PCR操作流程
PCR操作流程
（所有实验步骤均在冰上进行，实验试剂放置冰上，每个实验后均要换手套）
C57BL/6小鼠肺成纤维细胞1107个
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加1mlTRIzol
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颠倒混匀10下，室温放置5分钟
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预冷离心机，4 ℃离心，12000rmp，5min
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吸取上清至新的EP管
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加氯仿1/5体积（上清液体积的1/5）
↓
手压住EP管，剧烈震荡，室温5min
（不要说话，多戴口罩及手套）
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静置5min
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4 ℃，离心12000rmp，1
5 min
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转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇（约400-500μl），静置10min
↓
4 ℃，离心12000rmp，10min
↓
弃上清，取沉淀，加75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml
↓
4 ℃，离心12000rmp，5min
↓
弃上清，保留沉淀干燥约30分钟（不能完全干燥）
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溶于DEPC水中至20μl（10μl -20μl）
↓
测OD值
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准备100ul EP管，依次在管中加入：（50ul 反应体系）（逆转录DNA+扩增）
RNase-free water (provided) Variable
5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer 10ul
dNTP Mix (containing 10 mM of each dNTP) 2ul
5x Q-Solution 10ul
PPAR-γ上游引物0.6uM
PPAR-γ下游引物0.6 uM
QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2 ul
RNase inhibitor (optional) Variable（5-10 units/reaction）
Template RNA Variable（1 pg-2 μg/reaction）
（PCR 条件50℃30min，95℃15 min，94℃1 min，50-68℃1 min，72℃1 min）
进行25-40个循环，然后72℃10min
↓
50×TBE取2.5ml，取22.5ml纯水，取0.5g琼脂糖，倒入烧杯中
↓
封口膜封住烧杯口，封口膜上弄几个洞，放入微波炉中，中低火加入煮沸3次后取出
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冷却至60℃，加入2μLII型核酸染色剂（触碰液面加入，后轻轻晃动烧杯）
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趁热倒入电泳板上（动作慢），轻轻摇匀，插上梳子，避光30min
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配制电泳液：25 ml TBE+275ml纯水，配制好后倒入电泳槽中
↓
拔出琼脂板上梳子，将制备好的琼脂板放入电泳槽中
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1ul样品DNA＋1ul Loading Buffer+4ul纯水混匀后依次加入孔中
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6ul Marker加入孔中
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接上电源，电压110V，电流50mA进行电泳
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电泳约45分钟后，凝胶成像仪成象并保存结果
实用pcr流程表
临床PCR检验流程记录表 检验日期：检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名 使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。
1. 操作步骤： 1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV 强阳性对照+1管HCV临界阳性对照） 1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。 1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul. 1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。（注意： 不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。 1.2.556摄氏度温浴15分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。 1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。在室温下静置5分钟 （15-25摄氏度）。注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。 1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱 中。盖上盖子，6000*g离心1分钟。倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体） 1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分 钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。 1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分 钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。 1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1 分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。 1.2.1120000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。
1.PCR操作流程
PCR操作流程 1.从冰箱取出所需试剂、样品，放置在冰盒上，解冻试剂、样品，点动离心。 2.取所需数量小EP管（200 μl），按附录所示配制反应体系。 3.加完所有试剂和样品后，点动离心，去除管内气泡。 4.在PCR仪上设定合适参数，具体见仪器操作手册。参数设置完成后，将反 应管放入PCR仪内小EP管位，根据所用EP管调整热盖位置，盖紧上盖。 5.启动程序，做好记录。 6.完成后及时取出反应管，关闭仪器。 7.用0.5×TBE配制琼脂糖胶，100 V，电泳15-25 min，紫外灯下观察条带，必 要时拍照记录。 注意事项： 1.节约试剂，所有试剂使用前都应点动离心；若为探索条件或鉴定试验，推荐 25μl反应体系。 2.含酶试剂应尽量保持低温，从冰箱取出解冻后，应尽量放在冰盒里，每次吸 完后也应放回冰盒。 3.加试剂及样品应按顺序进行，模板应在最后加入；自加引物开始，每次吸样 前都必须更换吸头。 4.注意移液器正确使用，吸取或排出微量液体时，应注意保证吸取或加入量的 准确性。 5.加完所有试剂后去气泡应彻底。 6.及时记录仪器使用及状况。 7.琼脂糖胶浓度可根据目的条带大小做适当调整，具体见琼脂糖凝胶电泳操作 流程附录。
附：PCR常用反应体系 如所用试剂为Takara ExTaq/rTaq试剂，则反应体系如下（50 μl）： ddH2O35.5/34.5 μl 10*Buffer 5 μl 2.5mM dNTP S 4 μl 引物1 2 μl 引物2 2 μl Taq酶0.5 μl 模板1/2 μl 如所用试剂为Mix则反应体系如下（50 μl）： ddH2O20/19 μl 2*Mix25 μl 引物1 2 μl 引物2 2 μl 模板1/2 μl 注：反应体系可按比例调整；斜杠后的体系为菌液PCR体系；若使用Takara试剂，菌液PCR使用rTaq酶，其余样本使用ExTaq酶，反应中使用的其它试剂相同。
PCR实验室操作流程
乙型肝炎病毒(HBV DNA PCR ABI7300)检侧标准操作程序一、INFORMATIONFORTEST检测信息 二、ANALYTICALPRINCTPLE检测原理 聚台酶链式反应(PCR〕可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料。我们目前是使用TaqMan荧光探针的检测原理：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’一3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加（图一）。这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
三、操作步骤 （一）试剂配制 1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV-DNA检测试剂盒。查看外包装盒(包括生产批号、有效期)，无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及Taq酶(核对核酸提取液、HBVPCR反应液及Taq酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致)（图1），不一致则不可使用，需更换新的试剂。室温平衡20min，完全融化后2000rpm离心备用。 2、核酸提取液的分装 （1）取0.5ml离心管架置于超净工作台内(开机前用紫外线消毒30分钟)，用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离心管外壁，不能碰到管内壁)，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔行排，离心管个数为n(n=样本数+对照品+质控品)。完成后将镊子放回原位（图2）。
PCR操作流程
PCR操作流程 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、实验试剂与器材 模板DNA、L dNTP Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O PCR仪、移液枪、PCR板 四、实验步骤 1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液： 模板DNA 2μL 引物1 1μL 引物2 1μL dNTP μL MgCl2 2μL 10×buffer 2μL
菌落PCR实验步骤.doc
菌落PCR资料 PCR, 菌落, 资料 菌落PCR 菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。 操作方法： 1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号 2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟 3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低 5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以 我的做法是： 用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。 在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。 当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了 我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。 把PCR体系先加好，用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以上机P了，我每次都是这样，可能是最方便的方法了。 取200ul水，牙签挑菌，煮沸5‘，冰浴5’，12000rpm，取上清5ul做模版。其他的和普通pcr一样。 我们都是用过夜培养的菌液0.3ul（不要超过0.5ul）做模板，很简单的，其它都不变。先94度5min 裂解菌，最好5min后再加入taq酶。 是的，菌落PCR不难。。但是如果发现结果出现非特异带，在目的带位置有很弱的条带出现，最好再用液体培养后再做一次PCR,我就因为这个阴性结果折腾了1个月。。扩培后再作菌落PCR就得到阳性结果了。。 我是这样做的,取菌液60ul至ep管中,沸水中煮5min,离心,取其中上清1ul作模板,屡试不爽 拿牙签点一下菌落然后再体系里面涮一下就可以了 如果觉得不可靠，就索性接个种，摇个小管，然后取1ul作模板 模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩不出来，这种现象在质粒这种模板的PCR里面很多，你提出来的质粒不要忘记稀释
PCR各步骤的目的
P C R各步骤的目的 Prepared on 22 November 2020
PCR各步骤的目的 （一）预变性： 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 （三）用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taq DNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。
PCR实验室操作流程
乙型肝炎病毒（HBV DNA PCR ABI7300）检侧标准操作程序 飞INFORMATIONFORTE检测信息 二、ANALYTICALPRINCTP检测原理 聚台酶链式反应（PCR可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量PCF技术，是指在PCF反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料。我们目前是使用TaqMan荧光探针的检测原理：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCRT增时，Taq 酶的5' —3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加（图一）。这样就可以通过荧光 强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 3 ■- atwnch-ftr
三、操作步骤 （一）试剂配制 1、进入试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出 HBV-DNA 佥测试剂盒。查 看外包装盒（包括生产批号、有效期），无误后拆开试剂盒，取出核酸 提取液、反应液及Taq 酶（核对核酸提取液、HBVPC 反应液及Taq 酶 管上批号与试剂外包装盒批号是否一致）（图1）,不一致则不可使用， 需更换新的试剂。室温平衡20min ,完全融化后2000rpm 离心备用。 2、核酸提取液的分装 （1）取0.5ml 离心管架置于超净工作台内（开机前用紫外线消毒30 分钟），用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离 心管外壁，不能碰到管内壁），摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为 从上往下隔行排，离心管个数为n （n 二样本数+对照品+质控品）。完成 后将镊子放回原位（图 2）。 对 及 有 效 La i
pcr流程
RNA 的提取 TaKaRa Code：D9108A 1. RNAiso Plus的使用量情况如下。 2. 实验样品的研磨和匀浆。 A. 贴壁培养细胞 ①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。 ②每10 cm2生长的培养细胞中加入1 ml的RNAiso Plus，水平放置片刻，使裂解液均匀分 布于 细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥 离细胞）。 ③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④室温静置5分钟。 B. 悬浮培养细胞 ①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心2分钟，弃上清。 ②向每107个细胞中加入l～2 ml的RNAiso Plus。 ③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。④室温静置5分钟。 C. 动物组织、植物材料样品 ①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组 织，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。 ②对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的
样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Plus的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。 ③将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。 ④ 12,000 g 4℃离心5分钟。 ⑤小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 3. Total RNA的提取。 ①向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5分钟。 ② 12,000 g 4℃离心15分钟。 ③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色 蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 ④向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分 钟。 ⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 4. RNA沉淀的清洗。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。 5. RNA的溶解。 室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。 简易流程
PCR各步骤的目的
PCR各步骤的目的 （一）预变性： 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 （三）用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用t aqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。
PCR步骤
PCR实验步骤 一、总RNA提取（此处以提取悬浮细胞RNA为例） 准备：提前预冷低温离心机 1.取出细胞，把细胞转移到离心管中，1000r，离心5min。 2.小心倒掉上清，加入1ml trizol，吹打均匀至液体澄清且无细胞团块后，室温静止5min，然后把所有液体转移到1.5mlEP管中。 3.每1ml trizol加入0.2ml氯仿，向EP管加入氯仿，盖紧盖子，剧烈上下摇晃10s后，室温静止2min。 4.放入已预冷的离心机，4℃，12000rmp，离心10min。 5.离心后液体会分成三层，将上层水层转移到另一个1.5mlEP管中（约450ul），加入0.5ml异丙醇，混匀，静止10min。然后4℃，12000rmp，离心10min。 水层（含RNA） 蛋白质 有机层 6.小心倒掉液体，加入1ml预冷的75%乙醇，轻轻摇晃。然后4℃，12000rmp，离心10min。 7.用枪头尽可能除去液体，超净台内静在置干燥，待白色沉淀变为半透明状，立即加入RNA free水。 8.放入-80℃冰箱保存。、 二、反转录 准备:预热水浴箱（37℃及85℃）、枪头、EP管必须是PCR专用的
1、桌面喷洒酒精，取出一个200ul PCR管，按以下比例配制反转录体系（冰上操作）： H2O：2ul RNA：6ul Premix：2ul 总：10ul 2、将mix混匀，短暂离心，然后37℃水浴15min，85℃水浴10s。完毕后放到冰上待用。 三、PCR步骤 1、取出500ulEP管，分别依次加入： H2O：7.7ul 23.1 ul Primer F 0.4ul 1.2 ul Primer R 0.4ul ×3 1.2 ul 混匀后，短暂离心。 EX Taq：10ul 30 ul 模板cDNA 1.5ul 4.5ul 总：20ul 60ul 2、将上述配得的两管mix分别分装到3个200ul PCR管中，19ul/管。 3、放入PCR机中进行扩增， 条件： 8、扩增，将上诉的PCR管放入PCR机中进行扩增，扩增程序为：94℃,2min→98→72℃,10min→4℃ 重复N次
PCR扩增实验操作步骤
PCR扩增反应 一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。 变性 退火 延伸 图反应历程
二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂 三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序： 将RAPD反应试剂加入EP管中 轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子 打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性 及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂 时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚 体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理: 是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适2+等。反应时先聚合酶、MgdNTP溶液、耐热Taq DNA量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5'→3'方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA 在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA 模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显着短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA 都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个
PCR技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
聚合酶链式反应（P C R）原理 DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性- 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板- 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR技术分类（常用） （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 （2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 （3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导
反转录PCR-步骤和方法
反转录P C R-步骤和方 法 本页仅作为文档封面，使用时可以删除 This document is for reference only-rar21year.March
反转录PCR 科技名词定义 中文名称：反转录PCR 英文名称：reverse transcription PCR;RT-PCR 定义：扩增mRNA的一种实验技术。先将mRNA反转录成cDNA，然后再以 cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。 应用学科：遗传学（一级学科）；基因组学（二级学科） 以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录 一、反转录酶的选择 二、合成cDNA引物的选择 三、操作步骤 四、注意事项 RT-PCR反应原理 [1] 反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合
成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 编辑本段一、反转录酶的选择 1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 编辑本段二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
汇总RT-PCR详细步骤
实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳（定量） 实验二反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳 一、实验目的 学习并掌握总RNA的分离提取，检测质量以及定量的方法。 二、实验原理 细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％）。在pH 6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。 RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。 RNA的产量取决于组织或细胞的来源，但是，通常每毫克组织可获得4~7μg RNA，每106细胞可获得5~10μg RNA，提取的RNA A260/A280比值一般为1.8~2.0。 在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1）样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3）空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境； 实验介绍如何使用TRIzol来分离总RNA。TRIzol是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解。（注意：TRIzol 具有强烈腐蚀作用，小心操作。）
三、实验材料、试剂与器材 1、细胞（5х106Hela） 2、DEPC水溶液，PBS，TAE 3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯 4、TRIzol试剂购自Invitrogen 5、烧杯（1000，500，100，50ml若干），量筒（1000，500，250，50，20 ml若干），玻璃棒，药勺，试剂瓶，三角瓶。枪头（1000、200、20 ul），离心管(0.2ml、0.5ml PCR管,1.5ml、2ml、7ml离心管)，枪头盒。 四、实验步骤 1.RNA提取前的准备 1）、玻璃器皿，金属及耐250℃物品的处理： 于高温烘箱中干烤，180℃，5小时，干烤前均用锡箔纸密封器皿头部。 2）、塑料制品的处理： 0.05-0.1%的DEPC （焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜： ●必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5ml PCR管，必要时 应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）。 ●泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸密封杯口；尽 量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。 ●121℃，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA 活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。 ●DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。具强
Q-PCR实验步骤
Q-PCR实验步骤 ——测定沉积物中产甲烷菌的数量 （1）DNA提取 沉积物总DNA根据DNA提取试剂盒(MoBio, Carlsbad, CA)说明书来提取。 （2）目的片段PCR扩增 引物：mlas(5′ -GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3′) mcrA-rev(5′ -CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3′)； 扩增片段长度为409 bp。 以沉积物总DNA为模板，用甲烷菌特异性引物进行PCR反应。 PCR反应体系为（50μL）： 10×buffer（含Mg2+） 5μL dNTP（2.5mmol/L）4μL 上、下游引物（10μmol/L）1μL Ex Taq 酶（5U/μL）0.35μL DNA模板（10ng/μL）1μL ddH2O 37.65μL PCR循环参数：95°C预变性3min；接着30个循环为95°C变性30 s，55°C 低温退火45 s，72°C延伸30s；72°C延伸10min，4°C 保温。 （3）重组标准质粒的制备 按照琼脂糖凝胶DNA片段回收纯化试剂盒说明对PCR产物进行纯化、回收。 按照pMD 19-T载体试剂盒的说明书将纯化的PCR产物与pMD 19-T载体连接。 连接体系为：1.2μL 水，0.8μL PCR产物，0.35μL pMD 19-T载体，2.5μL Solution Ⅰ（注：按顺序添加，并在冰上操作），于16℃过夜反应（放PCR 仪上）。 转化：①把感受态细胞（E.coli Competent Cells）置于冰中融化； ②把25μL的感受态细胞移至灭菌处理的离心管内；
③加入用于转化的DNA（10ng以下）； ④冰中放置30min； ⑤42°C放置60s； ⑥冰中放置2-3min； ⑦加入37°C预温好的LB培养基250μL； ⑧37°C振荡培养1h（160-225rpm）； ⑨取适量涂布琼脂平板培养基（160μL）（先涂150μL Amp，干后用前涂80μL X-gal）； ⑩37°C过夜培养，直至可观察到菌落为止； 挑选单个白色菌斑至3mL 含Amp的LB培养基，37°C 摇菌培养，直至培养液变浑浊。 分别以原有PCR引物（mlas和mcrA-rev）和M13（M13R和M13F）引物对菌液进行扩增，根据扩增特异条带的位置鉴定阳性克隆，抽提两种引物扩增均为阳性的样品，按照质粒DNA 提取试剂盒的操作要求提取质粒DNA。 以M13为引物的PCR反应体系为（20μL）： 10×buffer 2μL Mg2+ 1.2μL dNTP 1.2μL 上、下游引物0.3μL R Taq 酶0.2μL DNA模板0.2μL ddH2O 14.6μL （4）实时荧光定量PCR：抽提PCR为阳性克隆的重组质粒DNA，测定其浓度（ng/μL），根据各质粒的分子量与质量浓度，计算成拷贝数，制得标准品。将标准品按10倍梯度稀释成105-109，用作模板在实时定量PCR仪上进行扩增，建立反映Ct值与质粒拷贝数浓度对应关系的定量标准曲线。按照试剂盒说明书建立反应体系和反应条件，自动采集荧光。 反应体系（20μL）：
PCR原理及过程
PCR技术原理、实验步骤和应用 来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA 重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
PCR反应程序
PCR反应程序 1．常规程序 将PCR 反应所需的成分配置完后，在PCR 仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA 充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持 30 秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1 分钟（扩增1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成DNA ，完成一个循环。重复这样的循环25～35 次，使扩增的DNA 片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min ，使产物延伸完整，4℃保存。 2．复性（退火）和延伸温度 复性的温度是PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR 。 3．反应时间 变性步骤一般使用30 秒钟，如果模板的G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb 用1 分钟来保证充足的时间。 4．循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105 数量级时，循环数通常为25～35 次。 平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。 5．PCR 反应液的配制 PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA 聚合酶。早期的PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。对于使用具3’-5’ 外切活性的高温DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A 管含模板、引物和dNTP ，以及调整体积的H2O ，B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。 按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。