类似物治疗6 个月时HBV-DNA 下降小于2 log IU/mL。 6.病毒学突破(virological breakthrough)在未更改治疗的情况下，HBV DNA 水平比治疗的中最低点上升1log值，或一度转阴后又转为阳性，可有或无ALT 升高。 7.生化学突破(biochemical breakthrough)常发生在病毒学突破后，表现为ALT 或/和AST 复常后，在未更改治疗的情况下再度升高，但应排除由其他因素引起的ALT 和AST 升高。 8.维持应答(maintained response)在抗病毒治疗期间HBV DNA检测不到(PCR法) 或低于检测下限，或ALT正常。 9.治疗结束时应答(end-of-treatment response)治疗结束时的病毒学、血清学、生化学或组织学应答。 10.持续应答(sustained response)治疗结束后随访6 个月或 12个月以上，疗效维持不变，无复发。 11.复发(relapse)治疗结束时出现病毒学应答，但停药后 HBV DNA 重新升高或阳转，伴有ALT 和AST 升高，但应排除由其他因素引起的ALT 和AST升高。 12.耐药（Drug resistance）在抗病毒治疗过程中，检测到和HBV耐药相关的基因突变，称为基因型耐药（Genotypic resistance）。体外实验显示抗病毒药物敏感性降低、并和基因耐药相关，称为表型耐药（Phenotypic resistance）。针对一种抗病毒药物出现的耐药突变对另外一种或几种抗病毒药物也出现耐药，称为交叉耐药（Cross resistance）。

手性药物拆分的研究进展

手性药物拆分的研究进展 许多药物具有光学活性(opitical activeity)。一般显示光学活性的药物分子，其立体结构必定是手性(chirality)的，即具有不对称性。手性是指其分子立体结构和它的镜像彼此不能重合。互为镜像关系而又不能重合的一对分子结构称为对映体(enantiomer)。虽然对映异构体药物的理化性质基本相同，但由于药物分子所作用的受体或靶位是由氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白质和核酸大分子等，后者对与之结合的药物分子的空间立体构型有一定的要求。因此，对映异构体在动物体内往往呈现出药效学和药动学方面的差异。鉴于此，美国食品药品监督管理局规定，今后研制具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分结果，欧盟也提出了相应的要求。因此，手性拆分已成为药理学研究和制药工业迫切需要解决的问题。 目前，利用酶法、超临界流体色谱(SFC)法、化学法、高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法、毛细管电泳(capillary electrophoreisis，CE)法和分子烙印法拆分对映体，已成为新药研究和分析化学领域的重要课题。笔者在本文综述了近年来利用上述方法拆分手性药物的研究进展。 1酶法 酶的活性中心是一个不对称结构，这种结构有利于识别消旋体。在一定条件下，酶只能催化消旋体中的一个对映体发生反应而成为不同的化合物，从而使两个对映体分开。该法拆分手性药物已有较久的历史，反应产物的对映过剩百分率可达100％。酶催化的反应大多在温和的条件下进行，温度通常在0～50℃，pH 值接近7.0。由于酶无毒、易降解、不会造成环境污染，适于大规模生产。酶固定化技术、多相反应器等新技术的日趋成熟，大大促进了酶拆分技术的发展。脂肪酶、酯酶、蛋白酶、转氨酶等多种酶已用于外消旋体的拆分。脂肪酶是最早用于手性药物拆分的一类酶，是一类特殊的酯键水解酶，具有高度的选择性和立体专一性，反应条件温和，副反应少，适用于催化非水相递质中的化学反应，在B 一受体阻滞药、非甾体类抗炎药和其他多种药物的手性拆分中都有广泛的应用。意大利的Batlistel等用固定于载体Amberlite AD-7上的脂肪酶对萘普生的乙氧基乙酯进行酶法水解拆分，对温度、底物浓度和产物抑制等进行了研究，最后使用500 mL的柱式反应器，在连续进行了1200h的反应后，得到了l8kg的光学纯S-萘普生，且酶活性几乎无损失。另外，酯酶具有很高的工业价值，其应用前景也极为广阔。Jiaxin等利用pseudomaonas cepacia脂肪酶拆分了一类酰基取代的1．环己烯衍生物，通过酶催化酯交换反应，得到产率较高的光学纯化合物，且提供了反应过程监测方法。这种方法可推广到该类化合物系列衍生物的合成与拆分。 2 SFC法 根据手性选择剂种类不同，该分离方式主要包括氨基酸和酰氨类手性固定相、Prikle型手性固定相、环糊精型键合固定相如聚甲基异丁烯酯等。由于SFC 法尚处于发展阶段，各种参(如温度、压力、流动相的组成和密度等) 对分离度的影响机制还未完全清楚。SFC法具有简单、高效、易于变换操作条件等优点，已成为与HPLC法和GC法互补的拆分方法，因其具有独特的优越性，应用前景极为广阔。Nozal等用Chiralpak AD柱和Chiralcel OD柱在SFC条件下拆分了驱肠蠕虫药阿苯唑亚砜化合物，并研究了甲醇、乙醇、乙丙醇及乙腈等有机溶剂对立体构型的影响。结果表明，在以Chiralpak AD柱为固定相时，用2丙醇可以获得最好的拆分效果；而在Chiralcel OD柱上用甲醇效果最好。

兽医微生物学重要知识点汇总完整版

兽医微生物学重要知识 点汇总 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】

兽医微生物学重要知识点汇总 绪言 1、微生物学的定义：研究微生物形态、生理、遗传变异、生态分布以及其与人类关系的科学，广义的微生物学还包括免疫学，甚至还包括寄生虫学，特别是原虫学。 2、微生物的特点：①个体微小，需借助显微镜观察，其群体可见。②结构简单，繁殖快，分布广。③比较面积大（有利于物质交换，代谢繁殖）。④易变异，适应性强。 3、微生物的种类：三型八大类(三菌四体一病毒) 真菌细胞型：细胞核有核膜、核仁，细胞器完整。Eg:真菌。 原核细胞型：仅有原始核，无核仁、核膜，细胞器很不完善。DNA和RNA同时存在（拟核/核体）Eg：细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。 非细胞型微生物：最小的一类微生物，无典型细胞结构。只能在活细胞内生长繁殖。核酸类型为DNA或RNA.Eg：病毒。 4、微生物学的发展过程 第一阶段——形态学时期：1683年荷兰吕文虎克首次观察到微生物。1861年巴斯德否定“自然发生说”；证明发酵由微生物引起的。 第二阶段——生理学及免疫学的奠基时期： Ⅰ巴斯德（微生物学、生理学与免疫学的主要奠基人）的历史性贡献：①酒是某种微生物的发酵产物②解决了酒的败坏问题③研究炭疽病、人的狂犬病，确定这些疾病由相应的微生物引起、微生物可以至弱作作预防传染病用，而且对至弱的途径做了示范性的试验④发明免疫学的预防接种⑤发明巴氏消毒法 Ⅱ科赫（建立微生物研究的基本操作技术和对病院细菌的研究，有突出贡献）功绩：①发明培养基并用于纯化微生物②发明染色观察、显微摄影③科赫法则④证实炭疽病原因--炭疽杆菌发现结核病源菌--结核杆菌 【科赫法则：①病原微生物应在同一疾病中查见，但在健康动物体内不存在②该病原菌能被分离培养得纯种③该纯培养物接种至易感动物，能产生同样的疾病④自人工感染的实验动物体内能再次分离培养得到相同的病原】 【免疫方法：注射、口服、点眼、滴鼻、气雾】 第三阶段——近代及现代微生物 理论上取得的成就极其应用价值：①进入真正意义上的基因工程时代②进行化学治疗腰肌和抗生素的研究③组织移植、免疫耐受的研究，抗原抗体反应在诊断及防治疾病上的应用技术上的重大创新及其应用价值①电子显微镜的应用②标记抗原或标记抗体的应用③细胞培养、空斑技术、蛋白质及核酸的提纯④核磁共振仪的使用⑤分子克隆、PCR（聚合酶链式反应）、DNA测试、基因组学及电子计算机等技术的应用 微生物学领域的三大进展：微生物遗传学、免疫学及病毒学 第1篇总论 第一章细菌的形态结构 【内容提要】

病毒学题库

选择题 1、下列那种病毒对高温耐受的是（） A、疱疹病毒 B、HIV C、猪瘟病毒 D疯牛病病毒 2、下列不是干扰素作用特点的是（） A、作用迅速 B、种属特异性 C、间接作用 D、窄谱性 3、下列哪种病毒免疫后产生的抗体可在体内长时间存在（） A、天花病毒 B、新城疫病毒 C、细小病毒 D、犬瘟热病毒 4、RNA病毒突变率远远高于DNA病毒原因是（） A、病毒增值快 B、病毒分子量小 C、RNA聚合酶缺乏校正活性 D、宿主和病毒无校对修正机制 5、感染病毒的细胞在细胞核和细胞浆内存在着可着色的斑块结构称：（） A、蚀斑 B、空斑 C、包涵体 D、异染颗粒 6、抗体病毒的中和作用主要是（） A、阻止病毒与靶细胞相互作用 B、抑制病毒生物合成 C、诱导干扰素产生 D、杀伤细胞内病毒 7、病毒感染宿主细胞后可出现(D) A、细胞死亡 B、细胞转化 C、包涵体形成 D、以上均对 8、干扰素抗病毒的机制是（） A、阻止病毒进入易感细胞 B、直接干扰病毒mRNA的转录 C、影响病毒的装配和抑制病毒的释放 D、诱导细胞产生抗病毒蛋白 9、诊断流感最常用的血清学检查方法是（） A、ELISA 试验 B、中和试验 C、血凝抑制试验 D、PCR试验 10、、目前已在全世界消灭的病毒是（） A、HBV B、HIV C、天花病毒 D、脊髓灰质炎病毒 11、用于测量病毒大小的单位是（） A、微米 B、毫米 C、纳米 D、厘米 12、病毒的增殖方式是（）

A、出芽 B、复制 C、二分裂 D、分枝 13、下列哪种现象属于病毒基因突变（） A、温度敏感性变异 B、交叉复活 C、表面混合 D、多重复活 14、下列病毒无包膜的是（） A、狂犬病病毒 B、腺病毒 C、疱疹病毒 D、流感病毒 15、干扰素的生物学活性不包括（） A、抑制病毒增值 B、抑制肿瘤细胞生长 C、使机体产生抗病毒中和抗体 D、免疫调节作用 16、无包膜病毒完整病毒体的是（） A、衣壳 B、壳粒 C、包膜 D、核衣壳 17、一种病毒所产生的衣壳或包膜包在另一种病毒基因组外，这种变异称为（） A、基因重组 B、突变 C、互补作用 D、表型混合 18、病毒复制完成的标志是（） A、病毒的释放 B、吸附 C、入侵 D、转录 19、病毒囊膜的组成成分是（）。 A、脂类 B、多糖 C、蛋白质 D、氨基酸 20、病毒含有的核酸通常是（）。 A、 DNA和RNA B、 DNA或RNA C、 DNA D、 RNA 21、决定病毒体感染细胞的关键物质是（）。 A、衣壳 B、包膜 C、核酸 D、刺突 22、细胞融合有利于病毒的（）。 A、吸附 B、脱壳 C、扩散 D、复制 23、有关病毒感染的描述正确的是（）。 A、病毒在人群个体间的相互传播为水平传播，主要经皮肤和粘膜传播 B、母亲将病毒传给其子女的感染为垂直传播 C、慢发病毒感染就是病毒的慢性感染 D、以上均对 24、干扰素抗病毒感染的机制是（）。

常规病毒学实验技术

常规病毒学实验技术 （一）病毒的培养 实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于： ①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验） ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 （一）条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。 （二）优点 组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。 （三）接种途径 1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚） 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1）方法一（造人工气室） ①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的 烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压， 使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的 小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。 2）方法二 ①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。 2．尿囊腔接种（10-11日龄） 用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）

毛细管电泳色谱在手性药物拆分中的应用

毛细管电泳色谱在手性药物拆分中的应用 摘要：毛细管电泳色谱法是手性药物拆分的重要方法之一，是一种高效、快速、简便的手性分离手段。该技术在药物对映体的拆分、定量方面发挥了重要作用。近年来，手性药物的毛细管电泳拆分技术得到快速发展，本文参阅了国内外相关文献，对毛细管电泳技术的手性拆分模式及主要手性选择剂作了简单介绍，并介绍了一些新的手性选择剂在手性药物拆分中的应用。 关键词：毛细管电泳手性试剂手性拆分

The Application of Capillary Electrophoresis in Chiral Drug Separation Abstract:Capillary Electrophoresis is one of the crucial methods in chiral drug analysis. It is an important method with highly efficient, rapid and convenient features. This technology plays a crucial role in enantiomeric separation and quantitative analysis. In recent years, the application of capillary electrophoresis in chiral drug analysis has been developing rapidly. According to recent references, this paper makes a brief discription about the application of capillary electrophoresis in chiral drug separation. Keywords: Capillary electrophoresis; Chiral reagent; Chiral separation; 引言 手性是自然界的基本属性，也是生命系统最重要的属性之一，比如蛋白质、氨基酸、多糖、核酸、酶等生命活动重要基础物质都是手性的。据统计，在研发1200种新药中，有820种是手性的，占世界新药开发的68 %以上[1]，而用于治疗的手性化合物中约88 %为外消旋体，作为单一对映体用药的只占手性药物的11%左右[2]。手性药物的立体结构与其生物活性有着密切的关系。药物在吸收、分布、代谢与排泄过程中，通过与体内大分子的不同立体结合，产生不同的药理作用和不良反应。如著名的“反应停事件”，沙利度胺只有( S ) -对映体具有致畸作用，( R ) -对映体具有镇静作用而无致畸作用。 目前，手性药物的拆分方法主要有经典结晶法、化学拆分法、生物拆分法、膜分离法、手性液-液拆分法和色谱法等[3, 4]，其中色谱法由于简便快捷、分离效

(整理)兽医传染病试验.

实验二病料的采集、保存及送检 一、目的掌握被检病料的采取、保存、送检的方法。 二、材料实验动物（鸡）、瓷盘、剪子、镊子、酒精灯、酒精、接种环、载玻片、火柴棒等。 三、病料的采取 1.采取病料的基本原则 (1)采集最适病料理想的病料，应是无菌采取的含病原微生物量高的血液、器官组织或分泌物和排泄物。因此要根据疾病的病性采取合适的病料，如无法估计是何种疾病时，应根据临床症状和病理变化采集病料或全面采取病料。取材时应注意病原微生物感染所致疾病的类型(如呼吸道感染疾病、胃肠道感染疾病、皮肤和粘膜性疾病、败血性疾病等)、病原微生物的侵入部位、病原微生物感染的靶器官等。细菌检验病料应当是采自未经抗菌药物治疗的患病动物，并且应多做几张涂片。 (2)适时采集采集病料的时间一般在疾病流行早期、典型病急性期，此时病原微生物的检出率高；后期由于体内免疫力的产生，病原微生物减少，检测病原微生物比较困难，同时可能出现交叉感染，增加判断的困难性。在采集供抗体测定用的血清时，可适时地采集急性期和恢复期的两份血清样品，一般两份血清的间隔时间为14～2ld。内脏病料的采取，须于动物死后立即进行；夏季最迟不超过4～6h，冬天不超过24h，否则时间过长，由肠内侵入其他细菌，致使尸体腐败，有碍于病原菌的检出。供做切片的样品采取后必须立即投入固定液，否则时间过长，会使细菌和组织细胞死亡、溶解，影响检验结果。有条件做现场培养时，剖开尸体后应进行接种培养，然后采样，最后剖检。 (3)无菌操作采集病料所用的器械及容器要进行严格的消毒：刀、剪、镊子等金属用具可煮沸消毒30min，使用前最好用酒精擦拭，并在火焰上烧一下；器皿（玻制、陶制及珐琅制等）在高压灭菌器或干烤箱内灭菌；软木塞和橡皮塞应高压灭菌；载玻片用2%～5%碳酸钠煮沸消毒5～10min，煮沸后用清水冲洗干净，拭干保存或浸泡于95%酒精中以备使用；注射器和针头放于清洁水中煮沸30min即可，或用一次性注射器。病料采取过程都应该无菌操作，尽量避免杂菌污染。采取一种病料，使用一套器械，或器械酒精擦拭火焰灭菌后再采取另一种病料；一种病料放入一种容器，不可混放。 (4)剖前检查若有突然死亡或病因不明的尸体，须先采取末梢血液制成涂片，镜检，观察是否有炭疽杆菌存在。若疑似炭疽时，不得进行解剖；如需要剖检并获取病料时，应经上级有关部门同意，选择合适的场地，做好严格的防范工作，剖后要进行严格的消毒处理。只有在确定不是炭疽后，方可进行剖检。 2.病料采集的方法 （1）液体材料一般用灭菌棉拭子采取破溃的脓汁、鼻液、阴道分泌物与排泄物。未破的脓肿、胸水、腹水在皮肤表面消毒后，用无菌注射器抽取。 （2）血液无菌采取血液，供病原培养、抗体检测和血液检查之用。体型较大的单蹄和偶蹄类动物少量血样可以从耳背静脉采血；毛皮动物少量采血可通过耳壳外侧静脉

病毒学题库

病毒学题库 一.填空题（10分） 1.第一个提出病毒概念的是：贝杰林克（Martinus Beijerink）。（病毒学之父） 2.病毒的特点有：没有细胞结构、仅有一种类型的核酸、特殊的繁殖方式、缺乏完整的酶系统和能量合成系统，也没有核糖体、绝对的细胞内寄生。 3.病毒的对称性有：螺旋对称、二十面体对称、复合对称、复杂对称。 4.病毒的复制过程有：吸附、侵入、脱壳、病毒生物大分子的合成、装配和释放。 5.肝炎病毒有：甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。 6.昆虫病毒杀虫剂的缺点有：杀虫速度缓慢、病毒特异性强，寄主范围窄。 ★7.第一个发现病毒的人是：法国人Adolf Mayer 。 ★8.病毒的宿主有：微生物、植物、动物。 ★9.病毒的核酸类型有：双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）、双链RNA（dsRNA）、单链RNA（ssRNA）。 ★10.病毒突变体的种类有：条件致死突变体、蚀斑突变体、抗原突变体、共变体、适应新宿主突变体。 ★11.人畜共患的病毒有：流感病毒、狂犬病毒、朊病毒。 ★12.艾滋病病毒的主要传播途径有：性传播、血液传播、垂直传播。 ★13.昆虫病毒杀虫剂的优点有：对人畜（人体、畜禽、鱼虾等）安全无害，不会造成环境污染问题、病毒的宿主特异性高、昆虫病毒使用后效果明显。 二.判断改错题（少了大约11题左右，10对10错，共15分） 1.判断（描述）病毒的大小常用的单位是微米。（×，微米→nm或?） 2.病毒分类系统中“种”作为最小的分类单位。（√） 3.病毒的突变只是指自发突变。（×，病毒的突变可分为自发突变和诱发突变） 4.病毒的非增殖性感染有流产感染，限制性感染和潜伏感染。（√） 5.HIV核心为两条单链DNA构成的双体结构，并含有反转录酶。（×，DNA→RNA） 6.传染性非典型肺炎又称为严重急性呼吸综合症，是一种由冠状病毒感染所引起的急性呼吸道传染病。（√） 7.流感病毒的宿主限制性不是很严格，能跨越种属传播。（√） 8.流感病毒主要通过呼吸道传播，且病毒极易变异，往往造成世界性大流行，甚至爆发流行。（√） 9. 狂犬病只发生在犬和人身上，其他动物很少发生。（×，狂犬病病毒感染所有温血动物）★10.HBsAg阳性，乙肝。（） 三.名词解释（共5题，每题4分，共20分） 1.病毒基因重组：两种不同病毒感染同一细胞时，发生遗传物质（核酸）的交换，称为（病毒）基因重组，其子代称为重组体。 ★2.病毒隐码:描述病毒性质的一系列符号。包括核酸的类型、链数、分子量大小，病毒粒子的形状，宿主传播介质等。【有四对符号，包括核酸类型/核酸链数，核酸分子量（×106）/病毒粒子中含核酸的百分率，病毒粒子的外形/病毒被壳的外形，寄主种类/传播介体种类（或传播方式）】 3.缺损病毒：是指基因组上一个或多个病毒自我复制必需基因功能缺乏，它的复制需依赖其它病毒基因或基因组的辅助活性，否则在活的允许细胞内也不能完成复制。有些病毒因基因

病毒学复习题含答案

病毒学1-10 章复习题 一、填空题： 1、病毒的最基本结构是由_病毒核酸__和_病毒蛋白______ 构成，其辅助结构是_包膜及突起_______ 。 2、构成病毒体的主要化学成分是_核酸 ______ 和___蛋白质___。 3、病毒体结构由__髓核___ 和___衣壳___组成，又称为__核衣壳 ___ 。 4、病毒衣壳的对称形式有__螺旋对称_____ 、___二十面体对称___、___复合对称___。 5、病毒合成的蛋白质主要包括___结构蛋白 ____ 和___功能蛋白___两类。 6、通常将___mRNA___的碱基排列顺序规定为正链(+ RNA ), 其相应的___模板___链则为负链(- DNA ) 。 7、病毒复制周期中感染细胞的第一步是___吸附___，与隐蔽期有关的是__生物合成____ 。 8、病毒的增殖方式是__复制____ ，病毒在细胞内增殖导致的细胞病理变化称为__致细胞病变效应________ 。 10、病毒合成的蛋白质主要包括___结构蛋白_____ 和___功能蛋白___两类。 11、无包膜病毒体多数通过___细胞裂解___释放，有包膜病毒体主要通过___出芽___方式释放。 12、病毒的复制周期包括__吸附_____ 、__侵入____ 、___脱壳___、___生物合成___和___组织释放___五个阶段。 13、动物病毒的侵入主要通过___注射式侵入___、___细胞内吞___、___膜融合___和___直接侵入___四种方式。 14、病毒进化的基础包括___突变___、___重组___、___重排___和___基因重复___。 15、病毒的持续性感染包括___慢性感染___、___潜伏感染___和___慢发病毒感染___三种，水痘- 带状疱疹病毒可发生__潜伏________感染，而亚急性硬化性全脑炎则属于___慢发病毒___感染。 16、从细胞受到凋亡诱导因素的作用到细胞死亡大致可分为__凋亡的信号转导___、__凋亡基因激活___、__凋亡的 执行___和__凋亡细胞的清除___四个阶段。 17、杆状病毒编码的两种抗细胞凋亡基因分别为__IAP 基因___和__p35 基因___。 18、IAP 家族蛋白的结构特征为__杆状病毒IAP 重复___和__环锌指结构___。 19、免疫应答分为B细胞介导的__体液免疫___和T细胞介导的___细胞免疫__。 20、病毒感染动物后会出现干扰现象，其主要原因是 _______ 诱导细胞产生了干扰素________ 。 21、病毒感染成功的基本条件包括__病毒的感染性___、__合适的感染途径______ 和___宿主机体的易感性___。 22、动物对病毒感染的免疫方式包括___特异性免疫___和___非特异性免疫___，其中__特异性免疫___又包括___体 液免疫___和___细胞免疫___。 23、干扰素诱导细胞产生的两种抗病毒翻译途径为___通过2' -5 '寡A合成酶和RNaseL降解病毒mRNA___和_ 借助蛋白激酶PKR阻断病毒蛋白翻译的起始_______ 。 二、选择题： 1、病毒囊膜的组成成分是A 。 A.脂类 B. 多糖 C. 蛋白质 2、病毒含有的核酸通常是__B___。 A. DNA 和RNA B. DNA 或RNA C. DNA D. RNA 3、对于病毒单链DNA而言，可直接作为转录模板的链是__B—。 A. 正链DNA B. 负链DNA C. 双义DNA 4、决定病毒体感染细胞的关键物质是__B___。 A.衣壳B .包膜C .核酸D .刺突E .核蛋白 5、病毒包膜的特点不包括__B___。 A.来源于宿主细胞 B ?镶嵌有细胞编码的蛋白 C ?可被脂溶剂溶解 D ?决定病毒感染细胞的宿主特异性 E.具有抗原性6、在溶源细胞中，原噬菌体以_C_状态存在于宿主细胞中。A 游离于细胞质中C 缺陷噬菌体D 插入寄主染色体 7、逆转录RNA病毒的基因组是_B. A.单倍体 B.双倍体 C.三倍体 8、细胞融合有利于病毒的__C A. 吸附 B. 脱壳 C. 扩散 D. 复制 E. 释放 9、RNA病毒突变率远高于DNA病毒，主要原因是_C. A 病毒分子量小 B 病毒增殖快 C 宿主和病毒无校对修正机制 10、子代病毒释放的途径中不包括__E

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病毒学题库 一.判断改错题（少了大约 11题左右，10对10错，共15分） 1. 判断（描述）病毒的大小常用的单位是微米。 （X,微米7 nm 或？） 2. 病毒分类系统中“种”作为最小的分类单位。 （V ） 3. 病毒的突变只是指自发突变。 （X,病毒的突变可分为自发突变和诱发突变） 4. 病毒的非增殖性感染有流产感染，限制性感染和潜伏感染。 （V ） 核心为两条单链DNA 构成的双体结构，并含有反转录酶。 （X, DNA 7 RNA 6. 传染性非典型肺炎又称为严重急性呼吸综合症， 是一种由冠状病毒感染所引起的急性呼吸 道传染病。（V ） 7. 流感病毒的宿主限制性不是很严格，能跨越种属传播。 8. 流感病毒主要通过呼吸道传播，且病毒极易变异， （V ） 9. 狂犬病只发生在犬和人身上，其他动物很少发生。 ★阳性，乙肝。（） 三.名词解释1（共5题，每题4分，共20分） 1. 病毒基因重组：两种不同病毒感染同一细胞时，发生遗传物质（核酸）的交换，称为（病 毒）基因重组， 其子代称为重组体。 ★ 2.病毒隐码：描述病毒性质的一系列符号。包括核酸的类型、 链数、分子量大小，病毒粒 子的形状，宿主传播介质等。 【有四对符号，包括核酸类型 /核酸链数，核酸分子量（X 106 ） /病毒粒子中含核酸的百分率，病毒粒子的外形 /病毒被壳的外形，寄主种类 /传播介体种类 （或传播方式）】 3. 缺损病毒：是指基因组上一个或多个病毒自我复制必需基因功能缺乏， 它的复制需依赖其 它病毒基因或基因组的辅助活性， 否则在活的允许细胞内也不能完成复制。 有些病毒因基因 一.填空题|（ 10分） 1. 第一个提出病毒概念的是： 贝杰林克（Martinus Bejerink ）。（病毒学之父） 2. 病毒的特点有： 没有细胞结构、仅有一种类型的核酸、特殊的繁殖方式、缺乏完 整的酶系统和能量合成系统，也没有核糖体 、绝对的细胞内寄生 。 3. 病毒的对称性有： 螺旋对称、二十面体对称、复合对称、复杂对称 。 4. 病毒的复制过程有： 吸附、侵入、脱壳、病毒生物大分子的合成、装配和释放。 5. 肝炎病毒有：甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊 型肝炎病毒。 6. 昆虫病毒杀虫剂的缺点有： ★ 7.第一个发现病毒的人是： ★ 8.病毒的宿主有：微生物 ★ 9.病毒的核酸类型有： 单链 RNA （ ssRNA ）。 ★ 10.病毒突变体的种类有： 适应新宿主突变体。 ★ 11.人畜共患的病毒有： ★ 12.艾滋病病毒的主要传播途径有： 性传播、血液传播、垂直传播。 ★ 13.昆虫病毒杀虫剂的优点有： 对人畜（人体、畜禽、鱼虾等）安全无害，不会造成环境 污染问题、病毒的宿主特异性高、昆虫病毒使用后效果明显 。 仅有一种类型的核酸 杀虫速度缓慢 病毒特异性强，寄主范围窄 。 法国人 Adolf Mayer 。 植物、动物。 双链 DN (dsDNA 、单链 DNA( ssDNA )、双链 RNA( dsRNA 、 条件致死突变体 蚀斑突变体、抗原突变体、共变体、 流感病毒、狂犬病毒、朊病毒。 （V ） 往往造成世界性大流行，甚至爆发流行。 （X,狂犬病病毒感染所有温血动物）

HBV基因型与恩替卡韦治疗的病毒学应答

HBV基因型与恩替卡韦治疗的病毒学应答 目的：探讨HBV基因型与恩替卡韦治疗后病毒学应答的关系。方法：56例入选CHB患者采用线性探针反向杂交法（INNO-LiPA）检测HBV基因型，给予恩替卡韦（0.5 mg/d）抗病毒治疗48周。比较治疗前后ALT复常率、HBeAg 血清转换率和HBV DNA载量的变化。结果：56例入选患者进行了HBV基因型检测，30例为B型，26例为C型。恩替卡韦治疗48周后，两组基因型感染者ALT复常率、HBeAg血清转换率和HBV DNA载量变化差异无统计学意义（P>0.05）。结论：恩替卡韦的抗HBV疗效与感染HBV基因型B型或C型无关。 标签：慢性乙型肝炎；恩替卡韦；HBV基因型；HBV DNA 近年来，慢性乙型肝炎（CHB）的抗病毒治疗发展很快。恩替卡韦作为新一代的一线抗HBV核苷类似物，具有较强的抗乙肝病毒活性及较低的耐药率。研究显示，慢型乙型肝炎疾病的进展、抗乙肝病毒治疗的疗效和耐药基因变异跟HBV基因型有密切关系[1-4]。HBV基因型是否也影响恩替卡韦抗乙肝病毒治疗的疗效，目前还不清楚，本研究对此进行了相关分析与探讨。 1 资料与方法 1.1 一般资料2008年9月-2011年9月在本院就诊的CHB患者56例，男36例，女20例，平均年龄（30±9）岁，均符合2000年西安会议制定的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准[5]，且筛选时血清HBV DNA定量均>106copies/ml，治疗前半年内未曾使用过抗HBV药物。 1.2 给药方法口服恩替卡韦（博路定，中美上海施贵宝制药有限公司生产） 0.5 mg，1次/d，共治疗48周。 1.3 观察指标入选患者治疗前及治疗满48周时分别检测肝功能（ALT）、HBV血清学标志物、血清HBV DNA定量。根据《慢性乙型肝炎防治指南》[6]，（1）生化学应答：ALT复常指ALT降至正常范围之内；（2）病毒学应答：HBV 阴转指HBV DNA低于检测下限，即0.05），见表1。 2.2 两组基因型感染者恩替卡韦抗病毒疗效的比较两组基因型感染者应用恩替卡韦治疗48周后，在ALT复常率、HBeAg血清转换率和HBV DNA载量的变化等方面比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。 3 讨论 目前HBV已发现有9个基因型，分别为A～I，在我国以C型和B型为主[7-8]。本研究对56例CHB患者治疗前血清采用线性探针反向杂交法（INNO-LiPA）进行HBV基因型检测，结果仅检测出B型（53.5%）和C型（46.4%），未发现其他基因型或混合基因型，说明本地区HBV感染的主要基因